Name: Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Analyse der Zellwanderung in dreidimensionalen Fibrin-Matrizen für Wundheilungsstudien. Dieses Protokoll ermöglicht reproduzierbare Untersuchungen zur Zellmigration in vitro.

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Finanzierung für diese Arbeit wurde durch die American Heart Association (16SDG29870005) und der North Carolina State University Research und Innovation Seed-Finanzierung zur Verfügung gestellt.

1. Tag1: Zelle und Reagenz Vorbereitung Hinweis: alle Zell- und Reagenz Vorbereitung sollte in einem biologischen Sicherheitsschrank gegen Kontamination der Proben durchgeführt werden.
<ol><li>Warm gefiltert Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s Medium (DMEM), fetale bovine Serum (FBS), L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin in einem 37 ° C Wasserbad.</li>
	<li>Vorbereiten Neugeborenen menschlichen dermalen Fibroblasten (HDFn) Medien durch Ergänzung erwärmt DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % L-Glutamin.</li>
	<li>Tauwetter ein Fläschchen mit gefrorenen HDFns und Zentrifuge für 8 min. bei 200 X g Kryokonservierung Medium zu entfernen. Zellen in vorbereitete HDFn Medien bei einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen/mL und Samen in einer T-75 Kultur Flasche aufzuwirbeln.</li>
	<li>Ort Kolben in einem Inkubator (37 ° C, 5 % CO 2) erlauben Zellproliferation.</li>
	<li>Store HDFn Media bei 4 ° c</li>
	<li>Pro und anti migratory Reagenzien vorzubereiten, wie gebraucht.</li>
</ol> 2. 3. Tag: Sphäroid Vorbereitung <ol><li>führen Sie die folgenden in eine Kultur-Haube, Kontamination der Proben zu verhindern.</li>
	<li>Wenn Zellen erreichen 80 % Konfluenz aspirieren Sie Medien und Hinzufügen von 0,25 % 5 mL Trypsin-EDTA. Shop-Kolben in einem Inkubator 37 ° C für 5 min, Zellen von der Oberfläche der Küvette vollständig zu lösen.</li>
	<li>Fügen Sie 5 mL erwärmten Medien in den Kolben, die Trypsin neutralisieren.</li>
	<li>In einem Microcentrifuge Schlauch mischen, 10 μL Trypan blau und 10 μl Zellsuspension.</li>
	<li>Zentrifuge der ursprünglichen Zellsuspension für 8 min bei 200 X g.</li>
	<li>Während die Zellsuspension zentrifugiert wird, ist ein Hemocytometer 10 μl Zellsuspension Trypan Blau hinzu, und führen Sie eine Zellzahl.</li>
	<li>Nach Zentrifugation, Aspirieren Medien ohne verdrängen die Zelle Pellet. Aufschwemmen der Zelle Pellet in einer Konzentration von 1,25 x 10 5 Zellen/mL.</li>
	<li>Fügen Sie 5 mL sterilem Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf den Boden einer 10 cm Petrischale Erhalt eine hydratisierte Umgebung während des Wachstums der Sphäroid.</li>
	<li>Drehen Sie den Deckel der Petrischale. Fügen Sie mehrere 20 μL Tropfen der Zellsuspension auf der inneren Oberfläche des Deckels Petrischale.</li>
	<li>Schnell den Deckel wieder umkehren und legen Sie sie wieder auf den Boden der Schale, ohne dabei die hängenden Tropfen zu verdrängen. Abbildung 1 zeigt erfolgreich gebildete hängenden Tropfen.</li>
	<li>Vorsichtig legen Sie die Schale in einem 37 ° C Inkubator und lassen Sphäroide wachsen in einer hängenden Tropfen Kultur für einen Zeitraum von 72 h.</li>
</ol> 3. 6. Tag: Einbettung Sphäroide in 3D Matrix <ol><li>führen Sie die folgenden in eine Kultur-Haube, Kontamination der Proben zu verhindern.</li>
	<li>Für die Bildung der ersten Schicht Fibrin, erstellen eine Gerinnsel Lösung ausreichend Volumen hinzufügen 100 μL Gerinnsel Lösung pro Bohrloch für so viele Brunnen wie erforderlich (1 Sphäroid pro Well). Klumpen bestehen aus 10 % 10 X HEPES Puffer nach Volumen (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7,4), 2 mg/mL menschlichen Fibrinogen und 0,1 U/mL menschliches alpha Thrombin. Der Rest des Bandes Gerinnsel besteht aus hochreinem Wasser.
