Name: Mikroinjektion Wound Assay und In-vivo- Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in Drosophila Embryos. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T21:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Lernen Sie die Mikroinjektion-Wundassay-Methode zur Visualisierung epidermaler Wundreaktionsreporter in lebenden Drosophila-Embryonen. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Genexpressionsanalysen für Gewebereparaturstudien.

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Dieses Protokoll wurde in Zusammenarbeit mit der bisherigen Mitglieder des McGinnis Lab, Kim A. Mace und Joseph C. Pearson entwickelt. Wir danken den fortgesetzten Bemühungen der Bloomington Drosophila Stock Center für ihre Arbeit zu organisieren und zu verteilen wertvolle Bestände. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem National Institutes of Health (R01 und K12 GM077197 GM68524) und die Familie von Herbert Stern unterstützt. MTJ wird derzeit von Grant Number 5G12RR003060-26 aus dem National Center for Research Resources und Grant Number 8G12MD7603-27 aus dem Nationalen Institut für Minderheiten Gesundheit und Gesundheit Disparitäten unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des Nationalen Instituts für Minderheiten Gesundheit und Gesundheit Disparitäten oder den National Institutes of Health.

Die Drosophila embryonalen Wunde Protokoll kann in fünf Stufen zusammengefasst werden: (1) Embryonen, (2) Embryo-Vorbereitung (3) Embryo Verwundung, (4) Embryo Mikroinjektion, und (5) Embryo Fixation. 1. Embryonen <ol><li> Sammeln erwachsenen Fliegen, 2-3 Tage nach schlüpfende, 50 Frauen und 25 Männer mit einem Embryo Sammlung Käfig. </li><li> Legen Sie einen frischen Apfelsaft und Hefe-Agar Platte jeden Morgen für 3 Tage. Hinweise: Für die optimale Besamungs, Zyklus die Fliegen auf einem 12-Stunden-Tageszeitplan in einer 25 ° C-Inkubator (05.00 Lichter &quot;ON&quot; und 17.00 Uhr Lichter &quot;OFF&quot;), weibliche Fliegen reagieren auf Veränderungen in der Lichtzyklus und werden im Rahmen einer Umstellung von Lichtern &quot;ON&quot; leuchtet &quot;OFF&quot; 10,11 größere Mengen Eier abzulegen. </li><li> Am Nachmittag des Tag-3, legen Sie einen frischen Apfelsaft und Hefe-Agar-Platte auf den Käfig und sammeln Embryonen für 2 Stunden. Legen Sie eine neue Hefe-Platte auf den Käfig, und speichern Sie die2 h-Sammelplatte. </li><li> Speichern die Sammelplatte für weitere 14 h bei 25 ° C, um die Embryonen zu altern. Anmerkungen: Die Wundheilung kann in jeder Phase während der Drosophila-Entwicklung untersucht werden, die in diesem Papier beschrieben wundinduzierten Transkriptions Reporter haben eine optimale Aktivität zwischen den Stufen 15 bis 16 Dezember. Am späten Stufe 17 ist der Embryo zu alt, um einfach durchbohren die Reifung Kutikula und die Wunde Reportern effizient zu aktivieren oder zu erkennen wundinduzierten Transkription. Damit die Sammelzeit und die Verwundung Zeit, während der Spitzenlabor Stunden auftreten, folgen wir einen Zeitplan für die Embryo-Entnahme für 2 Stunden (16.00 bis 18.00 Uhr), den Austausch der Sammlung Platte mit einer neuen Platte um 18:00 Uhr, Alter der Sammelplatte bei 25 ° C für 14 h (über Nacht), und die Embryonen aufgewickelt um 08:00 Uhr (am nächsten Tag). </li></ol> 2. Embryo Vorbereitung Hinweise: Dieses Protokoll umfasst den Einsatz von vielen Werkzeuge und Gegenstände, die scharf sind oder von g gemachtMädchen. Behandeln Sie alle Kleie und Glasobjekte mit Vorsicht, um Verletzungen zu vermeiden. <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig Embryonen aus der Sammlung Platten mit einem Pinsel, indem 2-3 ml Wasser auf die Platte und wirbelnden. Bringen Sie Wasser und Embryonen von Platte zu Nylon Netz und Sammelrohr. </li><li> In 4-5 ml Bleichmittel auf die Kappe eines Kunststoff-Petrischale Platte und genießen Sie das Netz abgedeckt Ende der Sammelröhrchen, die die Embryonen in Bleichmittel für 2 min;, die die äußere Eierschale des Embryos entfernt. Manuell drehen Sie den Sammelröhrchen ein paar Mal Embryonen aus Verklumpung in der Bleich verhindern. Spülen mit Wasser Embryonen 10x und trocknen Sie das Netz abgedeckt Sammelröhrchen, die die dechorionated Embryonen auf einem Papiertuch. </li><li> Verwenden Sie eine Nadel, um Sezieren ~ 50 Embryonen aus Nylon-Mesh über zu einer Agar-Platte. Wir fügen grüne Lebensmittelfarbe auf die Agar-Platte, um den Kontrast und die Hilfe bei Embryo Ausrichtung hinzuzufügen. Unter einem Binokular, stellen zwei parallele Reihen von ~ 25 Embryonen, richten Sie die embryos auf der Folie, so daß sie