Fern Magnetische Betätigung des Mikrometrische Sonden für

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, in C zwei Messungen der lokalen physikalischen Eigenschaften eines bakteriellen Biofilms auf mikrometrischer Skala durchzuführen. Dazu werden magnetische Partikel in einen wachsenden Biofilm eingebracht, um als Sonden zu dienen, die berührungslos aktiviert werden können, ohne die strukturellen Eigenschaften des Biofilms zu stören. Anschließend werden spezielle magnetische Pinzetten verwendet, um eine definierte Kraft auf jedes Partikel auszuüben.

Bei in der Biofilm-Matrix eingebetteten Partikeln wird die durch magnetisches Ziehen verursachte Partikelverschiebung mittels Videomikroskopie verfolgt, um die lokalen viskoelastischen Parameter zu ermitteln und die räumliche 3D-Verteilung der mechanischen Eigenschaften des Biofilms zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die mechanische Heterogenität des E. coli-Biofilms und liefern Hinweise darauf, welche Biofilmkomponenten die physikalischen Eigenschaften des Biofilms tragen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie Mikroskopie, Rheologie oder Analysen ganzer Biofilmverbände besteht somit darin, dass sie die räumliche Verteilung der mechanischen Eigenschaften in situ erfasst, ohne die ursprüngliche Struktur des Materials zu stören.

Um magnetische Partikel für dieses Protokoll vorzubereiten, wirbeln Sie die Bestandsflasche mit 2,8 Mikrometer großen Partikeln kräftig um, um sie erneut in Suspension zu bringen. Übertragen Sie anschließend 10 Mikroliter in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Um die Partikel zu waschen, geben Sie 190 Mikroliter Minimalmedium hinzu und schwenken Sie das Röhrchen leicht. Stellen Sie es dann auf einen magnetischen Probenträger, warten Sie, bis sich ein Pellet gebildet hat, und aspirieren Sie die Überstandslösung.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch zweimal und resuspendieren Sie die Perlen in 190 Mikrolitern Minimalmedium. Geben Sie anschließend 950 Mikroliter M 63 B1 mit 0,4 % Glukose zu 50 Mikrolitern der gewaschenen Perlenlösung, um die Partikelkonzentration auf etwa 5 Millionen Perlen pro Milliliter einzustellen. Zum Vorbereiten des Kanals verwenden Sie einen Diamantschneider, um zwei quadratische Borosilikatglas-Kapillaren mit einer Länge von jeweils 10 Zentimetern zu schneiden, sodass zwei 8 Zentimeter lange Stücke entstehen.

Halbieren Sie mithilfe des Glasschneiders einen Objektträger. Befestigen Sie anschließend die beiden Kapillarstücke mit einem schnell härtenden Cyanacrylat-Kleber oder Superkleber an zwei Objektträgern, wie in diesem Diagramm dargestellt. Autoklavieren Sie die gesamte Vorrichtung sowie die erforderlichen Schläuche, wobei die Abstände zwei Zentimeter betragen und an beiden Enden ein Überstand von einem Zentimeter vorhanden ist.

Sammlen Sie für die weitere Kanalverbindung die folgenden sterilen Materialien unter einer laminaren Luftströmungshaube. Dazu gehören die montierten Kanalschläuche und -verbinder, zwei pädiatrische Blasenfilter oder -fänger, zwei Schellen, 30-Milliliter-Spritzen, gefüllt mit M 63 B, 1,4 % Glucose, sowie die Abflasche.

Verbinden Sie die beiden Kapillaren auf die gleiche Weise. Verwenden Sie dazu einen der Schläuche. Schließen Sie die Abflasche an ein Kapillarenden an.

Danach unter Verwendung von Lure-Lock-Verbindern als Übergänge das andere Ende der Kapillare mit der selbstgebauten Blasenfalle oder Falle eins und Falle eins mit Falle zwei verbinden. Anschließend die 30-Milliliter-M-63-B1-Spritze mit Falle zwei verbinden. Danach die Apparatur mit steriler M-63-B1-Lösung mit 0,4 % Glukose füllen.

Befestigen Sie die Spritze an der Spritzenpumpe und schalten Sie die Spritzenpumpe mit einer Rate von etwa fünf Millilitern pro Stunde höher als den experimentellen Raten ein. Verfolgen und entfernen Sie bei Bedarf sorgfältig alle Blasen im Kreislauf. Trennen und verbinden Sie den Kreislauf erneut, während Sie dieses Verfahren durchführen.

Entfernen Sie sorgfältig alle Blasen vor und während des Einbringens der Zellpartikel-Mischung in die Schläuche. Es ist hilfreich, den Abfallbehälter über den Kapillaren zu platzieren, um das kontinuierliche Wachstum des Biofilms zu unterstützen. Lassen Sie das Medium 10 bis 15 Minuten lang durch das System fließen. In der Zwischenzeit mischen Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen ein Milliliter der bakteriellen Suspension mit einer optischen Dichte von 0,5 mit einem Milliliter der zuvor hergestellten gewaschenen Perlenlösung.