	<ol><li>Add Thrombin zuletzt und schnell hinzufügen Lösung zur gewünschten Brunnen in einem 48-Well-Platte um Klumpen zu vermeiden dadurch vor dem Brunnen hinzugefügt wird.</li>
	</ol></li> <li>Sanft schütteln/Tap-well-Platte um sicherzustellen, dass Fibrin Gerinnsel Mischung auch die gesamte Beschichtung ist, und platzieren Sie well-Platte in den Inkubator für 1 h Gerinnsel Unterschicht zu polymerisieren zu ermöglichen. Schütteln Sie well-Platte hart genug, um Blasenbildung zu induzieren nicht; einfach Felsplatte als nötig, bis die Gesamtheit des Brunnens beschichtet ist. Wenn größere Gerinnsel Mengen verwendet werden, kann dieser Schritt nicht notwendig sein.</li>
	<li>Sphäroide auf die Fibrin-Schicht übertragen.
	<ol><li>Entfernen der Brunnen Platte und die Petrischale mit Sphäroide in den hängenden Tropfen Kultur aus dem Inkubator und Sphäroide unter dem Mikroskop zu untersuchen. Legen Sie die Schale in der Kultur-Motorhaube.</li>
		<li>Invertieren vorsichtig den Deckel von der Petrischale für den Zugriff auf die hängenden Tropfen Kulturen.</li>
		<li>Mit einer Nadel 21 G eine 1 mL Spritze sorgfältig übertragen ein Tropfen aus dem umgekehrten Deckel in der Mitte des jeweils gut kümmert sich nicht um die Beschichtung der Unterseite des Brunnens polymerisierten Fibrin-Schicht zu durchbohren. Um den Tropfen effektiv zu übertragen, ziehen Sie die Tropfen in die Nadel. Ziehen den Kolben zurück, sobald der gesamte Rückgang in der Nadel ist zu stoppen; die Tropfen zu weit zurückziehen kann einführen Luftblasen, die effektive Sphäroid Transfer oder nachfolgenden Bildgebung stören können.</li>
		<li>Untersuchen die well-Platte unter dem Mikroskop um sicherzustellen, dass Sphäroide ordnungsgemäß in allen gewünschten Vertiefungen übertragen haben.</li>
	</ol></li> <li>Für die Bildung der zweiten Schicht von Fibrin, erstellen eine andere Gerinnsel Lösung verwenden die gleiche Vorbereitung wie oben für die Erstellung der ersten Fibrin-Schicht (Schritt 3.2). Sorgfältig pipette 100 μL auf jedem Sphäroid-haltigen Tropfen und untersucht unter dem Mikroskop wieder, um sicherzustellen, dass die Sphäroide sind noch intakt und nicht an den Rändern der Brunnen gerückt.</li>
	<li>Rückkehr der well-Platte in den Inkubator und die zweite Schicht für 1 h polymerisieren zu ermöglichen</li>
</ol> 4. 6. Tag: Zugabe von Pro-wandernde oder hemmende Faktoren <ol><li>Warm HDFn Medien auf 37 ° c</li>
	<li>Führen Sie die folgenden Schritte in eine Haube um Kontaminationen zu vermeiden.</li>
	<li>Bereiten Sie Medien für jede Gruppe, einschließlich der entsprechende Konzentrationen von Pro/anti-migratory Agenten zu evaluierenden.</li>
	<li>Entfernen der well-Platte aus Inkubator und in eine Kultur Kapuze.</li>
	<li>Hinzufügen 500 μL der Standardmedien in jede Vertiefung der Kontrollgruppe Sphäroid, 500 μL der hemmenden Medien in jede Vertiefung des Arbeitskreises Migration gehemmt Sphäroid und 500 μl Pro wandernden Medien in jede Vertiefung des Arbeitskreises Migration-enhanced Sphäroid.</li>
	<li>Rückkehr der well-Platte in den Inkubator.</li>
	<li>Änderung Medien alle 48 h.</li>
</ol> 5. 6-9 Tage: Evaluation of Cell Migration und Proliferation <ol><li>Bild Sphäroide mit Hellfeld Mikroskopieren sofort nach Zugabe von Medien (0 h) und dann alle 24 h für 72 h Optional: zu jedem Zeitpunkt eine Z-Stapel-Bild nehmen, um festzustellen, ob Migration ist in Ebenen außerhalb des primären Fokus auftreten. Erfahrungsgemäß tritt dies nicht auf; Es ist jedoch nützlich, um sicherzustellen, dies ist der Fall bei jedem Versuch.</li>
