Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirkung bestimmter Behandlungen auf die Zellmigration in einem dreidimensionalen, wundassoziierten Fibrin-Gerüst zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Wundheilung zu beantworten, beispielsweise wie Veränderungen in der Fasernetzwerkstruktur die Zellmigration in Fibringerinnsel an Wundstellen beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache und reproduzierbare Methode zur Analyse der Zellmigration innerhalb von Fibringerinnseln in 3D bietet. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das Übertragen der Sphäroide anspruchsvoll sein kann.

Beginnen Sie damit, ein Gefäß mit gefrorenen neonatalen humanen dermalen Fibroblasten im Wasserbad bei 37 Grad Celsius aufzutauen. Sobald die Zellen gerade aufgetaut sind, sammeln Sie sie durch Zentrifugation ein und resuspendieren das Zellpellet in frischem Kulturmedium für neonatale humane dermale Fibroblasten mit einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Anschließend werden die Zellen in einem T75-Kulturgefäß ausgesät und 72 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Wenn die Kultur eine Konfluenz von 80 % erreicht hat, lösen Sie die Zellen mit fünf Millilitern Trypsin-EDTA ab. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius neutralisieren Sie das Trypsin mit fünf Millilitern vorgewärmtem Medium und mischen 40 Mikroliter Zellen im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau. Heben Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot der Zellen zur Zellzählung auf.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einer Konzentration von 1,25 × 10⁵ Zellen pro Milliliter. Anschließend befüllen Sie den Boden einer 10 cm Petrischale mit fünf Milliliter steriler PBS. Danach kehren Sie den Deckel der Petrischale um und geben mehrere Tropfen à 20 Mikroliter der Zellsuspension auf die innere Oberfläche des Deckels.

Wenn alle Tropfen aufgetragen wurden, das Deckglas erneut vorsichtig auf die Schale setzen, wobei darauf geachtet werden muss, dass die hängenden Tropfen nicht gelöst werden, und die Schale vorsichtig für 72 Stunden in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator stellen. Am Ende der Inkubation 100 Mikroliter Gerinnungslösung pro Sphäroid pro Vertiefung einer 48-Loch-Platte hinzufügen und die Platte vorsichtig schütteln und antippen, um sicherzustellen, dass die Fibringerinnungsmischung die gesamte Vertiefung bedeckt. Die Platte für eine Stunde in den Inkubator stellen.

Nachdem die Gerinnungsschicht polymerisiert hat, überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop das Vorhandensein von Sphäroiden in der Hängetropfkultur und bringen Sie die 48-Loch-Platte sowie die Hängetropfkulturschale in eine Zellkulturbank. Drehen Sie den Petrischalendeckel vorsichtig um, um Zugang zu den Hängetropfkulturen zu erhalten, und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 21-Gauge-Nadel, um einen Tropfen in jedes fibrinbeschichtete Loch zu überführen. Ich achte besonders darauf, die Sphäroide vorsichtig zu aspirieren und zu platzieren, da der schwierigste und kritischste Schritt des Verfahrens darin besteht, die Sphäroide zu übertragen, ohne sie zu beschädigen.

Überprüfen Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Sphäroide korrekt in die entsprechenden Vertiefungen eingesät wurden. Schichten Sie vorsichtig 100 Mikroliter frisch zubereitete Gerinnungslösung auf jeden Tropfen mit Sphäroiden und überprüfen Sie erneut die Sphäroide unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass sie weiterhin intakt sind und sich in der Mitte jeder Vertiefung befinden. Danach bringen Sie die 48-Loch-Platte zurück in den Inkubator, um die Polymerisation der zweiten Fibrinschicht zu ermöglichen.

Nach einer Stunde jede Vertiefung mit 500 Mikrolitern des entsprechenden Mediums für die jeweilige experimentelle Sphäroid-Gruppe behandeln und die Platte in den 37 Grad Celsius warmen Inkubator zurückbringen. Erhalten Sie alle 24 bis 72 Stunden Bilder der Sphäroide mittels Hellfeldmikroskopie, wobei ein Z-Stack verwendet wird, um aufeinanderfolgende Querschnitte der dreidimensionalen Zellkultur zu betrachten. Anschließend die Zellgrenze jedes Sphäroids in jeder aufeinanderfolgenden Zeitspanne mit geeigneter Bildanalyse-Software nachzeichnen und mithilfe der Messfunktion den prozentualen Flächenzuwachs für jedes Sphäroid ermitteln.

Nach der Kultur in dem jeweiligen pro- oder anti-migratorischen Wirkstoff von Interesse können die Anfangsflächen der Sphäroide mittels Hellfeld-Mikroskopie erfasst und als Referenz zur Bestimmung des Ausmaßes des nachfolgenden Zellauswuchses aus den Sphäroidkörpern zu jedem zeitlich aufeinanderfolgenden Zeitpunkt herangezogen werden. In diesem repräsentativen Experiment zeigten die Sphäroide, die einem pro-migratorischen Wirkstoff ausgesetzt waren, im Vergleich zu den Sphäroiden, die einem migrationshemmenden oder Kontrollwirkstoff ausgesetzt waren, ein signifikant erhöhtes Maß an Migration von dem ursprünglichen Sphäroidkörper weg. Umgekehrt wiesen die Sphäroide, die einem anti-migratorischen Wirkstoff ausgesetzt waren, im Vergleich zu den mit Kontrollmittel behandelten Sphäroiden eine signifikant verminderte Migration von dem ursprünglichen Sphäroidkörper weg auf.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in zweieinhalb Stunden abgeschlossen werden, ohne die Zeit für die Zellkultur einzuschließen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellsphäroide kultiviert und einbettet, um dreidimensionale in-vitro-Zell-Migrationsassays durchzuführen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie histologische und immunhistochemische Verfahren angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie die Struktur des Fibrinnetzwerks innerhalb des Gerinnsels oder die Aktin-Ausrichtung in den Zellen des Sphäroids mit einer erhöhten oder verringerten Zellmigration zusammenhängen.

Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Zellkulturen und Nadeln äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen der geeigneten Schutzausrüstung und das Arbeiten in einer sterilen Sicherheitswerkbank getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.