Schalten Sie den Durchfluss aus, befestigen Sie den Schlauch erneut und schließen Sie anschließend die Klemmen. Füllen Sie danach eine Ein-Milliliter-Spritze mit der Bakterien-Perlen-Mischung und geben Sie diese in die Kapillare ein. Bringen Sie das Gerät nach der selbstgebauten Blasenfalle dort zum Mikroskop.

Befestigen Sie die Kapillare am Mikroskopständer und platzieren Sie den Abfallbehälter auf einer leicht höheren Ebene. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf die Arbeitsplatte neben das Mikroskop. Lassen Sie die Apparatur 15 bis 20 Minuten stehen, damit sich die Bakterien absetzen und an der Oberfläche der Kapillare anheften können.

Sobald die Bakterien an der Kapillare angeheftet sind, öffnen Sie die Klemmen, stellen Sie die Flussrate an der Spritzenpumpe ein und starten Sie den Fluss. Innerhalb von 24 bis 48 Stunden bildet sich ein Biofilm auf der Oberfläche der Kapillare, fokussieren Sie auf die untere Ebene der Kapillare und beginnen Sie die zeitraffende Aufnahme der Probenbilder. Üblicherweise wird das Biofilmwachstum ausreichend durch eine Aufnahmefrequenz von zwei Bildern pro Minute erfasst.

Dieses Video zeigt das Anfangsstadium des Biofilms unmittelbar nach der Injektion der Zell-Partikel-Mischung. Bei der Kapillar-Aufnahme beträgt die Frequenz ein Bild pro Sekunde, und das Video wird mit 10 Bildern pro Sekunde abgespielt. Nach vier Stunden Wachstum lösten sich die Partikel schrittweise von der Oberfläche und verteilten sich im Biofilm-Volumen.

Die blauen Pfeile markieren Ablöseereignisse. Hier beträgt die Aufnahmefrequenz zwei Bilder pro Minute, und der Film wird mit 15 Bildern pro Sekunde abgespielt. Nach 20 Stunden Wachstum können in einer Fokusebene ein Dutzend gleichmäßig verteilter Partikel beobachtet werden.

Dieses Video wurde in einer mittleren Ebene, 20 Mikrometer über dem Kapillarboden, aufgenommen. Es wurden zwei Bilder pro Minute aufgezeichnet. Das Video wird mit 15 Bildern pro Sekunde abgespielt.

Sobald der mit magnetischen Partikeln besiedelte Biofilm manuell wächst, schrauben Sie die magnetischen Pinzetten auf die Mikroskopbühne. Um sicherzustellen, dass im Beobachtungsbereich die geeigneten magnetischen Feldgradienten erzeugt werden, platzieren Sie die Pinzetten wie in diesem Diagramm gezeigt, wobei der in Rot dargestellte Messbereich sich 300 Mikrometer von den Rändern der linken und rechten Pole der Pinzetten entlang der Y-Achse entfernt befindet. Das untere Ende des Kapillarrohrs wird 200 Mikrometer unterhalb des unteren Endes der Pinzetten positioniert.

Um diesen Schritt durchzuführen, verwenden Sie die XY-Bewegungssteuerung des Mikroskopstages, um die Kante des linken magnetischen Pols und den linken Rand der Kapillare in Deckung zu bringen. Passen Sie im selben Beobachtungsfeld mithilfe des X-Reglers des linken Mikromanipulators der Pinzette die Position des Pols auf einen Abstand von 300 Mikrometern von der Kante der Kapillare an. Führen Sie dieselbe Prozedur auf der rechten Seite durch.

Danach justieren Sie die Position der Pinzette entlang der Z-Achse in Bezug auf das untere Ende des Kapillarrohrs. Richten Sie zunächst das untere Ende der Pole mit dem unteren Ende des Kapillarrohrs aus und verschieben Sie die Pole um 200 Mikrometer nach oben.

Stellen Sie mit dem Z-Regler des Mikromanipulators die Parameter des Funktionsgenerators auf 24 Sekunden Nullsignal und 16 Sekunden vier Ampere ein. Gleichstrom mit Auslöser. Senden Sie nach 20 Sekunden an den Verschluss des Hellfeldlichts.

Verbinden Sie die Pinzette über den Leistungsverstärker mit dem Funktionsgenerator, um eine Signalsynchronisation zu erreichen. Achten Sie darauf, die Pole korrekt in Reihe zu schalten, um räumlich verteilte Kriechkurven aufzuzeichnen. Wählen Sie einen räumlichen Ursprung und legen Sie den Ursprung der Z-Achse an die innere Unterseite des Kapillarrohrs.