	<li>Einsatz ImageJ Zelle Auswuchs in jede Vertiefung durch Analyse Prozent Zuwachs im Bereich für jedes Sphäroid durch Rückverfolgung der Zellenrahmen für jedes Sphäroid an jedem Punkt Mal in Folge und mit bestimmen die &#34; Maßnahme &#34; Funktion, um die Fläche zu berechnen.</li>
</ol>

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<li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+during+wound+repair%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li>
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<li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li>
<li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
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<li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll ermöglicht die Prüfung der Zellwanderung in der Wundheilung ECMs über eine in-vitro- 3D Modell zugeordnet. Ein entscheidender Schritt für die ordnungsgemäße Durchführung des Verfahrens ist die richtige Entwicklung der Fibroblasten Sphäroide; Zellkonzentration während der Vorbereitung wurde optimiert, um eine Ausgangskonzentration von 2.500 Zellen/Tropfen, geben so dass Sphäroide zu bilden zuverlässig über eine Inkubationszeit von 72 h. Wenn eine unzureichende Anzahl von Zellen verwendet werden, ...

Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der die Wiederherstellung der Gewebe Integrität nach Verletzung führt. Dieser Prozess wird in vier überlappende Phasen Blutstillung, Entzündungen, Verbreitung und Umbau, umgeben aufgeteilt die jeweils geregelt sind durch eine komplexe Kombination von löslichen Queues, Zelle-Matrix Interaktionen und Zell-Zell-Kommunikation. 1 , 2 die Orchestrierung dieser Signale steuert eine Vielzahl von zellulären Reaktionen bei der Wundheilung einschließlich allem Zellmigration. 3 , 4 Zellwanderung ist ein sehr dynamischer Prozess abhängig von zellulären Phänotypen und die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften des extrazellulären Matrix Milieus. 5 Zellen Sonde kontinuierlich ihre extrazellulären Matrix Umwelt durch Integrin-vermittelte Wege; Dieser Prozess ermöglicht Zellen, eine Vielzahl von Matrixeigenschaften einschließlich der Topographie, der Steifigkeit und der Entbindung zu spüren. Zweidimensionale (2D) Analyse der Zellwanderung zeigt, dass die Migration von Lamellipodia Bildung an der Vorderkante durch die Generierung von Aktin-Filament-Bundles angetrieben wird. Nachträgliche Bildung von fokalen Adhäsionen an der Vorderkante, in Kombination mit Actomyosin getrieben Kontraktion ein- und Ausfahren an der Hinterkante treibt die Zelle. 6 dreidimensionale (3D) zelluläre Migration ist derzeit nicht bekannt, jedoch neuere Studien zeigen, dass 3D Migration deutlich anders als die zuvor Mechanismus in 2D beschriebenen und wird wahrscheinlich von alterative Mechanismen gesteuert. Beispiel: neuere Studien von Petrie Et Al. gezeigt, dass je nach den Eigenschaften des ECM, Zellen in 3D Matrizen zwischen Lamellipodium und Lobopodium getrieben Mechanismen der Migration wechseln können. 7 da Zellwanderung ein wesentlicher Bestandteil der Wundheilung Reaktion ist, 3D-Modelle von Zellwanderung sind entscheidend für das Verständnis der physiologischer Reaktionen auf verschiedene Reize bei der Wundheilung. Obwohl Zelle Wanderungsverhalten auf 2D Oberflächen stark variieren von Migration in 3D Matrizen nachgewiesen wurde, nutzen die aktuelle in-vitro- Modelle der Zellwanderung während der Wundheilung, einschließlich der etablierten Scratch Test 2D Monolayer-Kulturen. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 vor kurzem entwickelt Tests eine 3D Matrix verwendet haben, aber noch Kulturzellen in einer Monolage auf der Matrix begrenzt somit die Fähigkeit, wirklich die Dreidimensionalität der Zelle Umwelt rekapitulieren in-vivo. 15
