Name: Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO 2 Substrate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Lernen Sie die Zellmusterung auf SiO₂-Substraten mit Parylen-C für biomedizinische Forschung. Diese photolithografische Methode ermöglicht kontrollierte Zelladhäsion und reduziert Kontaminationsrisiken im Reinraum.

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Diese Arbeit wurde durch ein Wellcome Trust Klinische Promotionsstipendium (ECAT) unterstützt.

1. Herstellung von Parylene Muster auf SiO 2: Ablauf (siehe Abbildung 1) <ol><li> Design-Wunsch Parylene-C-Konfiguration mit einem Layout-Editor-Software-Paket, der fähig ist Lesen / Schreiben CIF (Caltech Zwischenform) oder GDS-II (Grafik Datenbanksystem-II)-Dateien. CIF und GDS-II sind Industriestandard-Dateiformate für die integrierte Schaltung Grafik-Layout. </li><li> Kommission Photomaske herzustellen, um eine geeignete Anlage Mikroelektronik, oder machen Sie im Haus, wenn Einrichtungen vorhanden sind. </li><li> Oxidieren einen Silizium-Wafer in einem atmosphärischen Horizontalofen (H 2 1.88 SLM und O 2 1,25 SLM) bei 950 ° C für 40 min, um eine 200 nm SiO 2-Schicht (Dicke bestätigen mit einer kleinen Spot-spektroskopische Reflektometer) zu produzieren. </li><li> Prime das oxidierte Wafer mit einem Silan-Haftvermittlers. Jetzt einzahlen Parylen-C auf 22 ° C bei einer Rate von 1,298 nm / mg Dimer unter Verwendung einer Vakuumabscheidungssystem speziell für Parylen abzulagern. A 100nm dicke Parylene-C-Beschichtung wurde für alle unten gezeigten Beispiele verwendet. </li><li> Nächste Einzahlung Hexamethyldisilazan (HMDS) Haftvermittler auf der Parylen-beschichtete Wafer mit einem geeigneten Photoresist-Beschichtungssystem. </li><li> Jetzt dreht den Wafer bei 4000 Upm für 30 sec, während die Anwendung positiven Photoresist (was zu einer theoretischen Dicke von 1 &amp;mgr; m) unter Verwendung der gleichen Fotolackbeschichtungssystem, wie oben beschrieben. </li><li> Softbake der Wafer für 60 Sekunden bei 90 ° C. </li><li> Legen Sie sowohl die Wafer-und Foto vorgefertigte Maske in einem Mask Aligner. </li><li> Belichten den Photoresist-beschichtete Wafer mit einer UV-negativen Darstellung des gewünschten Parylen-C-Konfiguration. </li><li> Backen belichteten Wafer 60 Sekunden lang bei 110 ° C. </li><li> Entfernen Sie alle belichtete Fotolack von dem Wafer durch die Entwicklung in einer geeigneten Entwicklerlösung. </li><li> Ätzen von der ungeschützten Parylene. Verwenden Sie ein Sauerstoffplasma Etch-System (bei ​​einem Kammerdruck 50 Torr, 49 sccm O 2, 100 W HF-Leistung bei 13,56 MHz undeine Ätzrate von 100 nm / min), um die darunter liegende SiO 2 offenbaren. </li><li> Würfeln Wafer unter Verwendung eines geeigneten Schneidsäge (Spindeldrehzahl 30.000 min, Vorschubgeschwindigkeit 7 mm / s). </li><li> Spülen Chips in deionisiertem H 2 O und trocken blasen mit Stickstoff. </li><li> Shop-Chips (unbegrenzt) in staubfreien Schachteln, bis sie benötigt. </li></ol> 2. Chip Reinigung und Aktivierung: Protokoll <ol><li> Rückstände von Photoresist von Chips durch Waschen in Aceton für 10 Sekunden. </li><li> Spülen in entionisiertem destilliertem H 2 O 3x. </li><li> Make-up frisch Piranha-Säure (a 05.03 Quote von 30% Wasserstoffperoxid und 98% Schwefelsäure). ACHTUNG: Bereiten Piranha-Säure mit großer Sorgfalt. Es ist ein extrem starkes Oxidationsmittel, stark sauer ist, und Mischen von Wasserstoffperoxid mit Schwefelsäure eine exotherme Reaktion ist. Führen Sie diesen Schritt in einem sauren Abzug. Lassen Sie 2 min nach dem Mischen der Piranha-Säure passieren aber verwenden Sie innerhalb von 20 min. </li><li> Reinigen und Ätzen Chips durch Eintauchen in piranha Säure für 10 min. </li><li> Spülen Chips 3x in VE-H 2 O und übertragen in eine sterile Kulturschale. </li><li> Aktivieren Sie nun Chips für Mobil Musterung. Fügen Sie beispielsweise zwei Chips pro Vertiefung einer 6-Well-Platte und dann 2 ml fetales Rinderserum, um alle Chips voll einzutauchen. Führen Sie das, und alle nachfolgenden Stufen der Zellkultur, unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Gewebekultur Kapuze. </li><li> Chips in Serum für 3-12 h bei 37 ° C. HINWEIS: Schritte 2,4-2,7 sollten nacheinander und ohne Verzögerung zwischen den Schritten durchgeführt werden. Wenn Serum Aktivierung wird durch ≥ 24 h verzögert, nachdem Piranha-Behandlung, Zell Strukturierung aufgrund der reduzierten Zell Abstoßung von SiO 2-Regionen beeinträchtigt. Alternative Lösungen Aktivierung spezifischer Zellhaftproteine ​​enthält, kann anstelle des fötalen Rinderserum verwendet werden. Solche Lösungen verändern die Zellhaftungseigenschaften der zwei kontras Substraten (siehe repräsentative Ergebnisse für ein Beispiel). </li&gt; </ol> 3. Plating Zelllinien On-Chip: Protokoll <ol><li> Chips entfernen von ihren Aktivierungslösung und einmal waschen für 10 Sekunden in Hanks Balanced Salt Solution. </li><li> Zeigen Chip in einer Kultur gut und Platte gewählt Zelltyp als Suspension in seiner üblichen Wachstumsmedien. Optimale Zell Beschichtungs-Dichte hängt sowohl vom Zelltyp und geometrische Muster der Parylene-C auf dem Chip. Einer Dichte von 5 x 10 4 Zellen / ml ist ein vernünftiger Ausgangspunkt. </li><li> Imaging ist auf die zugrunde liegende Motivation für die Zell Musterung aber Lebendzellverhalten kann leicht mit einem Binokular und eine Digitalkamera mit einem geeigneten Relais-Linse beurteilt werden zugeschnitten. </li></ol>