Notieren Sie die Z-Position der Mikroskopsteuerung. Suchen Sie dann den Schnittpunkt der X- und Y-Achse, die jeweils durch die Kante des Kapillarrohrs und die Kante des Polstücks definiert sind. Dies ist der Ursprung der Analyse.

Notieren Sie die Koordinaten. Alle folgenden Koordinaten werden in Bezug auf diesen Ursprungspunkt ermittelt. Sobald der Biofilm gewachsen ist, stellen Sie mithilfe des Feinfokussierknopfs die vertikale Position der Kapillare so ein, dass die erste Ebene vier bis sieben Mikrometer über dem Kapillarenboden liegt.

Diese Schnittansicht entspricht der Biofilmschnittansicht, bei der der Ursprung des räumlichen Koordinatensystems in der oberen linken Ecke liegt. Schalten Sie dann den Stromgenerator ein und starten Sie manuell die Bildaufnahmesequenz. Um die 42. Ereignissequenz zu starten, entspricht der hier aufgezeichnete Bildstrom einer bestimmten Ebene und einem XY-Bereich.

Nachdem die Sequenz aufgezeichnet wurde, bewegen Sie die Kapillare, um ein Video des neuen Feldes aufzunehmen. Wiederholen Sie diesen Vorgang fortlaufend, um alle erforderlichen Videos zur Datenanalyse zu erhalten. Öffnen Sie die Bilder in ImageJ oder einer vergleichbaren Software zur Partikelverfolgung für alle erfassten Stapel aller Partikel.

Wandeln Sie die Bilder in Textdateien um, indem Sie die Teilchenverschiebung verfolgen. Verwenden Sie anschließend eine Datenverarbeitungssoftware, um die Verschiebungskurven aufzuzeichnen und diese in Nachgiebigkeitskurven umzuwandeln, wobei die Gesamtnachgiebigkeit des Materials JFT als Funktion der Zeit gemäß der hier gezeigten Nachgiebigkeitsformel berechnet wird. Diese Formel beschreibt den Zusammenhang zwischen der angelegten Spannung und der Materialdehnung für ein historisches Teilchen von roten oder in das viskoelastische und inkompressible Medium eingebetteten Teilchen, wie zuvor von ihm und seinen Kollegen festgestellt wurde. Durch Anpassung der Kriechnachgiebigkeitskurve an das allgemeine Burgers-Modell für viskoelastische Materialien lassen sich die viskoelastischen Parameter J null, J eins, η null und η eins ableiten, um die räumliche Verteilung der viskoelastischen Eigenschaften bereitzustellen. Kriechkurven wurden in verschiedenen Tiefen innerhalb eines Biofilm-Mikrovolumens von etwa 200 × 200 × 40 Kubikmikrometern aufgezeichnet. Typische Ergebnisse sind hier dargestellt.

Die Werte von J null, der elastischen Nachgiebigkeit, sind als Funktion der Z-Achse entlang der Tiefe und der Y-Achse entlang einer lateralen Dimension des Biofilms angegeben. Jeder Punkt entspricht einer Bead, für die die Analyse der Kriechkurve einen J-null-Wert geliefert hat. Die Daten zeigen, dass die lokale Nachgiebigkeit entlang der Tiefe des Biofilms um nahezu drei Größenordnungen variiert.

Außerdem trat eine starke laterale Heterogenität in allen Biofilmmächtigkeiten auf. Die Daten liefern zudem die Verteilung der Compliance-Werte, die eine breite und asymmetrische Form aufweisen. Der Vergleich dieser Ergebnisse mit zuvor an anderen biologischen Polymeren erhaltenen Ergebnissen legt nahe, dass die mechanischen Eigenschaften des Biofilms auf hochgradig vernetzten Polymergelen beruhen.

Bei C wurden zwei Messungen des Biofilms durchgeführt, und lokale Eigenschaften wurden ebenfalls unter verschiedenen Umweltbedingungen untersucht, beispielsweise bei geringerer Durchflussrate, wie hier zu sehen ist. Die Compliance-Werte eines Biofilms, der bei 0,1 Milliliter pro Stunde gewachsen ist, weisen weiterhin ein stark heterogenes mechanisches Profil auf. Der deutliche Z-Tiefenabhängigkeit der Biofilmsteifigkeit, die bei dem bei einem Milliliter pro Stunde gewachsenen Biofilm beobachtet wurde, ist jedoch verschwunden.

Diese Ergebnisse zeigen den erheblichen Einfluss der äußeren Bedingungen auf die Biofilmbildung. Nach dem Anschauen des Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Visco-Eigenschaften des Biofilm-Instituts unter vollständig kontrollierten Wachstumsbedingungen kartieren kann.