im rechten Winkel zu der Punktionsnadel auf der Mikroinjektionsvorrichtung sein. Lassen Sie ein wenig Platz (ca. 1 Embryo Länge) zwischen den Embryonen für den Gasaustausch Zwecke. Die zwei parallelen Reihen sollte etwa 5 mm voneinander entfernt sein. </li><li> Legen Sie eine Folie mit doppelseitigem Klebeband auf der Oberseite der Embryonen ausgerichtet, und drücken Sie die Folie, um Embryonen, die von der grünen Platte auf den Schlitten übertragen sorgfältig. Dann Luft trocknen die Embryonen ~ 25 min bis Innendruck auf den Embryo zu reduzieren und zu verhindern, wenn ein Burst Verwundung. </li><li> Legen Sie 2-3 Tropfen Halocarbonöl-Mix in den Embryonen zu weiteren Austrocknung zu verhindern. </li></ol> 3. Embryo Verwundung <ol><li> Legen Sie die Folie in der Embryo-Injektion Mikroskoptisch. Finde die Embryonen in das Sichtfeld bewegt und üben die Phase des umgekehrten Mikroskops. Hinweise: Vor der Arbeit mit der Nadel, konzentrieren sich auf Mittelebene des Embryo entlang der dorsoventralen Achse. Um ein effizientes Verwundung die erlaubenEmbryonen ausgerichtet, Verwundung beginnen die Reihe näher an der Nadel Gerät. Bewegen Sie die Bühne, um die Spitze der Reihe ausgerichtet Embryonen in das Blickfeld zu bringen. </li><li> Vorsichtig und sichern gezogen-Nadel in den Nadelhalter. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel nach unten in Richtung Folie verschieben. Richten Sie die Nadel mit dem Embryo im gleichen Brennebene. Sobald die Nadel im Fokus mit dem Embryo, nicht die Nadel mit dem Mikromanipulator zu bewegen. </li><li> Bewegen Sie die Bühne, um den Embryo durch und durch durchstechen, dann auf der nächsten Embryo in der Zeile zu bewegen. Wenn Sie fertig sind Verwundung die erste Zeile, verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel ganz nach oben und weg von der Bühne, bevor er den Schlitten zu bewegen, drehen Sie die Folie manuell 180 ° und Wund die zweite Reihe. </li><li> Bewahren Sie die Embryonen unter Halocarbonöl bei Raumtemperatur und fahren Sie mit Embryo-Fixierung, wenn dadurch in-situ-Hybridisierung oder Antikörperfärbung (siehe Vorgehensweise Schritt 5). Alternativ speichern Sie die Embryonen für 4-6 hunter Halocarbonöl und fahren Sie mit Wundtranskriptions fluoreszierenden Reporter-Visualisierung (Repräsentative Ergebnisse). Hinweise: Für die Visualisierung der fluoreszierenden Reporter, betäuben wir die Embryonen mit 50% 1-Phenoxy-2-Propanol 13. Die Embryonen werden aus der Halocarbonöl entfernt und auf einem neuen Objektträger gelegt. Wir stellen Glasperlen um den Embryonen, fügen Sie ein paar Tropfen des Anästhetikums, und legen Sie ein Deckglas auf der Embryonen. </li></ol> 4. Embryo-Mikroinjektion Hinweise: Die Mikroinjektionsvorrichtung, die wir in dem Protokoll ist nicht automatisiert, um spezifische Volumen während des Tests zu liefern. Wir fügen einen Farbstoff zu der Lösung, die Mikroinjektion zu visualisieren und zu versuchen, das abgegebene Volumen zu normieren. Wenn zu viel Lösung in das Embryo injiziert wird die Dotterhaut platzen. <ol><li> Last Nadel von hinten mit 1 &amp;mgr; l der chemischen Lösung und Farbstoff (z. B. 0,6 MH 2 O 2). Lassen KapillareMaßnahmen, um die chemische Lösung auf die Spitze der Nadel zu ziehen. </li><li> Um eine Nadel abbrechen, legen Sie ein Deckglas in einem Winkel auf einer Folie und Mantel die Kante mit Halocarbonöl-Mix. Bringen Sie die Nadel in den Fokus montiert mit der Kante des Winkeldeckglas und Deckglas sanft bewegen Kante an der Spitze der Nadel bis gebrochen. Üben Sie Druck auf Mikroinjektionsvorrichtung und überprüfen Sie, dass die chemische Lösung plus Farbstoff wird die Nadel heraus fließt. </li><li> Legen Sie die Folie mit Embryonen ausgerichtet auf dem Mikroskoptisch. Gehen, um den Embryo und die Nadel in der gleichen Ebene zu konzentrieren. Gleichzeitig durchstechen und microinject chemischen Lösung plus Farbstoff in jedem Embryo. Hinweise: Verstopfte Nadeln häufig auftreten, brechen Sie eine neue Nadel auf unvollständige Mikroinjektion zu vermeiden. Eine stumpfe Nadelspitze ist nicht so sauber wie einer abgewinkelten Nadelspitze gewickelt. Einstellen des Deckglases mit einem von 90 ° verschiedenen Winkel während Bruch optimal ist, um einen abgewinkelten Nadelspitze zu erzeugen. </li></ol> 5. Formaldehyd-Fixation Hinweise: Die in diesem Drosophila Fixierung verwendeten Chemikalien sind schädlich. Persönliche Schutzausrüstung (z. B. Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille) beim Umgang mit den Chemikalien. Folgen einzelnen institutionellen Richtlinien für die Entsorgung von Chemikalien geregelt. <ol><li> Nach der Verwundung und nach 15, 30, 60 oder mehr Minuten für die Transkriptionsaktivierung von wundinduzierten Genen auftreten. Embryonen aus Einspritz Folien zu entfernen, sorgfältig entleeren Halocarbonöl-Mix aus den Folien, lehnen Sie die Folie vor einem Rack und tupfen Sie das Ende mit einem Kimwipe. </li><li> Verwenden Sie eine Glaspipette zu Heptan über den Objektträger spülen und waschen die Spülflüssigkeit in eine Glaspetrischale. Heptan wird das Band auflösen und die Embryonen. Weiter zu spülen, bis alle Embryonen werden von der Folie entfernt. Gehen Sie zur nächsten Folie, bis alle Embryonen werden aus Folien entfernt. </li><li> Übertragen Sie die Heptan und Embryo-Lösung aus der Glasschale in ein 20 ml scintillation Fläschchen. Schütteln Sie die Flasche für 2-3 min, entfernen Sie die Heptan und 5 ml frischem Heptan. </li><li> 5 ml frisch, Fixierungslösung (siehe Reagenzien Liste für Rezept). Verschließe das Röhrchen und heften sich an einem Orbitalplattform Shaker. Schütteln Sie das Fläschchen, das die Embryonen für 25 Minuten bei 220 bis 230 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Nach dem Schütteln, lassen die Blasen an der Schnittstelle Pop. Vollständig entfernen Sie die untere, wässrige Phase mit einer Pipette, die Vermeidung Ziehen der Embryonen. Die untere Schicht besteht aus der Fixierungslösung und sollte entsorgt werden. </li><li> 5 ml Methanol, das Röhrchen und kräftig mit der Hand 20-30 Sek., Wirbel und legen Sie es auf die Bank. Wounded Embryonen werden auf der Interphase bleiben und nicht auf den Boden sinken. Hinweise: Nach der Fixierung der Dotterhaut eines unverwundete Embryo wird in der Regel während der Entwässerungsschritt mit Methanol platzen. Allerdings ist die Dottermembran in einem verwundeten Embryo bereits gebrochen und die Entwässerungsschritt wird die Dotter memb nicht entfernenrane. Hand devitellinzation ist erforderlich, um die Fixierung Protokoll abzuschließen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die obere Schicht Heptan und dann mit 5 ml frischem Methanol. Schütteln Sie die Flasche und die Embryonen sollten sinken. </li><li> Entfernen Sie die Methanol plus Embryo-Lösung mit einer Transferpipette Glas und sammeln in einer Nylon-Mesh Sammelrohr in einer Glasschale. </li><li> Entfernen Sie die Methanol und spülen Sie die Embryonen mit 1x PBS-Lösung. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen aus der Nylon-Mesh zu einem Apfelsaft Platte. Verbreiten Sie die Embryonen aus entlang der Oberfläche der Platte. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen zu einem Doppelklebeband Glasträger. Decken Sie die Embryonen mit 1x PBS. Anmerkungen: Die Embryonen sind in der Regel aufgrund der Dotterhaut verklumpen. Mit einem Apfelsaft Ort ermöglicht eine schnelle Trennung der verklumpten Embryonen. Die Embryonen müssen von der Platte entfernt und zu einem Doppelklebeband Glasobjektträger übertragen werden, da Embryonen sinken in der Agar-Platte, wenn Kraft aufgebracht wird, um den Embryo aus dem entfernenDotterhaut. </li><li> Drücken Sie vorsichtig die Embryonen mit einem Seziernadel zu &quot;Pop&quot; die Dotterhaut. Der Embryo in der PBS sinken. </li><li> Verwenden Sie eine Glaspipette, die 1x PBS plus Embryonen in ein 1,5-ml-Röhrchen übertragen. Spülen Sie die Embryonen mit 1x PBS und bei 4 ° C Gehen Sie, um die Embryonen mit Hilfe eines Ethanol entwässern: PBS-Serie und weiterhin mit in-situ-Hybridisierung oder Immun Protokoll 14. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine sofortige Transkriptionsregulations Reaktion auf externe Signale erlaubt den Zellen, eine lokalisierte Reaktion auf extrazelluläre Reize, die Stress, Schäden oder Infektion zählen kann koordinieren. Die unsachgemäße Kontrolle eines lokalisierten Antwort kann schädliche Auswirkungen auf die Nachbarzellen, sowie eine Verschwendung von Ressourcen, um die Schädigung zu reparieren. Die Drosophila-Embryo bietet ein ausgezeichnetes System, grundlegende Experimente in der Wundheilung eine kostengünstige und einfach zu pflegen Modellorganismus führen. Das Potenzial für Kooperationen zwischen Forschung in anderen Modellorganismen Drosophila und bietet eine einzigartige Gelegenheit, viele biologische Fragestellungen zu erforschen. Eine weitere Technik der Wund Reporter ist die Kombination von mutierten genetischen Hintergründen, ein effizientes Verfahren zum Testen der Beitrag der neuen Gene in die Aktivierung des epidermalen Wundreaktionsweges. Wir haben epidermalen wundinduzierten Transkriptions Reportern avTENBLÄTTER sowohl am 2. und 3. 