Die hier beschriebene Methode soll Zellwanderung in einem physiologisch relevanten 3D-Modell, anstatt auf eine 2D Oberfläche zu studieren, um ein robuster Verständnis von Migration Antworten verbunden sind mit den angewandten reizen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Zellwanderung innerhalb einer 3D Fibrin-Gerinnsel-Matrix im Beisein von Faktoren, die zu aktivieren oder hemmen Wege Zellwanderung zugeordnet. Für diese Methode durch die kritische Rolle der Fibrin in den frühen Phasen der Wundheilung wurde eine Fibrin-Matrix gewählt; Folgende Verletzungen, ein Fibrin-Gerinnsel entsteht innerhalb der Umgebung der Wunde Blutverlust einzudämmen und dient als Gerüst für die erste Zelle eindringen während der Reparatur von Gewebe und Umbau. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , Darüber hinaus 20 Fibrin wird klinisch als eine chirurgische Dichtungsmittel verwendet und die Zusammensetzung der Dichtstoffe Zellwanderung und ultimative Heilung Ergebnisse gebunden worden ist. Einer früheren Studie von Cox Et Al. Migration von Fibroblasten mit Fibrin Gerinnsel bestehend aus unterschiedlichen Fibrin und Thrombin Konzentrationen zum Zwecke der Optimierung ein Fibrin Dichtungsmittel untersucht. In diesen Studien wurde die Wanderung von Zellen aus Fibrin Gerinnsel auf Plastikschalen quantifiziert. 20 hier präsentieren wir eine Methode, die zur Quantifizierung der Migration von Zellen innerhalb der 3D Fibrin-Umgebung ermöglicht. Während die Methode, die speziell in diesem Protokoll beschriebenen Fibrin verwendet, kann dieses Modell leicht geändert werden, um alternative Matrixmaterialien zu verwenden, wie gewünscht, z. B. Kollagen oder andere 3D Matrizen. Darüber hinaus präsentieren wir die Verwendung von Fibroblasten Sphäroide in diesem Assay, weil Fibroblasten Migration in das Wundbett für Synthese der extrazellulären Matrix und Gewebe Reparatur/Umbau von höchster Bedeutung ist. Jedoch während der Reparatur sind Prozess Neutrophile die erste Zelle Art in das Wundbett, gefolgt von Makrophagen wandern. Fibroblasten beginnen dann die Wundumgebung ca. 48 Stunden nach der ersten Verletzung zu Beginn der Proliferativen Phase der Wundheilung zu infiltrieren. 19 dieser Assay kann leicht geändert werden, um zählen Neutrophile, Makrophagen oder anderen Zelltypen zu beurteilen, wie Änderungen in Fibrin Gerinnsel Struktur Migration dieser Zelltypen beeinflussen. 21
Um diesen Test zu implementieren, wird zunächst ein Sphäroid Fibroblasten gebildet eine Modifikation der zuvor beschriebenen für Stammzelle-Kultur Techniken. 22 Fibroblasten Sphäroid wird anschließend in einer 3D Fibrin-Matrix übertragen, und Auswuchs kann dann leicht überwacht und über mehrere Tage quantifiziert. Dieses Protokoll berücksichtigt die 3D physiologische Systeme durch das Einbetten von 3D Zelle Sphäroide innerhalb einer Fibrin-Matrix, wodurch die Einschränkungen in Relevanz durch eine mit einer 2D Wachstumsoberfläche eine Zelle Monolage auf Modell Wanderungsverhalten herbeigeführt, zwar noch ermöglicht zur Auswertung der Zelle Verhalten in einer streng kontrollierte in-vitro- Umgebung.