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<li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C%2Fsilicon+dioxide+substrates%3A+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Immersion von Chips in Piranha-Säure dient nicht nur, um restliche organische Material zu entfernen, sondern auch ätzt der Substratoberflächen. Dies ist der Schlüssel, um eine effektive Aktivierung mit fetales Rinderserum. Andernfalls verhindert Zell-Strukturierung und verändert das Verhalten der Zelle auf dem Chip zutiefst. Es ist nicht erforderlich, um Chips nach der Reinigung mit Piranha-Säure zu sterilisieren. Tatsächlich Sterilisation durch UV-Exposition wurde gezeigt, dass Zell Strukturierung in einer Dosis-abhängigen Weise 13 zu untergraben. Es ist darauf zu nach der Photolithographieprozess abwaschen gesamte restliche Photolack werden. Die anhaltenden Photoresist als unerwünschte Zyto-Klebeschicht, die Strukturierung durch parylene-C/SiO 2 Geometrie diktiert schreibt handeln. Aceton ist wirksam, wenn sie unter Verwendung der oben und mit den angegebenen Reagenzien beschrieben Photolithographieprozess. Jedoch können andere Arten von Photoresist erfordern eine andere Lösungsmittel. Um die Wirkung und den Erfolg der differe bewertennt Herstellungsschritte kann der Kontaktwinkel der zwei kontras Substraten gemessen werden. Fig. 2 zeigt die Veränderungen, die während des Chipaktivierungsprozess auftreten. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass spezifische Haft und abstoßenden Proteinkomponenten im Serum schließlich ermöglichen die Parylene-Chip strukturiert, um in das Zyto-Klebstoff oder Zyto-abstoßenden Eigenschaften ausüben. Alle repräsentative Ergebnisse verwendeten Chips mit einer Parylene Dicke von 100 nm, allerdings haben wir erfolgreich sowohl mit dickeren und dünneren Parylenschichten gemustert. Wichtig ist, ermöglicht diese photolithographischen Ätztechnik viel größere dreidimensionale Steuerung von Parylen als hier die Konfiguration veranschaulicht. Beispielsweise unter Verwendung einer Kombination von Photomasken, ist es möglich, Parylen Regionen Misch Dicke zu schaffen. Dies öffnet den Weg zur Schaffung Zellkulturen mit definierten dreidimensionalen Topographie, über die einfache Diktieren Regionen der Zelladhäsion / Abstoßung gehension, die möglicherweise eine Mittel zur Integration von mikrofluidischen Kanälen in das Konstrukt. Wie gezeigt, ist dies jedoch nicht Strukturierungs Plattform universell wirksam für Zelltypen. Verschiedene Zelllinien, mit ihren vielfältigen cell adhesion molecule-Profile, wenig überraschend anders verhalten, wenn auf dieser Plattform kultiviert. Wir haben noch nicht identifiziert die wichtigsten Komponenten im Serum, noch die kostenlose Zellmembran-Rezeptoren, die diese Zelle Strukturierungsplattform zu untermauern. Dies in Zukunft verspricht, seinen Nutzen und Spezifität zu erweitern. Zum Beispiel könnte ein &quot;Nicht-Muster&quot; Zelllinie genetisch modifiziert werden, um die erforderliche Adhäsionsmolekül zu exprimieren und so die Förderung Strukturierung.

