Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirkung spezifischer Behandlungen von Interesse auf die Zellmigration in einem dreidimensionalen wundassoziierten Fibringergerüst zu beobachten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Wundheilung zu beantworten, wie Veränderungen in der Fasernetzwerkstruktur die Zellmigration und Fibringerinnsel an Wundstellen beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache und reproduzierbare Methode zur Analyse der Zellmigration innerhalb von Fibringerinnseln in 3D bietet. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Übertragung der Sphäroide schwierig sein kann.

Beginnen Sie damit, ein Fläschchen mit gefrorenen neonatalen dermalen Fibroblasten in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad zu erwärmen. Wenn die Zellen gerade aufgetaut sind, sammeln Sie sie durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet wieder in frischem neonatalem humanem dermalem Fibroblastenmedium in einer Konzentration von 1 x 10 bis 6 Zellen pro Milliliter. Anschließend säen Sie die Zellen in einem T75-Kulturkolben für eine 72-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid aus.

Wenn die Kultur eine Konfluenz von 80 % erreicht, lösen Sie die Zellen mit fünf Millilitern Trypsin-EDTA ab. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius neutralisieren Sie das Trypsin mit fünf Millilitern erwärmtem Medium und mischen Sie 40 Mikroliter Zellen mit Trypanblau im Verhältnis 1:1. Reservieren Sie ein Aliquot von 10 Mikrolitern Zellen für die Zählung.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet in einer Konzentration von 1,25 x 10 bis zur 5. Zellen pro Milliliter. Als nächstes beschichten Sie den Boden einer 10 Zentimeter großen Petrischale mit fünf Millilitern sterilem PBS. Drehen Sie dann den Deckel der Petrischale um und geben Sie mehrere 20-Mikroliter-Tropfen der Zellsuspension auf die Innenfläche des Deckels.

Wenn alle Tropfen platziert sind, drehen Sie den Deckel wieder auf die Schale, achten Sie darauf, dass sich die hängenden Tropfen nicht lösen, und stellen Sie die Schale vorsichtig für 72 Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Geben Sie am Ende der Inkubation 100 Mikroliter Gerinnsellösung pro Sphäroid pro Vertiefung auf eine 48-Well-Platte und schütteln und klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um sicherzustellen, dass die Fibringerinnselmischung die gesamte Vertiefung bedeckt. Legen Sie die Platte für eine Stunde in den Inkubator.

Wenn die Gerinnselschicht polymerisiert ist, bestätigen Sie das Vorhandensein von Sphäroiden in der hängenden Tropfenkultur unter einem Lichtmikroskop und überführen Sie die 48-Well-Platte und die hängende Tropfenkulturschale in eine Zellkulturhaube. Drehen Sie den Deckel der Petrischale vorsichtig um, um an die hängenden Tropfenkulturen zu gelangen, und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 21-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um einen Tropfen in jede mit Fibrin beschichtete Vertiefung zu übertragen. Beim Aspirieren und Plattieren der Sphäroide gehe ich besonders vorsichtig vor, da der schwierigste und kritischste Schritt in diesem Prozess darin besteht, die Sphäroide zu übertragen, ohne sie zu zerstören.

Untersuchen Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Sphäroide ordnungsgemäß in die entsprechenden Vertiefungen ausgesät wurden. Schichten Sie vorsichtig 100 Mikroliter frisch zubereitete Gerinnsellösung auf jeden Sphäroide, der Tropfen enthält, und untersuchen Sie die Sphäroide erneut unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie noch intakt sind und sich in der Mitte jeder Vertiefung befinden. Stellen Sie dann die 48-Well-Platte wieder in den Inkubator ein, damit die zweite Fibrinschicht polymerisieren kann.

Nach einer Stunde behandeln Sie jede Vertiefung mit 500 Mikrolitern des entsprechenden Mediums für die entsprechende experimentelle Sphäroidgruppe und stellen Sie die Platte wieder in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Erhalten Sie alle 24 bis 72 Stunden Bilder der Sphäroide durch Hellfeldmikroskopie, wobei Sie einen Z-Stapel verwenden, um aufeinanderfolgende Querschnitte der 3D-Zellkultur zu betrachten. Verfolgen Sie dann in der entsprechenden Bildanalysesoftware den Zellrand jedes Sphäroids zu jedem aufeinanderfolgenden Zeitpunkt und verwenden Sie die Messfunktion, um auf die prozentuale Flächenzunahme für jedes Sphäroid zuzugreifen.

Nach ihrer Kultur, in dem Pro- oder Anti-Migrationsmittel von Interesse, können die Anfangsbereiche der Sphäroide durch hellfeldmikroskopische Bildgebung bestimmt und als Referenz für die Bestimmung des Grades des nachfolgenden Zellwachstums aus den Sphäroidkörpern zu jedem aufeinanderfolgenden Zeitpunkt verwendet werden. In diesem repräsentativen Experiment zeigten die Sphäroide, die einem promigratorischen Mittel ausgesetzt waren, einen signifikant erhöhten Grad der Migration weg vom ursprünglichen Sphäroidkörper im Vergleich zu den Sphäroiden, die einem migrationshemmenden oder -kontrollmittel ausgesetzt waren. Umgekehrt zeigten die Sphäroide, die einem Anti-Migrationsmittel ausgesetzt waren, einen signifikant verringerten Grad der Migration weg vom ursprünglichen Sphäroidkörper im Vergleich zu den mit der Kontrolle behandelten Sphäroiden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zweieinhalb Stunden abgeschlossen werden, ohne die Zellkulturzeit, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellsphäroide für dreidimensionale In-vitro-Zellmigrationsassays kultiviert und einbettet. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie histologische und immunhistochemische Methoden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie die Fibrinnetzwerkstruktur innerhalb des Gerinnsels oder die Aktinausrichtung in den Sphäroidzellen mit einer erhöhten oder verminderten Zellmigration korrespondieren.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Zellkulturen und Nadeln äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen der richtigen Schutzausrüstung und das Arbeiten in einer sterilen Kulturhaube.