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4,5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvat, ohne L-Glutamin</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>DMEM, das bereits L-Glutamin enthält, kann auch verwendet werden</td></tr><tr><td>100mm Gewebekulturschale, unbehandelt, sterilisiert, nicht pyrogen</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>Schalen jeder Größe können zum Aufhängen von Tropfenkulturen verwendet werden&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum aus USDA-zugelassenen Ländern, hitzeinaktiviert, steril gefiltert, zellkulturgetestet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Fisher Scientific ICN1680149</td><td></td><td>Nicht erforderlich, wenn DMEM verwendet wird, das bereits L-Glutamin enthält&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung, stabilisiert, steril filtriert, mit 10.000 Einheiten Penicillin und 10 mg Streptomycin/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Humane dermale Fibroblasten, Neugeborene</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>Kann durch einen anderen Zelltyp von Interesse ersetzt werden</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2' Nadel</td><td>BD&nbsp;</td><td>305167</td><td>22 G x 1 1/2 Nadeln funktionieren auch</td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>Spritzen beliebiger Volumina können verwendet werden</td></tr><tr><td>Zellkultur-Multiwell-Platten, Polystyrol, Greiner Bio-One (individuell verpackt) (48 Wells)</td><td>VWR</td><td>82051-004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Fibrinogen - Plasminogen, Von-Willebrand-Faktor und Fibronektin Depleted</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB 3</td><td>Kann durch Matrixprotein von Interesse ersetzt werden</td></tr><tr><td>Human Alpha Thrombin</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>HT 1002a</td><td>Abhängig vom Matrixprotein von Interesse ist möglicherweise nicht erforderlich</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSL2 Zellkulturhaube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop mit 10-fach Objektiv</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugen-kompatibel mit 15-ml-Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zellwanderung in dreidimensionales in vitro charakterisierung wunde umgebungen

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Derzeit die meisten in-vitro- Modelle der Wundheilung, wie etablierte Scratch-Assays, Studium Zelle Migration und Wunde Schließung auf zweidimensionalen Flächen beinhalten. Allerdings ist die physiologische Umgebung welche in Vivo Wundheilung erfolgt dreidimensional als zweidimensionale. Es wird immer deutlicher, dass Zelle Verhalten unterscheidet sich stark in zweidimensionalen vs. dreidimensionale Umgebungen; Daher gibt es eine Notwendigkeit an mehr physiologisch relevanten in-vitro- Modelle für das Studium Zelle Migration Verhaltensweisen in Wundverschluss. Die hier beschriebene Methode ermöglicht das Studium der Zellwanderung in einem dreidimensionalen Modell, das physiologische Bedingungen besser als vorher festgelegten zweidimensionale Scratch Assays widerspiegelt. Dieses Modell soll Zelle Auswuchs über die Prüfung der Zellmigration Weg ein Sphäroid Körper eingebettet innerhalb einer Fibrin-Matrix im Beisein von Pro oder anti migratory Faktoren zu bewerten. Mit dieser Methode Zelle Auswuchs aus dem Sphäroid Körper in einer dreidimensionalen Matrix beobachtet werden und im Laufe der Zeit durch Brightfield Mikroskopie und Analyse von Sphäroid Körperbereich leicht quantifizierbar ist. Die Wirkung von Pro-wandernde oder hemmende Faktoren auf Zellwanderung kann auch in diesem System ausgewertet werden. Diese Methode bietet eine einfache Methode des Analysierens Zellwanderung in dreidimensionale Wunde verbunden Matrizen in-vitro-Forscher, wodurch sich die Relevanz der in-vitro- Studien Zelle vor der Verwendung von in-Vivo -Tier Modelle.