Mechanismen zu verstehen, die die Zelladhäsion und Strukturieren diktieren synthetischer Materialien ist für Anwendungen wie beispielsweise Gewebe-Engineering, Arzneimittelforschung und die Herstellung von Biosensoren 1-3. Viele Techniken sind verfügbar und weiterentwickelt, die jeweils unter Ausnutzung der unzähligen biologischen, chemischen und physikalischen Faktoren, die Zelladhäsion zu beeinflussen. Hier beschreiben wir eine zellStrukturierungsTechnik, die ursprünglich für die Mikroelektronik-Fertigung Zwecke entwickelte Verfahren nutzt. Als solches ist die Plattform gut positioniert, um stromabwärts Integration von mikroelektronischen Technologien wie MEAs zu ermöglichen, in die Muster Plattform. Die Schnittstelle zwischen einer Zelle und einer benachbarten Membranmaterial ist bidirektional und komplex. In vivo extrazellulären Matrixproteinen bereitzustellen Struktur und Festigkeit und Auswirkungen auf das Verhalten der Zelle über Wechselwirkungen mit Zelladhäsionsrezeptoren. Ebenso Zellen in vITRO mit synthetischen Substraten zu interagieren über absorbiert Schichten von Proteinen 4, während die physikalisch-chemischen Einflüssen modulieren auch die Haftung. Zum Beispiel kann ein Polymeroberfläche kann mehr &quot;benetzbar&quot; (hydrophil) mit Ionen oder UV-Lichtbestrahlung, Ätzen oder durch Behandlung mit Säure oder Hydroxid 5 wiedergegeben werden. Etablierte Methoden zur Zell Strukturierung profitieren Sie von diesen und anderen Zell-Adhäsion Mediatoren. Beispiele sind Tintenstrahldruck 6, Mikropräge 7, physikalische Immobilisierung 8, 9 Mikrofluidik, Echtzeit-Manipulation 10 und selektive molekulare Anordnung Strukturierung (SMAP) 11. Jeder hat spezifische Vorteile und Grenzen. Ein wesentlicher Treiber in unserer Arbeit, ist aber zu Zelle Strukturierung mit mikroelektromechanische Systeme (MEMS) zu integrieren. MEMS beziehen sich auf extrem kleine mechanische Geräte mit Strom angetrieben. Diese überschneidet sich mit der Nanoskala äquivalent, nanoelectromechanischer Systemen. Dieses Konzept wurde praktisch nur bei Halbleiterfertigungsstrategien aktiviert, um Platz auf der Mikro nehmen. Mikrofertigungstechniken, die ursprünglich für Halbleiterelektronik entwickelt versehentlich nützlich für andere Anwendungen, wie Mobilelektro gefunden worden, zum Beispiel. Ein Schlüsselabwärts Ziel ist es, wie mikroelektronischen Technologien mit einem High-Fidelity-Zelle Strukturierungsprozess (Bildung einer bioMEMS Gerät) zu kombinieren. Mehrere bestehende und ansonsten zuverlässig und praktisch zellStrukturierungsTechniken sind mit dieser Idee nicht vereinbar. Zum Beispiel ist eine genaue Ausrichtung der eingebettete Mikroelektronik oder Biosensoren Grund ihre Wirksamkeit ist jedoch extrem schwierig mit einer Technik wie Mikroprägung zu erreichen. Um dieses Problem zu umgehen, sind wir auf einem SiO 2-Basis-Plattform, die Strukturierung fotolithographisch gedruckt Parylene-C verwendet tätig. Die Photolithographie beinhaltet Transfer von geometrischen Merkmalen voneine Maske auf ein Substrat mittels UV-Beleuchtung. Eine Maske wird unter Verwendung einer geeigneten Computer-Aided Design-Programm. Auf einer Glasplatte, eine dünne Schicht von nicht-transparenten Chrom stellt das gewünschte geometrische Muster (eine Funktion Auflösung von 1-2 mm ist möglich). Das Substrat, das strukturiert werden soll, mit einer dünnen Schicht aus Photoresist (ein UV-empfindliches Polymer) beschichtet. Das beschichtete Polymer wird dann ausgerichtet und in engem Kontakt mit der Maske gebracht. Ein UV-Quelle ist so aufgebracht, dass ungeschützte Bereiche bestrahlt werden und somit löslich und Wechsel werden in der nächsten Entwicklungsschritt, so dass eine Parylene-C Darstellung der Maske Muster hinter. Dieser Prozess während der Entwicklung von Halbleitervorrichtungen entstanden. Als solche sind Siliziumscheiben häufig als Substrat verwendet. Photolithographische Ablagerung von Parylene-C auf SiO 2 ist daher eine einfache und sichere Verfahren, die routinemäßig in der Mikroelektronik Reinraum stattfindet. Während Parylene hatmehrere wünschenswerte Eigenschaften Bioengineering (chemisch inert, nicht biologisch abbaubar), ist ein Faktor, jedoch in ihrem direkten Einsatz in der Zell Strukturierung seiner Natur aus schlechte Haftzelle, zum Teil auf seine extreme Hydrophobie zugeschrieben. Dennoch Parylen-C zuvor indirekt für Zellmusterungs als Ablöse zellulären Vorlage 12,13 verwendet, zum Beispiel. Dieser Ansatz wird durch schlechte Auflösung beschränkt und erfordert mehrere Schritte. Das hier beschriebene Verfahren nutzt stattdessen eine Säure Ätzschritt, gefolgt von Serum inkubiert, um sicherzustellen, dass die Parylen-C-Regionen werden zelladhäsive, durch eine Kombination von Verminderung der Hydrophobie und Serumproteinbindung. Das Endergebnis ist ein Konstrukt aus zwei verschiedenen Substraten, die nach der biologischen Aktivierung, manifestieren jeweiligen Cyto-Klebstoff oder Cyto-abstoßende Eigenschaften und damit für eine wirksame Zellmusterungs Plattform besteht. Wichtig ist, gibt es keine Notwendigkeit, die biologische ag einführenEltern in den Reinraum-Anlage, wie die gemusterte Substrate unbegrenzt vor der Verwendung gelagert werden (worauf sie mit fötalem Kälberserum oder eine andere Aktivierungslösung aktiviert sind). Diese parylene-C/SiO 2 Muster Plattform ist daher ein guter Kandidat für eine Koalition mit MEMS-Komponenten, da die Herstellungsprozesse so eng spiegeln die für die Mikroelektronik-Fertigung eingesetzt.

