Mikroinjektion Wound Assay und In-vivo- Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in Drosophila Embryos.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, in vivo Reporter für die epidermale Wundreaktion im Drosophila-Embryo sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Entwicklungsstadium erfasst wird, in dem die Reporteraktivität konsistent nachgewiesen werden kann. Der zweite Schritt des Eingriffs besteht darin, den Embryo mit einer Glasnadel und einem Mikroinjektionsgerät zu punktieren.

Der dritte Schritt besteht darin, den Embryo für die Visualisierung des Reporters zu betäuben. Der letzte Schritt besteht darin, die Reporterlokalisierung zu validieren, indem das Expressionsmuster von RNA-Sonden detektiert wird. Letztendlich können die Ergebnisse durch konfokale Mikroskopie die spezifische Aktivierung des epidermalen Wundreaktionsreporters nur in den Zellen zeigen, die die Stelle der Punktionsverletzung umgeben.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, bei denen der Wundverschluss untersucht wird, besteht darin, dass wir in lebenden Embryonen eine Genexpression sehen können, die durch eine Punktionsverletzung ausgelöst wird. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Gewebereparatur zu beantworten, z. B. wie die Zellen, die eine Verletzung umgeben, eine unmittelbare Wundreaktion regulieren, um die Reparatur zu fördern. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose der Geweberegeneration, da die Regulierung der Wundreaktion der erste Schritt ist.

Die Wundheilung kann in jedem Entwicklungsstadium getestet werden. Im 17. Stadium ist die Nagelhaut jedoch zu reif. Bekannte Wundmelder werden nicht aktiviert.

Um das zu demonstrieren, werden die Stadien 15 bis 16 verwundet, um Embryonen zu ernten. Sammle zwei bis drei Tage alte erwachsene Fliegen, 50 Weibchen und 25 Männchen. Gib sie in einen Käfig für die Embryonenentnahme mit einem frischen Teller Apfelsaft, Agar und einem Klecks Hefepaste.

Lagern Sie den Käfig in den nächsten drei Tagen jeden Morgen bei 25 Grad Celsius. Ersetzen Sie die Platte durch eine frische. Lassen Sie die Eier am Nachmittag des dritten Tages zwei Stunden lang auf einem frischen Teller sammeln.

Lagern Sie diese Platte 14 Stunden bei 25 Grad Celsius. Eine zweistündige Legezeit sollte am nächsten Tag etwa 200 Embryonen ergeben. Gib ein paar Milliliter Wasser auf den Teller und schwenke ihn vorsichtig.

Übertragen Sie dann mit einem Pinsel das Wasser und die Embryonen von der Platte in einen Nylonnetzkorb in einem Sammelröhrchen. Machen Sie nun ein flaches Bleichbad und weichen Sie die Embryonen zwei Minuten lang darin ein. In diesem Schritt werden die CORs, die Eier, entfernt.

Schwenken Sie das Bad einige Male, um zu verhindern, dass die Embryonen verklumpen. Spülen Sie die Embryonen nach zwei Minuten mit fließendem Wasser ab und spülen Sie sie jeweils fünf Sekunden lang mit der Petrischale aus. Schieben Sie dann den Embryokorb auf ein Papiertuch, um die Embryonen abzutrocknen.

Als nächstes bewegen Sie mit einer Präpariernadel etwa 50 Embryonen aus dem Netz auf eine Agarplatte, die mit grüner Lebensmittelfarbe hergestellt ist. Der Farbstoff dient zur Erhöhung der Sichtbarkeit von Knieeiern. Machen Sie unter einem Präparierfernrohr zwei parallele Reihen von Embryonen im Abstand von etwa fünf Millimetern.

Positionieren Sie die Reihen um die Breite eines Embryos auseinander, um einen Gasaustausch zu ermöglichen. Als nächstes drücken Sie vorsichtig einen Objektträger mit doppeltem Klebeband auf die Embryonen, so dass die Reihen senkrecht zur Länge des Objektträgers stehen. Um ihren Innendruck zu verringern, lassen Sie die Embryonen an der Luft trocknen.

Auf diese Weise platzen sie nicht, wenn sie verwundet werden. Nach 25 Minuten sollte die erste vorbereitete Folie trocken sein. Bedecken Sie nun die Embryonen mit zwei bis drei Tropfen Halo-Kohlenstofföl, um eine weitere Austrocknung zu verhindern, und fahren Sie sofort mit der Verwundung der trockenen Embryonen fort.

Legen Sie den Objektträger des Embryos in das Injektionsmikroskop. Finden Sie die Embryonen im Sichtfeld und üben Sie, den Tisch des inversen Mikroskops zu bewegen. Fokussieren Sie nun auf die mittlere Ebene des Embryos entlang der dorsalen ventralen Achse und bringen Sie den oberen Embryo der ersten ausgerichteten Reihe in das Sichtfeld.

Platzieren und fixieren Sie anschließend vorsichtig eine gezogene Nadel im Nadelhalter. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel nach unten zum Objektträger zu bewegen. Richten Sie die Nadel mit dem Embryo in derselben Fokusebene aus.

Stellen Sie den microm-Manipulator nun nicht weiter ein. Bewegen Sie nun die Phase, um den Embryo durch und durch zu punktieren. Gehen Sie dann zum nächsten Embryo in der Reihe über.