Sphäroid Kultur kann genutzt werden, um die Wirkung der pro und Anti-wandernde Agenten auf Fibroblasten Migration in-vitro-erfolgreich bewerten 3D Fibroblasten Sphäroide können gebildet werden, über hängende Tropfen Kultur über einen Zeitraum von 72 h (Abbildung 1). Im Anschluss an die Kulturdauer Sphäroide innerhalb der Gerinnsel-Matrix eingebettet sind und abgebildet mit Brightfield Mikroskopie (Abbildung 2)...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Pro und anti migratory Faktoren auf Zellwanderung innerhalb einer dreidimensionalen Fibrin-Matrix bewerten.

Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirkung bestimmter Behandlungen auf die Zellmigration in einem dreidimensionalen, wundassoziierten Fibrin-Gerüst zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Wundheilung zu beantworten, beispielsweise wie Veränderungen in der Fasernetzwerkstruktur die Zellmigration in Fibringerinnsel an Wundstellen beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache und reproduzierbare Methode zur Analyse der Zellmigration innerhalb von Fibringerinnseln in 3D bietet. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das Übertragen der Sphäroide anspruchsvoll sein kann.Beginnen Sie damit, ein Gefäß mit gefrorenen neonatalen humanen dermalen Fibroblasten im Wasserbad bei 37 Grad Celsius aufzutauen. Sobald die Zellen gerade aufgetaut sind, sammeln Sie sie durch Zentrifugation ein und resuspendieren das Zellpellet in frischem Kulturmedium für neonatale humane dermale Fibroblasten mit einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Anschließend werden die Zellen in einem T75-Kulturgefäß ausgesät und 72 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert.Wenn die Kultur eine Konfluenz von 80 % erreicht hat, lösen Sie die Zellen mit fünf Millilitern Trypsin-EDTA ab. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius neutralisieren Sie das Trypsin mit fünf Millilitern vorgewärmtem Medium und mischen 40 Mikroliter Zellen im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau. Heben Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot der Zellen zur Zellzählung auf.Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einer Konzentration von 1,25 × 10⁵ Zellen pro Milliliter. Anschließend befüllen Sie den Boden einer 10 cm Petrischale mit fünf Milliliter steriler PBS. Danach kehren Sie den Deckel der Petrischale um und geben mehrere Tropfen à 20 Mikroliter der Zellsuspension auf die innere Oberfläche des Deckels.Wenn alle Tropfen aufgetragen wurden, das Deckglas erneut vorsichtig auf die Schale setzen, wobei darauf geachtet werden muss, dass die hängenden Tropfen nicht gelöst werden, und die Schale vorsichtig für 72 Stunden in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator stellen. Am Ende der Inkubation 100 Mikroliter Gerinnungslösung pro Sphäroid pro Vertiefung einer 48-Loch-Platte hinzufügen und die Platte vorsichtig schütteln und antippen, um sicherzustellen, dass die Fibringerinnungsmischung die gesamte Vertiefung bedeckt. Die Platte für eine Stunde in den Inkubator stellen.Nachdem die Gerinnungsschicht polymerisiert hat, überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop das Vorhandensein von Sphäroiden in der Hängetropfkultur und bringen Sie die 48-Loch-Platte sowie die Hängetropfkulturschale in eine Zellkulturbank. Drehen Sie den Petrischalendeckel vorsichtig um, um Zugang zu den Hängetropfkulturen zu erhalten, und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 21-Gauge-Nadel, um einen Tropfen in jedes fibrinbeschichtete Loch zu überführen. Ich achte besonders darauf, die Sphäroide vorsichtig zu aspirieren und zu platzieren, da der schwierigste und kritischste Schritt des Verfahrens darin besteht, die Sphäroide zu übertragen, ohne sie zu beschädigen.