<table><tbody><tr><td>Layout-Editor-Softwarepaket</td><td>CleWin 5.0 von WieWeb</td><td></td><td>Kann CIF- oder GDS-II-Dateien lesen/schreiben. Wird verwendet, um ein Parylene-Design für die Herstellung von Fotomasken zu erstellen. http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td></tr><tr><td>Maßgeschneiderte Fotomaske</td><td>Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Schottland</td><td></td><td>Entweder im eigenen Haus gefertigt oder in Betrieb genommen. www.compugraphics-photomasks.com</td></tr><tr><td>3 in Siliziumwafer</td><td>Siltronix, Archamps, Frankreich</td><td></td><td>http://www.siltronix.com</td></tr><tr><td>Atmosphärischer horizontaler Ofen</td><td>Sandvik</td><td></td><td>Zum oxidieren von Siliziumwafern. http://www.mrlind.com</td></tr><tr><td>Kleines punktspektroskopisches Reflektometer</td><td>Nanometrics</td><td></td><td>Zur Messung der Tiefe der Siliziumdioxidschicht. www.nanometrics.com/</td></tr> <tr><td>Silan-Adhäsionsvermittler</td><td>Merck Chemicals 1076730050</td><td></td><td>Voraufgetragen auf den Wafer, um die Parylene-Abscheidung zu fördern. www.merck-chemicals.de/</td></tr> <tr><td>Parylene-C</td><td>Ultra Electronics</td><td></td><td>www.ultra-cems.com</td></tr><tr><td>SCS Labcoter 2 Abscheidungseinheit, Modell PDS2010</td><td>SCS Equipment, Surrye, Großbritannien</td><td>Modell PDS2010</td><td>www.scscoatings.com/</td></tr> <tr><td>Hexamethyldisilazan (HMDS) Adhäsionsvermittler</td><td>SpiChem</td><td></td><td>www.2spi.com</td></tr><tr><td>Automatisiertes Spursystem zum Dispensieren von Fotolack auf Wafern; 3-Zoll-Fotolackspur</td><td>SVG (Silicon Valley Group)</td><td></td><td>Automatisiertes Spursystem zum Dispensieren von Fotolack auf Wafern. In einem Dickofen wird die Waffel gebacken und der Haftvermittler HMDS ausgegeben. Ein Kombinations-Spinner dosiert Fotolack. Der Vorbackofen härtet den Lack aus.</td></tr><tr><td>Fotolack</td><td>Rohm & Haas</td><td>SPR350-1.2 positiver Fotolack</td><td>www.rohmhaas.com/</td></tr> <tr><td>MA/BA8 Photomasken-Aligner</td><td>Süss Microtech</td><td></td><td>www.suss.com</td></tr><tr><td>Microchem MF-26A Entwickler</td><td>Microchem</td><td></td><td>Entfernt belichtete Bereiche des Fotolacks. www.microchem.com</td></tr><tr><td>JLS RIE80 Plasma-Ätzsystem</td><td>JLS Designs</td><td></td><td>Entfernt freiliegende Bereiche von Parylene. www.jlsdesigns.co.uk</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DISCO DAD 680 Wafer-Dicing Säge</td><td>DISCO Corporation, Japan</td><td></td><td>www.disco.co.jp</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>Zum Abwaschen von Resten von Fotolack.</td></tr><tr><td>30 % Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>98 % Schwefelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435589</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>10437</td><td>Standard-Chip-Aktivierung. www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>14170</td><td>www.invitrogen.com</td></tr></tbody></table>

musterbildung auf photolithographische definierte parylene-c: sio<sub&gt; 2</sub&gt; substrate