5 Chromosomen. In dieser Studie verwenden wir GAL4 UAS-Systeme und der Überexpression 16. Für Studien mit tödlichen mutierten Allele bestimmen wir den genetischen Hintergrund mit einem fluoreszierenden Balancer-Chromosom, zB Kruppel-GFP-17. Wir haben die Wunde Reporter Lokalisierung in mehreren genetischen Hintergründen (Tabelle 1) analysiert. Eine mögliche Modifikation der Technik ist es, die Mikroinjektion und Verwundung zu kombinieren. Mikroinjektion kann verwendet werden, um eine chemische Lösung in den Embryo eingeführt werden. Mehrere chemische Verbindungen wurden getestet und es wurde gefunden, um die Aktivität der epidermalen Wund Reportern 9 regulieren. Dieses Verfahren der gleichzeitigen Verwundung und Mikroinjektion kann nützlich sein, um die Anzahl der Zellen in der Drosophila-Embryo, der eine Wunde Signal reagieren und kann direkt auf Veränderungen der Genexpression überwacht werden nach der Verwundung 18 zu erhöhen. Eine zukünftige Anwendung der Mikroinjektionstechnik wird es sein, neue Chemikalien zur Regulierung des epidermalen Wundreaktion zu testen. Drosophila als Modellsystem für genetische Studien bietet eine breite Palette von einfachen bis zu komplexen Fragen Protokolle effizient anzugehen. Jüngste Berichte über die Durchführbarkeit der Drosophila Techniken unterstreicht die Verwendung von hemocyte Migration 19 und 20 Schlupfwespe Infektion als ein Mittel, um die Auswirkungen der Drosophila-Forschung weiter auszubauen. Neben Wundheilung Studien, Drosophila bietet ein klassisches Modell für die Regeneration mit Imaginalscheibe System 21,22. Die kombinierten Fortschritte in Imaginalscheibe Regeneration Studien-und Stich / Mikroinjektion Verwundung bietet ein ausgezeichnetes System zur gut erhaltenen Komponenten des Gewebereparatur zu entdecken.

Manipulation von Drosophila-Embryonen mit einer Mikroinjektionstechnik ist eine gut etablierte Assay ein. Die Bedeutung der epidermalen Wundantwort Reporter Verfahren ist, das Protokoll für die Punktion / Mikroinjektion mit fluoreszierenden Reporter kombiniert und visualisiert eine in vivo Antwort auf epidermale Schädigung in Drosophila-Embryonen. Das Ziel dieser Methode ist es, eine breitere Gruppe von Wissenschaftlern ermöglichen, Drosophila als Werkzeug, um die Prozesse, die die Transkriptions Reaktion auf epidermalen Stichverletzung regeln untersuchen zu verwenden. Die einschichtige Epidermis in Drosophila stellt ein einfaches System, um einen epidermalen Wundreaktion nach einer Stichverletzung 2 zu studieren. Die Drosophila-Embryo ist eine robuste Modellsystem, um genetisch sezieren die Phasen der Wundheilung, einschließlich Wundreaktion, Entzündung und Reepithelialisierung 3. Dies ist zum Teil, weil viele oder die meisten zygotischen Mutanten überleben Ende embryogenesist und zu entwickeln epidermalen Barrieren, auch wenn Entwicklungs Strukturierung geht grundlegend schief. Zurück Charakterisierung eines gut erhaltenen Transkriptionsfaktor Körniger Kopf (Grh), festgestellt, dass Grh-Zielgene Dopa-Decarboxylase (DDC) und Tyrosin-Hydroxylase (PLE) transkriptionell rund um die Standorte der Verletzung 4 aktiviert. Drosophila als Modellorganismus für die Wundantwort bietet eine ergänzende Reihe von Untersuchungen, Studien in Säuger 5 Wundheilung voranzutreiben. Nachfolgende Studien haben zusätzliche Drosophila wundinduzierten Gene identifiziert und entwickelte ein &quot;Toolkit&quot; von vielen fluoreszierenden Reporter Wunde, um die in vivo epidermalen Wundreaktion überwachen zu reinigen Verwundung 6. Jüngste Berichte über die Regulierung der Drosophila-Wundheilung wurden auf der Wundverschluss Phänotyp konzentriert, so dass Entdeckung der vielen Wege Regulation der Zellmigration 7,8. Bei der Analyse derfluoreszierenden Reporter Wunde, haben unsere Untersuchungen einen neuen Satz von Genen für die lokalisierte Expression des epidermalen Wunden induzierbare Gene 9 erforderlich identifiziert. Einer der Vorzüge der Wundreaktion Reporter Verfahrens ist, daß die Ergebnisse mehr Einblick in einen Mechanismus, wie Signale von der Stelle der Verletzung zu den benachbarten Zellen transduziert. Allerdings ist einer der Nachteile der Wundreaktion Reporter Verfahren, dass die Ergebnisse nicht direkt verlinken auf Phänotypen bei der Wundheilung oder Reparatur. Breitere Nutzung der sauberen Wunde Punktion-Protokoll in der genetischen und chemischen Bildschirme ermöglichen neue Regulatoren der Transkriptions Reaktion auf epidermalen Verwundung identifiziert werden und ferner die Übersetzung von Wundheilungs Entdeckungen in Säugetiermodelle Verletzungsbehandlungen.