Nachdem Sie die erste Reihe aufwickelt haben, bewegen Sie die Nadel vollständig nach oben und vom Tisch weg. Drehen Sie dann den Objektträger und fahren Sie mit der Punktion der Embryonen in der zweiten Reihe fort. Sobald alle verwundet sind, können die Embryonen sofort für die Hybridisierung oder Antikörperfärbung in Ihnen fixiert werden.

Um fluoreszierende Reporter zu untersuchen, warten Sie vier bis sechs Stunden und übertragen Sie den Embryo auf einen neuen auf dem neuen Objektträger, platzieren Sie Glasperlen um die Embryonen. Fügen Sie dann ein paar Tropfen 50% eines Phenoxys, zwei Propanol, das ein Anästhetikum ist, hinzu und legen Sie ein Deckglas auf die Embryonen für Mikroinjektionen. Befüllen Sie die Injektionsnadel von hinten mit einem Mikroliter chemischer Lösung plus Farbstoff, z. B. 0,6 molar Wasserstoffperoxid.

Lassen Sie die chemische Lösung durch Kapillarwirkung zur Nadelspitze ziehen. Brechen Sie als Nächstes die Spitze der Nadel gegen die Kante eines Deckblatts in Halo Carbon Oil Mix. Bringen Sie zunächst die montierte Nadel so in den Fokus, dass die Kante des abgewinkelten Deckglases nicht ganz 90 Grad beträgt.

Bewegen Sie dann die Einsteckkante vorsichtig über die Spitze der Nadel, bis sie bricht. Üben Sie dann Druck auf das Mikroinjektionsgerät aus und prüfen Sie, ob die Lösung aus der Nadel fließt. Wenn es nicht fließt, breche die Nadel noch ein wenig auf.

Führen Sie nun die gleiche Prozedur durch, die nur für die Punktion von Embryonen verwendet wird. Diesmal injizieren Sie die Lösung gleichzeitig mit der Punktion. Im Idealfall injizieren Sie 10 Nanoliter.

Wenn zu viel Lösung in den Embryo injiziert wird, platzt die Vitale-Membran, während das Fixierungsverfahren im Textprotokoll befolgt wird, achten Sie sorgfältig auf die folgenden Schritte. Verwenden Sie eine Glaspipette, nicht Plastik, um das Heptan über den Objektträger zu spülen, und verwenden Sie Glas, um die Embryonen in die Mitte der Glas-Petrischale zu schwenken. Später schütteln Sie die Embryonen 25 Minuten lang bei 220 bis 230 U/min in einem Fixiermittel.

Lassen Sie nach dem Schütteln die Blasen an der Grenzfläche platzen, bevor Sie die untere wässrige Phase vollständig entfernen. Achten Sie auch darauf, die Embryonen nicht herauszuziehen. Nach der Zugabe des Methanols sollten sich die verwundeten Embryonen später an der Grenzfläche gruppieren, die Embryonen so entlang der Oberfläche der Platte verteilen und auf diese Weise auf einen Doppelstick-Tape-Glasobjektträger übertragen.

Schieben Sie dann vorsichtig mit der Präpariernadel auf die Embryonen, um die Vitale-Membran zu öffnen und mit der Dehydrierung fortzufahren. Wildtyp-Fliegen wurden mit fluoreszierenden Reportern transformiert, die mit DOPA-Decarboxylase- oder Tyrosinhydroxylase-Verstärkern fusioniert waren, und dem beschriebenen Assay unterzogen. Unter Hellfeld war es möglich, die Wundstelle zu sehen, während es unter Fluoreszenzbeleuchtung möglich war, die Aktivität des DCD-Wundreporters zu sehen.

Der Tyrosin-Hydroxylase-Reporter zeigte ein ähnliches Ergebnis. Beide Bilder wurden mit einem Leica SP Two Konfokalmikroskop mit einem 20-fach-Objektiv aufgenommen. Das Verfahren wurde in einer Mutante mit Funktionsverlust durchgeführt.

Hintergrund: Die Aktivität des DOPA-Decarboxylase-Reporters wurde in den Epidermiszellen im Gain-of-Function-Flow von zwei Mutanten ausgeweitet, die mit ubiquitärer Expression in allen Zellen erzeugt wurden. Eine Hemmung des Reporters wurde in allen Epidermiszellen festgestellt. Als nächstes wurden die Embryonen gleichzeitig verwundet und mit einer solubilisierten Verbindung injiziert, und der Udblaufarbstoff Wasserstoffperoxid und Wasser erweiterten die DOPA-Decarboxylase-Reporteraktivität in den Epidermiszellen, ebenso wie eine Injektion von Methyl-B-Cyclodextrin in Natriumhydroxid unter Verwendung der Inside-U-Hybridisierung.

Die transkriptionelle Aktivierung von Wundreaktionsgenen wurde mittels endogener DOPA-Decarboxylase getestet. Es wurde festgestellt, dass die RNA-Expression um die Wundstelle herum lokalisiert war, und natürlich wurde auch festgestellt, dass sich Tyrosinhydroxylase, RNA-Transkripte, an der Wundstelle ansammeln. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 60 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, nicht zu viel Zeit mit dem Ausrichten der Embryonen zu verbringen und mit den nächsten Schritten des Verfahrens fortzufahren.