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Handy Strukturierung Plattformen unterstützen breiten Forschungsziele, wie den Bau von vordefinierten in vitro neuronale Netze und die Erforschung bestimmter zentrale Aspekte der Zellphysiologie. Um einfach kombinieren Zelle Strukturierung mit Multi-Elektroden-Arrays (MEAs) und Silizium-basierte &quot;Lab on a Chip&quot;-Technologien, wird ein Mikro-kompatible Protokoll erforderlich. Wir beschreiben eine Methode, die Abscheidung der Polymer Parylene-C auf SiO 2-Wafer verwendet. Fotolithografie ermöglicht eine genaue und zuverlässige Strukturierung Parylene C bei Mikrometerauflösung. Anschließender Aktivierung durch Eintauchen in fötalem Rinderserum (oder ein anderes spezielles Aktivierungslösung) zu einem Substrat, in dem kultivierten Zellen haften, oder von Parylen oder SiO 2-Regionen bzw. abgestoßen. Diese Technik wurde Strukturierung von einem breiten Spektrum von Zelltypen (einschließlich primären murinen Hippocampus-Zellen, HEK 293-Zelllinie, menschliche Neuronen-wie Teratokarzinom erlaubtZelllinie, primären murinen Kleinhirnkörnerzellen und primären humanen Gliom-Stammzellen aus-ähnliche Zellen). Interessanterweise ist die Plattform nicht universell, was die Bedeutung der Zell-spezifische Adhäsionsmoleküle. Diese Zelle Strukturierungsprozess ist kostengünstig, zuverlässig, und vor allem kann in Standard-Mikrofabrikation (Chip-Herstellung)-Protokolle integriert werden, die den Weg für die Integration von mikroelektronischen Technologie.