<table><tbody><tr><td>Hefe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>Apfelsaft</td><td>Generisches</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-824-297</td><td></td></tr><tr><td>Bleiche</td><td>Generisches</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halogenkohlenwasserstofföl, 700 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Halogenkohlenwasserstofföl, 27 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>1- Phenoxy-2-Propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484423</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&beta;-Cyclodextrin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>Toluidinblau</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd, 16%</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18814-20</td><td>giftige Chemikalie</td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td>giftige Chemikalie</td></tr><tr><td></td><td>Methanol Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>giftige Chemikalie</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90013</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>RNase frei H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2819-100</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Inkubator</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-197</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenkäfig</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>Embryo-Entnahmeröhrchen</td><td>Genessee Scientific</td><td>46-101</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale aus Kunststoff</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-037</td><td></td></tr><tr><td>Doppelklebeband</td><td>Generischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinsel</td><td>Generisch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariernadel</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965A</td> Abdeckglas <td>für scharfe Objekte</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>3306</td> Mikroskop für <td>scharfe Objekte</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td> für scharfe Objekte <td>Carl Zeiss</td><td>Stemi-2000</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarnadel</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>scharfes Objekt</td></tr><tr><td>Nadelabzieher</td><td>Narishige</td><td>PC10</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter für Mikroinjektionen</td><td>Narishige</td><td>MINJ4</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN151</td><td></td></tr><tr><td>inverses Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Primo-Vert</td><td></td></tr><tr><td>Glas Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>scharfes</td></tr><tr><td>Objekt Glas Pasteur-Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-063-172</td> Transferbirne <td>für scharfe Objekte</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td> Szintillationsfläschchen <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td> für scharfe Objekte <td>Fisher Scientific</td><td>14-259-260</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml</td><td>Tube Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Laserscanning konfokale</td><td>Leica</td><td>SP2</td><td></td></tr><tr><td>Fixierlösung</td> <td>(5 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd</td><td>2,5 ml</td><td></td><td>giftige Chemikalie</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>0,5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EGTA</td><td>0,5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase frei H2O</td><td>1,5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halogenkohlenwasserstoff-Ölmischung</td> <td>(10 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halogenkohlenwasserstofföl, 700 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halogenkohlenwasserstofföl, 27 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikroinjektion wound assay und<em&gt; in-vivo-</em&gt; lokalisierung von epidermal wundreaktion reporter in<em&gt; drosophila</em&gt; embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Die Drosophila-Embryo entwickelt eine robuste Epidermis, die sowohl die internen Zellen aus einer harten äußeren Umwelt zu schützen sowie die zellulären Homöostase dient. Stichverletzungen mit Nadeln Glas bietet eine direkte Methode, um eine schnelle Antwort, die epidermalen Wund Wunde Transkriptions-Reporter, der von einem lokalisierten Reportersignal in lebenden Embryonen oder Larven sichtbar gemacht werden kann aktiviert auslösen. Pannen-oder Laser Verletzungen liefert auch Signale, die die Rekrutierung von Blutzellen an der Wundstelle zu fördern. Überraschenderweise schwerer (durch und durch) Stichverletzung im späten Stadium Embryonen nur selten stört die normale Embryonalentwicklung, als mehr als 90% dieser verwundet Embryonen überleben bis ins Erwachsenenalter, wenn Embryonen werden in einer Öl-Medium, das sofortige Auslaufen der Hämolymphe von Punktionsstellen minimiert injiziert . Die Wunde Verfahren erfordert Mikromanipulation der Drosophila-Embryonen, einschließlich manuelle Ausrichtung der Embryonen auf agar Platten und den Transfer der Embryonen ausgerichtet auf Objektträger. Die Drosophila epidermalen Wundreaktion Assay bietet einen schnellen System, um die genetischen Anforderungen einer Vielzahl von biologischen Funktionen, die Wundheilung, sowie ein Weg, um für potenzielle chemische Verbindungen, die die Wundheilung fördern, fördern Bildschirm testen. Die kurze Lebensdauer und einfache Kultivierung Routine zu machen Drosophila ein leistungsfähiges Modellorganismus. Drosophila Wundheilung sauber erscheint, um die epidermale regenerative Reaktion zu koordinieren, mit der angeborenen Immunantwort, in einer Weise, die noch untersucht werden, die ein ausgezeichnetes System konservierten regulatorischen zu finden bietet Mechanismen gemeinsam Drosophila und Säugetieren epidermalen Verwundung.