Überprüfen Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Sphäroide korrekt in die entsprechenden Vertiefungen eingesät wurden. Schichten Sie vorsichtig 100 Mikroliter frisch zubereitete Gerinnungslösung auf jeden Tropfen mit Sphäroiden und überprüfen Sie erneut die Sphäroide unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass sie weiterhin intakt sind und sich in der Mitte jeder Vertiefung befinden. Danach bringen Sie die 48-Loch-Platte zurück in den Inkubator, um die Polymerisation der zweiten Fibrinschicht zu ermöglichen.Nach einer Stunde jede Vertiefung mit 500 Mikrolitern des entsprechenden Mediums für die jeweilige experimentelle Sphäroid-Gruppe behandeln und die Platte in den 37 Grad Celsius warmen Inkubator zurückbringen. Erhalten Sie alle 24 bis 72 Stunden Bilder der Sphäroide mittels Hellfeldmikroskopie, wobei ein Z-Stack verwendet wird, um aufeinanderfolgende Querschnitte der dreidimensionalen Zellkultur zu betrachten. Anschließend die Zellgrenze jedes Sphäroids in jeder aufeinanderfolgenden Zeitspanne mit geeigneter Bildanalyse-Software nachzeichnen und mithilfe der Messfunktion den prozentualen Flächenzuwachs für jedes Sphäroid ermitteln.Nach der Kultur in dem jeweiligen pro- oder anti-migratorischen Wirkstoff von Interesse können die Anfangsflächen der Sphäroide mittels Hellfeld-Mikroskopie erfasst und als Referenz zur Bestimmung des Ausmaßes des nachfolgenden Zellauswuchses aus den Sphäroidkörpern zu jedem zeitlich aufeinanderfolgenden Zeitpunkt herangezogen werden. In diesem repräsentativen Experiment zeigten die Sphäroide, die einem pro-migratorischen Wirkstoff ausgesetzt waren, im Vergleich zu den Sphäroiden, die einem migrationshemmenden oder Kontrollwirkstoff ausgesetzt waren, ein signifikant erhöhtes Maß an Migration von dem ursprünglichen Sphäroidkörper weg. Umgekehrt wiesen die Sphäroide, die einem anti-migratorischen Wirkstoff ausgesetzt waren, im Vergleich zu den mit Kontrollmittel behandelten Sphäroiden eine signifikant verminderte Migration von dem ursprünglichen Sphäroidkörper weg auf.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in zweieinhalb Stunden abgeschlossen werden, ohne die Zeit für die Zellkultur einzuschließen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellsphäroide kultiviert und einbettet, um dreidimensionale in-vitro-Zell-Migrationsassays durchzuführen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie histologische und immunhistochemische Verfahren angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie die Struktur des Fibrinnetzwerks innerhalb des Gerinnsels oder die Aktin-Ausrichtung in den Zellen des Sphäroids mit einer erhöhten oder verringerten Zellmigration zusammenhängen.Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Zellkulturen und Nadeln äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen der geeigneten Schutzausrüstung und das Arbeiten in einer sterilen Sicherheitswerkbank getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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