Das photolithographische Verfahren zur Strukturierung SiO 2 mit Parylen-C ist in Fig. 1 dargestellt. Einmal hergestellt, die Aktivierung von Chips in fötalem Rinderserum ermöglicht eine Vielzahl von Zelltypen in Kultur strukturiert werden. Unsere Gruppe hat erfolgreich primären murinen Hippocampus-Zellen 14-16, die HEK 293-Zelllinie 17, die menschliche Neuronen-wie Teratokarzinom (hNT) Zelllinie 18, primären murinen Kleinhirnkörnerzellen und primären humanen Gliom-Stammzellen aus-ähnlichen Zellen strukturiert. Abbildung 3 zeigt robuste Strukturierung von HEK 293 Zellen auf einer Parylene Muster aus kreisförmigen Knoten mit &quot;Fadenkreuz&quot;-Erweiterungen. Chip-Aktivierung in diesem Beispiel war mit fötalem Rinderserum. Im Gegensatz dazu zeigt Fig. 4 die Möglichkeit, die Musterung Plattform durch alternative Aktivierungslösungen erhöhen. Verwendung einer Lösung von Rinderserumalbumin (3 mg / ml) und<html> Fibronectin (1 ug / ml) in HBSS, das vorherige Strukturierung Vorschrift invertiert wurde. Abbildung 5 zeigt einen anderen Zelltyp (ein Haupt Menschen stammenden Stammzelllinie aus einem hochgradigen Gliom). Hier ist die Geometrie des zugrundeliegenden Musters Auswirkungen Zellverhalten, mit dem in Fig. 4A gezeigten Muster Förderung des Zellwachstumsprozesses entlang dünne Parylen-C verfolgt, wie in Fig. 4B und 4C gezeigt. Einige Zelltypen nicht Muster bei Verwendung der etablierten fetales Rinderserum Aktivierung Protokoll. Abbildung 6 zeigt 3T3-L1-Zellen, die zu ohne erkennbaren Zyto-abstoßend oder Zyto-Klebstoff Unterschied zwischen Parylene-C und SiO 2-Regionen Konfluenz. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Fig. 1 ist. Flussdiagramm, welches das Verfahren zur Herstellung von Parylen C-Muster auf SiO 2. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> 2. Flussdiagramm, das die Änderungen des Kontaktwinkels für strukturierte Parylen C und SiO 2-Domänen bei der Chipaktivierungsschritte. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> 3. Lebenden Zellen von HEK 293-Zellen nach drei Tagen in vitro auf parylene-C/SiO 2 kultiviert. Chips für 3 h in fötalem Rinderserum inkubiert, danach wurden die Zellenin Suspension bei einer Konzentration von 5 x 10 4 Zellen / ml plattiert. Parylene-C fördert die Zellhaftung, während nackten SiO 2-Zellen abstößt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> 4. Lebenden Zellen von HEK 293-Zellen auf parylene-C/SiO 2 kultiviert nach drei Tagen in vitro-Chips 3 h in verschiedenen rationalisierten Aktivierungslösungen aktiviert:. A: fötales Rinderserum, B: Vitronectin (1 ug / ml) in HBSS, C: Rinderserumalbumin (3 mg / ml) + Vitronectin (1 ug / ml) in HBSS, D: Rinderserumalbumin (3 mg / ml) + Fibronectin (156, g / ml) in HBSS. Zellen ausplattiert wurden in Suspension bei einer Dichte von 5 x 10 4 Zellen / ml. Beachten Sie, wie die unterschiedliche Behandlung des Chips ist in Umkehrung der bisherigen Strukturierung Dogma, mit SiO 2 nun klebrig und Parylene-C abstoßend geführt. Parylene-C Knotendurchmesser 250 um, von Hughes et al. Angepasst 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">​​Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> 5. . Immunfluoreszenz-Bilder von primären humanen Gliom-Stammzellen aus-ähnlichen Zellen auf verschiedene Muster von Parylene-C auf SiO 2 A gewachsen: schematische Darstellung der in B und C gezeigt retikulären Parylene Design </strong&gt; B:.. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von fixierten Zellen (nach 4 Tagen in vitro) für gliale fibrilläre saure Protein (GFAP) gefärbt C:. Lichtmikroskopische Aufnahme von lebenden Zellen auf demselben Chip D: Fluoreszenzbild darstellt, GFAP-gefärbten Zellen auf einem anderen Parylen . Design E:. Reflexions Bild des Knotens und sprach Parylene Design in D abgebildet <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> 6. Live-Cell-Imaging von 3T3 L1-Zellen nach vier Tagen in vitro an parylene-C/SiO 2 kultiviert. Chips für 3 Stunden in fetales Rinderserum nach w aktiviertelche Zellen wurden in Suspension (3 x 10 4 Zellen / ml) ausplattiert. In diesem Fall ist die Plattform nicht aktivieren Musterung, mit Zellen konfluent immer gleich auf Parylene-C und SiO 2-Regionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikro-kompatible Methode zur Zellstrukturierung auf SiO 2. Eine vordefinierte Parylene-C Design ist fotolithographisch auf SiO 2-Wafer gedruckt. Nach der Inkubation mit Serum (oder andere Aktivierungslösung) Zellen anhaften speziell auf (und wachsen nach der Konformität) zugrunde liegenden Parylene-C, und dabei von SiO 2-Regionen zurückgeschlagen.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellen auf Siliziumdioxid-Oberflächen gemäß einem vordefinierten, zugrunde liegenden Paraline-Design zu mustern. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Fotomaske des gewünschten Musters erstellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, einen Siliziumwafer zu oxidieren und anschließend mit Paraline zu beschichten.Die anschließenden photolithografischen Prozesse, die in einer Reinraumumgebung der Mikroelektronik durchgeführt werden, dienen dazu, die Paralinschicht gezielt zu ätzen, um das gewünschte Design freizulegen. Der letzte Schritt besteht darin, die Chips zunächst mit Piranhasäure zu aktivieren und anschließend drei bis zwölf Stunden in fötalem Kälberserum zu inkubieren, wonach eine Zellsuspension zur Kultur aufgebracht werden kann. Letztendlich kann die Zellanordnung entweder mittels Live-Cell-Imaging mit einem Stereomikroskop oder nach Fixierung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber mehreren bestehenden Zellmusterungsplattformen liegt darin, dass biologische Agentien nicht in den Reinraum eingebracht werden müssen. Außerdem können die Musterchips unbegrenzt lange aufbewahrt werden, bis sie mit