Die in diesem Verfahren dargestellten Ergebnisse zu erhalten, der offene Leserahmen des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) zu einer Promotor / wundinduzierten Enhancer-Sequenz von Dopa-Decarboxylase (DDC) und DsRed auf eine Wunde Enhancer-Sequenz von Tyrosinhydroxylase fusioniert (verschmolzen ist PLE) 4,6. In einer Live-Drosophila-Embryo, ist die Reifung des fluoreszierenden Reporterprotein Wunde optimal 4-6 Stunden nach der Verletzung, die Zeit für die Ansammlung von genügend Protein zu visualisieren, als auch Zeit für das fluoreszierende Protein an den fluoreszierenden Zustand 15 zu oxidieren. Um die Reporter Lokalisierung zu beobachten, ist eine Verbindung Fluoreszenzmikroskop ausreichend. Um eine höhere Vergrößerung des Reporter Lokalisierung beobachten, ist ein konfokales Mikroskop optimal, um einen maximalen Vorsprung von mehreren optischen Abschnitte (Figur 1) zu erzeugen. Die konfokale in vivo Bildgebung von Drosophila-Embryonen durch die ra kompliziertpid Wellungen des Embryos. . Ein Vollansicht des Embryo kann mit 20X Ziel erreicht werden und eine Nahaufnahme der Wundstelle kann mit 40X-Objektiv erhältlich. Eine Draufsicht des epidermalen Wund Reporter Lokalisierung kann mit 10 aufeinanderfolgenden 1 um optische Schnitte abgebildet werden. Ein Seitensicht der epidermalen Wund Reporter Lokalisierung mit 40 aufeinanderfolgenden 1 um optische Schnitte abgebildet werden. Mit Standard-genetischen Kreuzungsmethoden ist es möglich, Wund Reportern mit genetischen Mutationen zu kombinieren. Ein Beispiel in diesem Papier ist Flotillin-2 (Flo-2), da loss-of-function (Null-Allel mit P-Element-Insertion generiert) und gain-of-function (Überexpression mit ubiquitäre Expression in allen Zellen generiert) Mutanten Flo-2 zeigen, die Flo-2-Gen-Produkt notwendig und ausreichend ist, um die Lokalisierung der DDC-GFP hemmen gewickelt Reportern 9 (2A und 2B). Mit der microinjection Protokoll ist es möglich, zu testen, ob Einführung von chemischen Lösungen superactivates oder hemmt die Lokalisierung der Wunde Reportern. Chemisch-Embryonen wurden verwundet gleichzeitig verletzt und mit einem 1:4-Verhältnis von 1% Toluidinblau Farbstoff und gelösten Verbindungen injiziert. Toluidinblau-Färbung für visuelle Bestätigung des gelösten Verbindungen in den Körper eingespritzt erlaubt. Steuer Embryonen wurden mit einem gebrochenen Nadel enthält 1.04 Verhältnis von 1% Toluidinblau Farbstoff-und Stoff ohne chemische verwundet. Zwei Beispiele in diesem Papier sind Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) und Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD), weil beide chemischen Lösungen ausreichend sind, um global aktiviert die Lokalisierung der DDC-GFP-Reporter gewickelt 9 (Fig. 2C und 2D) . Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) wurde in H 2 O verdünnt, um 0,6 M Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) wurde in 1 m solubilisiertM NaOH bis 3 mm. Verwendung des Embryos Fixierung Protokoll ist es möglich, die Aktivierung der Transkription von Genen, Wundreaktion in einem lokalisierten Domäne erkennen, eine Wundstelle umgibt. Ein Beispiel in diesem Papier ist die in situ Hybridisierung von RNA-Sonden DDC und weise 4,6,9-Transkripte (Fig. 3A und 3B) zu erfassen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> Fig. 1 ist. Ddc-GFP und DsRed-weise Wund Reporter Lokalisierung. Hell und fluoreszierende Bilder in verwundeten Wildtyp-Embryonen. (A) Top-Blick auf Ddc-GFP gewickelt Reporter. (B) Top-Ansicht der PLE-DsRed gewickelt Reporter. Alle Bilder wurden auf einem Leica SP2 konfokalen Mikroskop gesammelt, mit 20X Ziel. Pfeile kennzeichnen Ort der Wunde. Gestrichelte Linien im Datenfelds markieren die Umrisse der Embryonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> 2. Lokalisierung der DDC-GFP-Reporter aufgewickelt in der genetischen Mutanten-Hintergründe und chemische mikroinjizierten Embryonen. Hell und fluoreszierende Bilder von verwundeten Flotillin-2 (Flo-2)-Mutante Embryonen. (A) Loss-of-function Flo-2} {KG00210 Mutanten Ausbau der Reporteraktivität in allen Zellen der Epidermis. (B) Gain-of-function Flo-2 (Gürteltier-GAL4, UAS-FLO2)-Mutanten, die Hemmung der Reporteraktivität in allen Zellen der Epidermis. (C) Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 )-Lösung Mikroinjektion, Ausbau der repOrter Aktivität in allen Zellen der Epidermis. (D) Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD)-Lösung Mikroinjektion, Ausbau der Reporteraktivität in allen Zellen der Epidermis. Alle Bilder wurden auf einem Leica SP2 konfokalen Mikroskop gesammelt, mit 20X Ziel. Pfeile kennzeichnen Ort der Wunde. Gestrichelte Linien in den Datenplatten markieren die Umrisse der Embryonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> 3. Nachweis der Wundreaktion Gens RNA-Transkripte. Fluoreszenzbilder von in-situ-Hybridisierung und RNA-Detektion in verwundeten Wildtyp-Embryonen. Ddc (A) und PLE (B) RNA-Transkripte akkumulieren um die Wunde. Alle Bilder waren Sammlungten auf einem Leica SP2 konfokalen Mikroskop mit 20X Ziel. Pfeile kennzeichnen Ort der Wunde. Gestrichelte Linien in den Datenplatten markieren die Umrisse der Embryonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Tabelle 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> Tabelle 1. Zusammenfassung der epidermalen Wundreaktion Reportern. Insertionen der vier Wundreaktion Reporter (DDC, ple, msn, kkv) sind sowohl auf den zweiten und dritten Chromosomen vorhanden. Alle der Wundreaktion Reportern aktivieren die Fluoreszenz-Gen (GFP oder DsRed) in einer begrenzten Anzahl von epidermalen Zellen rund um den Ort der Stichverletzung in der Wildtyp-Hintergrund (zB &quot;lokale&quot; Phänotyp). Ddc und msn Wundreaktion Reportern verlangen Grh für Aktivierung des FLUORESCENce-Gen nach Stichverletzungen (z. B. &quot;keine&quot; Phänotyp). Alle der Wunde Reportern verlangen Flo-2 für die Lokalisierung der Fluoreszenz-Gen nach Stichverletzung (zB &quot;global&quot; Phänotyp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

Die embryonalen Epidermis der sehr späten Stadium Drosophila-Embryonen stellt eine in vivo-System für die schnelle Stichwunde Response-Analyse und kann mit genetischen Manipulationen oder chemische Mikroinjektion Behandlungen kombiniert, um Studien in der Wundheilung für die Übersetzung in Säugetier-Modelle voranzubringen.

Mikroinjektion Wound Assay und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen in vivo-Reporter für die epidermale Wundantwort im Drosophila-Embryo sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Entwicklungsstadium gesammelt wird, in dem die Reporteraktivität zuverlässig nachgewiesen werden kann. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den Embryo mit einer Glasnadel und einer Mikroinjektionsapparatur zu perforieren. Der dritte Schritt besteht darin, das Embryo zur Visualisierung des Reporters zu betäuben. Der letzte Schritt ist die Validierung der Reporterlokalisation durch Nachweis des Expressionsmusters von RNA-Sonden. Letztendlich können die Ergebnisse mittels konfokaler Mikroskopie die spezifische Aktivierung des epidermalen Wundreaktionsreporters ausschließlich in den Zellen zeigen, die den Ort der Stichverletzung umgeben.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, die die Wundverschlussbeobachtung beinhalten, liegt darin, dass wir in lebenden Embryonen die Genexpression sehen können, die durch eine Stichverletzung ausgelöst wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Gewebereparatur zu beantworten, beispielsweise wie Zellen, die eine Verletzung umgeben, eine unmittelbare Wundantwort regulieren, um die Reparatur zu fördern. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie oder Diagnose der Geweberegeneration, da die Regulation der Wundantwort der erste Schritt ist.Die Wundheilung kann in jedem Entwicklungsstadium untersucht werden. Ab Stadium 17 ist das Cuticula jedoch zu ausgereift. Bekannte Wundreporter werden nicht aktiviert.Um dies zu demonstrieren, werden Stadien 15 bis 16 verletzt, um Embryonen zu gewinnen. Sammeln Sie zwei bis drei Tage alte adulte Fliegen, 50 Weibchen und 25 Männchen. Überführen Sie sie in einen Embryosammlungskäfig mit einer frischen Platte aus Apfelsaft, Agar und einer Portion Hefepaste.Stellen Sie den Käfig während der nächsten drei Tage jeden Morgen bei 25 Grad Celsius auf. Ersetzen Sie die Platte durch eine frische. Am Nachmittag des dritten Tages lassen Sie Eier zwei Stunden lang auf einer frischen Platte ansammeln.Lagern Sie diese Platte 14 Stunden bei 25 Grad Celsius. Nach einer zweistündigen Paarung sollten am nächsten Tag etwa 200 Embryonen vorliegen. Geben Sie einige Milliliter Wasser auf die Platte und schwenken Sie sie vorsichtig.Danach mit einem Pinsel das Wasser und die Embryonen von der Platte in einen Nylonsiebkorb in einem Sammelröhrchen überführen. Anschließend eine flache Bleichlösung herstellen und die Embryonen zwei Minuten darin einweichen lassen. Bei diesem Schritt werden die CORs, die Eier, entfernt.Die Badewanne mehrmals im Wirbel schwenken, um zu verhindern, dass sich die Embryonen zusammenlagern. Nach zwei Minuten die Embryonen jeweils fünf Sekunden lang mit fließendem Wasser und durch Spülen der Petrischale abspülen. Anschließend den Embryonenkorb auf ein Papiertuch stellen, um die Embryonen trocknen zu lassen.Danach etwa 50 Embryonen mit einer Präpariernadel vom Netz auf eine mit grüner Lebensmittelfarbe hergestellte Agarplatte übertragen. Die Farbe dient dazu, die Sichtbarkeit der Knie-Eier zu erhöhen. Unter einem Stereomikroskop zwei parallele Reihen von Embryonen in einem Abstand von etwa fünf Millimetern anlegen.Platzieren Sie die Reihen im Abstand der Breite eines Embryos, um den Gasaustausch zu ermöglichen. Drücken Sie anschließend vorsichtig eine Objektträger mit doppelseitigem Klebeband auf die Embryonen, sodass die Reihen senkrecht zur Länge des Objektträgers verlaufen. Um ihren inneren Druck zu verringern, lassen Sie die Embryonen an der Luft trocknen.Auf diese Weise platzen sie nicht, wenn sie verletzt werden. Nach 25 Minuten sollte die erste vorbereitete Objektträgerpräparation trocken sein. Bedecken Sie die Embryonen nun mit zwei bis drei Tropfen Halokohlenwasserstofföl, um eine weitere Austrocknung zu verhindern, und verletzen Sie die trockenen Embryonen unverzüglich.Platzieren Sie den Embryoschlitten auf dem Objekttisch des Injektionsmikroskops. Suchen Sie die Embryonen im Sichtfeld und üben Sie das Bewegen des Objekttisches des inversen Mikroskops. Fokussieren Sie nun auf die mittlere Ebene des Embryos entlang der dorsoventralen Achse und bringen Sie den obersten Embryo der ersten ausgerichteten Reihe in das Sichtfeld.Platzieren und sichern Sie anschließend vorsichtig eine gezogene Nadel im Nadelhalter. Bewegen Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator auf den Objektträger hinab. Richten Sie die Nadel in derselben Fokusebene mit dem Embryo aus. Passen Sie den Mikromanipulator nun nicht weiter an. Bewegen Sie nun die Stufe, um das Embryo vollständig zu durchstechen. Danach wechseln Sie