erstem Paraffinsäure und anschließendem Serum aktiviert werden. Um die gewünschte Paraline-C-Konfiguration zu entwerfen, verwenden Sie eine Layout-Editor-Software, die in der Lage ist, CIF- oder GDS2-Dateien zu lesen und zu schreiben.Beauftragen Sie einen externen Hersteller von Fotomasken mit einer geeigneten Mikroelektronik-Anlage oder fertigen Sie die Maske intern an. Falls die entsprechenden Einrichtungen vorhanden sind, oxidieren Sie eine Siliziumscheibe in einem horizontalen Ofen bei atmosphärischem Druck bei 950 Grad Celsius für 40 Minuten, um eine 200 Nanometer dicke Siliziumdioxid-Schicht zu erzeugen. Überprüfen Sie danach die Schichtdicke an einer kleinen Stelle.Spektroskopischer Reflektometer. Legen Sie die Wafer in das Vakuumabscheidesystem und geben Sie den Haftvermittler Sine auf die Innenseite des Kammerdeckels auf. Während des Evakuierungszyklus beschichtet der Haftvermittler Sine die oxidierte Wafer-Ladung; anschließend wird Paraline in den Ofen eingebracht und Paraline C bei Raumtemperatur mit einer Rate von 1,3 Nanometern pro Milligramm Dimer mittels eines Vakuumabscheidesystems abgeschieden.Tragen Sie danach den Haftvermittler HMDS auf den paralinfilm-beschichteten Wafer auf. Verwenden Sie ein geeignetes Photoresist-Beschichtungssystem, um den Wafer bei 4.000 U/min für 30 Sekunden zu beschichten, während positiver Photoresist appliziert wird, um mithilfe des Photoresist-Beschichtungssystems eine Schichtdicke von einem Mikrometer zu erreichen; anschließend den Wafer 60 Sekunden bei 90 Grad Celsius vortrocknen. Setzen Sie nun sowohl den Wafer als auch die vorgefertigte Fotomaske in einen Maskenaligner ein.Belichten Sie die mit Fotolack beschichtete Wafer mit UV-Licht, um das gewünschte Muster in den Fotolack zu übertragen. Anschließend wird die belichtete Wafer 60 Sekunden bei 110 Grad Celsius ausgebacken. Danach wird der gesamte belichtete Fotolack von der Wafer entfernt, indem er in einer geeigneten Entwicklerlösung entwickelt wird, und der ungeschützte Paraline mittels eines Sauerstoff-Plasma-Ätzverfahrens abgetragen, um das darunterliegende Siliciumdioxid freizulegen.Danach die Chips nach dem Ausd&uuml;nnschneiden bis zur weiteren Verwendung in staubfreien Beh&auml;ltern lagern. Entfernen Sie in diesem Verfahren den restlichen Fotolack von den Chips durch Waschen mit Aceton f&uuml;r 10 Sekunden. Anschlie&szlig;end die Chips dreimal mit deionisiertem destilliertem H2O sp&uuml;len, danach frische Piranha-S&auml;ure in einem S&auml;ureabzug herstellen und die Chips durch Eintauchen in Piranha-S&auml;ure f&uuml;r 10 Minuten reinigen und &auml;tzen.Spülen Sie die Chips anschließend dreimal mit deionisiertem H2O und überführen Sie sie in eine sterile Kulturschale unter einer laminaren Luftströmung in der Zellkulturhaube. Aktivieren Sie die Chips für die Zellmusterung, indem Sie zwei Chips pro Vertiefung in eine sechs-well-Platte geben. Geben Sie danach zwei Milliliter fetalen Kälberserum hinzu, um alle Chips vollständig zu bedecken.Die Chips drei bis zwölf Stunden bei 37 Grad Celsius im Serum inkubieren. Entfernen Sie die Chips nun aus ihrer Aktivierungslösung. Einmal für 10 Sekunden in Hank’s Pufferlösung mit ausgewogenen Salzen waschen.Danach die Chips in eine Kulturmulde geben und den gewählten Zelltyp als Suspension in dem üblichen Wachstumsmedium ansäen. Die optimale Zellansäudedichte hängt sowohl von der Zellart als auch vom geometrischen Muster der Paraline C auf dem Chip ab. Eine Dichte von fünf mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter ist ein sinnvoller Ausgangspunkt.Die Bildgebung wird an die zugrunde liegende Motivation für die Zellmusterung angepasst, aber das Verhalten lebender Zellen kann leicht mithilfe eines Stereomikroskops und einer digitalen Kamera mit einem geeigneten Relaisobjektiv beurteilt werden. Hier ist die Live-Cell-Bildgebung von HEC 2 93-Zellen, die drei Tage lang auf Paraline C Siliziumdioxid kultiviert wurden. In vitro wurden die Substrate drei Stunden lang in fetalem Rinderserum inkubiert, und die Zellen wurden in Suspension mit einer Konzentration von fünf mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter ausgesät.Paraline C fördert die Zelladhäsion, während reines Siliziumdioxid Zellen abstoßt. Diese Abbildung zeigt Immunfluoreszenzbilder von primären, aus Gliomen stammenden humanen stammähnlichen Zellen, die auf verschiedenen Paraline-C-Strukturen auf Siliziumdioxid kultiviert wurden. Hier veranschaulicht die schematische Darstellung das netzartige Paraline-Design, die Fluoreszenzmikroskopaufnahme der fixierten Zellen, gefärbt gegen das gliale fibrilläre saure Protein, sowie die Lichtmikroskopaufnahme lebender Zellen auf demselben Chip.Hier ist ein fluoreszenzbild, das GFAP-gefärbte Zellen auf einem anderen paralinen Design und das Reflexionsbild des Knotens im Speichen-paralinen-Design zeigt. Diese Abbildung zeigt die Live-Cell-Bildgebung von drei T-drei-L-eins-Zellen, die auf Paraline C aus Siliziumdioxid kultiviert wurden. Nach vier Tagen in vitro wurden die Chips drei Stunden lang in fötalem Rinderserum aktiviert, und die Zellen wurden in Suspension bei einer Konzentration von fünf mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter ausplattiert.In diesem Fall ermöglicht die Plattform kein Musterung, da die Zellen auf den Lene C- und Siliziumdioxid-Bereichen gleichmäßig konfluent werden. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, daran zu denken, dass die Serumaktivierung unmittelbar nach der Piranha-Behandlung erfolgen muss. Andernfalls wird der Musterungsprozess beeinträchtigt.Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Piranha-Säure äußerst gefährlich sein kann. Bereiten Sie Piranha-Säure in einer Abzugshaube vor und verwenden Sie sie dort, und tragen Sie geeignete Schutzbrille, Laborkittel und Handschuhe.

cell-patterning-on-photolithographically-defined-parylene-c-sio2

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Non-Fouling-PEG Silan-Monoschicht wurde von einzeln adressierbaren ITO-Elektroden auf Glas durch Anlegen einer reduktiven Potential desorbiert. Elektrochemisches Abtragen von PEG-Silan-Schicht aus ITO-Mikroelektroden für die Zelladhäsion erlaubt, in einem räumlich definierten Weise erfolgen, mit zellulären Mustern entsprechenden eng an die Elektrode Muster.

Patterning Cells auf optisch transparenten Indium-Zinn-Oxid-Elektroden

Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Strukturierung oxidfreie Silizium und Germanium mit reaktiven organischen Monoschichten und demonstrieren Funktionalisierung der strukturierten Substraten mit kleinen Molekülen und Proteinen. Der Ansatz vollständig schützt Oberflächen durch chemische Oxidation, ermöglicht eine präzise Kontrolle über Funktion Morphologie und bietet leichten Zugang zu chemisch diskriminiert Muster.

Soft-Lithographie Funktionalisierung und Strukturierung Oxydfreie Silizium und Germanium

Ein micropunching Lithographie Ansatz wurde entwickelt, um Mikro-und Submikron-Muster auf der Oberseite, Seitenwand-und Bodenflächen der Polymer-Substraten zu erzeugen. Sie überwindet die Hindernisse der Strukturierung leitfähiger Polymere und Erzeugung Seitenwand Muster. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Fertigung von mehreren Funktionen und ist frei von aggressiven Chemie.

Micropunching Lithographie zur Erzeugung von Mikro-und Submikron-Muster auf Polymersubstrate

Wässriger Zweiphasensysteme wurden gleichzeitig Muster mehrere Populationen von Zellen verwendet. Dieses schnelle und einfache Methode zur Musterbildung Zelle nutzt die Phasentrennung der wässrigen Lösungen von Dextran und Polyethylenglycol und die Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymerlösungen besteht.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Dieser Bericht beschreibt eine einfache, leicht durchzuführende Technik, die Niederdruckvakuum verwendet, um mikrofluidische Kanäle mit Zellen und Substraten für die biologische Forschung zu füllen.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Hier präsentieren wir eine unterstützte Lipiddoppelschicht im Rahmen einer mikrofluidischen Plattform zur Untersuchung von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen unter Verwendung eines etikettfreien Verfahrens auf Basis der pH-Modulation.

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Wir stellen eine Technologie vor, die kapillaritätsunterstützte Montage in einer mikrofluidischen Plattform verwendet, um in einer Flüssigkeit suspendierte Objekte in Mikrogröße, wie Bakterien und Kolloide, in vorgeschriebene Arrays auf einem Polydimethylsiloxansubstrat zu strukturieren.

Strukturierung von Mikroorganismen und Mikropartikeln durch sequentielle kapillaritätsunterstützte Montage

Wir beschreiben Verbesserungen an einer Standardmethode zur Messung zellulärer Zugkräfte, die auf dem Mikrokontaktdruck mit einem einzigen subtraktiven Musterungsschritt von Punktarrays extrazellulärer Matrixproteine auf weichen Hydrogelen basiert. Diese Methode ermöglicht eine einfachere und konsistentere Herstellung von Inselmustern, die für die Steuerung der Zellgruppenform unerlässlich sind.

Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Traditionell wird die Zellkultur auf planaren Substraten durchgeführt, die die natürliche Umgebung von Zellen in vivo schlecht nachahmen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Zellkultursubstraten mit physiologisch relevanten gekrümmten Geometrien und mikrostrukturierten extrazellulären Proteinen, die systematische Untersuchungen der zellulären Erfassung dieser extrazellulären Hinweise ermöglicht.

Erzeugung von Multicue-Zellmikroumgebungen durch UV-Photostrukturierung von dreidimensionalen Zellkultursubstraten

Dieses Protokoll stellt eine lichtinduzierte Methode zur Herstellung glitschiger dreidimensionaler Strukturen durch sequentielle digitale Strukturierung und Transplantation auf silanbeschichteten nanoporösen Oberflächen vor. Dieser Ansatz ermöglicht die räumlich kontrollierte Bildung von rutschigen Bereichen, was eine strukturierte Flüssigkeitsabweisung und die quantitative Analyse der Grenzflächengleitfähigkeit ermöglicht, mit Anwendungen in der Flüssigkeitsmanipulation und Oberflächentechnik.

Lichtinduzierte Strukturierung und Veredelung für rutschige Oberflächen auf Basis silanbeschichteter nanoporöser Strukturen

Lernen Sie die Zellmusterung auf SiO₂-Substraten mit Parylen-C für biomedizinische Forschung. Diese photolithografische Methode ermöglicht kontrollierte Zelladhäsion und reduziert Kontaminationsrisiken im Reinraum.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO

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