zum nächsten Embryo in der Reihe.Nachdem die erste Reihe verletzt wurde, bewegen Sie die Nadel vollständig nach oben und weg vom Objekttisch. Drehen Sie dann die Objektträger und setzen Sie die Einstiche bei den Embryonen in der zweiten Reihe fort. Sobald alle verletzt sind, können die Embryonen unmittelbar fixiert werden für die In-situ-Hybridisierung oder Antikörperfärbung.Um fluoreszierende Reporter zu untersuchen, warten Sie vier bis sechs Stunden und übertragen das Embryo auf eine neue Objektträger. Platzieren Sie Glaskügelchen um die Embryonen herum. Geben Sie dann einige Tropfen einer 50%igen Lösung aus Phenoxypropanol, einem Anästhetikum, hinzu und legen Sie einen Deckglaser auf die Embryonen für Mikroinjektionen. Befüllen Sie die Injektionsnadel von hinten mit einem Mikroliter chemischer Lösung zusammen mit Farbstoff, beispielsweise 0,6 molarer Wasserstoffperoxid.Lassen Sie die Kapillarwirkung die chemische Lösung bis zur Spitze der Nadel ziehen. Brechen Sie anschließend die Nadelspitze gegen die Kante eines Deckgläschens in einer Halo-Carbon-Öl-Mischung ab. Bringen Sie zunächst die montierte Nadel in den Fokus, wobei die Kante des schräg stehenden Deckgläschens nahezu, aber nicht ganz im 90-Grad-Winkel steht.Bewegen Sie dann vorsichtig die Kante der Deckglasplatte über die Nadelspitze, bis diese bricht. Üben Sie anschließend Druck auf die Mikroinjektionsvorrichtung aus und prüfen Sie, ob die Lösung aus der Nadel austritt. Falls keine Flüssigkeit austritt, brechen Sie die Nadel etwas weiter auf.Führen Sie nun dasselbe Verfahren durch, das zuvor nur zum Einstich in die Embryonen verwendet wurde. Dieses Mal injizieren Sie jedoch die Lösung gleichzeitig mit dem Einstich mikroinjizierend. Idealweise injizieren Sie 10 Nanoliter.Wenn zu viel Lösung in das Embryo injiziert wird, platzt die Vitale-Membran während des Fixierungsverfahrens im Textprotokoll. Achten Sie daher sorgfältig auf die folgenden Schritte. Verwenden Sie eine Glaspipette, keine Kunststoffpipette, um das Heptan über den Objektträger abzuspülen, und verwenden Sie Glas, um die Embryonen in die Mitte der Glas-Petrischale zu wirbeln. Anschließend schütteln Sie die Embryonen 25 Minuten lang bei 220 bis 230 U/min im Fixansatz. Nach dem Schütteln warten Sie, bis die Blasen an der Grenzfläche zerplatzen, bevor Sie die untere wässrige Phase vollständig abziehen. Achten Sie zudem darauf, die Embryonen nicht mit aufzuziehen. Nach Zugabe des Methanols sollten sich die verletzten Embryonen später an der Grenzfläche ansammeln; verteilen Sie die Embryonen dann gleichmäßig entlang der Oberfläche der Platte und übertragen Sie sie anschließend auf einen Objektträger mit doppelseitigem Klebeband. Danach die Embryonen vorsichtig mit der Präpariernadel bearbeiten, um die Vitale-Membran zu durchbrechen, und mit der Dehydrierung fortfahren. Wildtyp-Fliegen wurden mit fluoreszierenden Reportern, die an Enhancer der DOPA-Decarboxylase oder der Tyrosinhydroxylase gekoppelt waren, transformiert und dem beschriebenen Assay unterzogen. Im Hellfeld war es möglich, die Wundstelle zu erkennen, während unter Fluoreszenzbeleuchtung die Aktivität des DCD-Wund-Reporters sichtbar war.Der Tyrosinhydroxylase-Reporter zeigte ein ähnliches Ergebnis. Beide Bilder wurden an einem konfokalen Mikroskop Leica SP2 mit einem 20x-Objektiv aufgenommen. Das Verfahren wurde in einem Funktionsverlust-Mutanten im Rahmen von Fliege zwei durchgeführt.Im Hintergrund wurde die DOPA-Decarboxylase-Reportergenaktivität in den epidermalen Zellen bei Gewinn-von-Funktion-Fluss-zwei-Mutanten, die durch ubiquitäre Expression in allen Zellen erzeugt wurden, erweitert. Eine Hemmung des Reporters wurde in den epidermalen Zellen beobachtet. Anschließend wurden Embryonen gleichzeitig verletzt und mit einer gelösten Verbindung sowie mit Uridinblaufärbung, Wasserstoffperoxid und Wasser injiziert, wodurch die DOPA-Decarboxylase-Reportergenaktivität in den epidermalen Zellen erweitert wurde; ebenso wie eine Injektion von Methyl-β-Cyclodextrin in Natriumhydroxid unter Verwendung der In-situ-Hybridisierung.Die transkriptionelle Aktivierung von Wundreaktionsgenen wurde mittels endogener DOPA-Decarboxylase nachgewiesen. Die RNA-Expression zeigte sich lokalisiert um die Wundstelle herum, und natürlich wurden auch Tyrosinhydroxylase-RNA-Transkripte an der Wundstelle angereichert. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 60 Minuten durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, nicht zu viel Zeit mit der Ausrichtung der Embryonen zu verbringen, sondern mit den nächsten Schritten des Verfahrens fortzufahren.

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

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