Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO ₂ Substrate

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikro-kompatible Methode zur Zellstrukturierung auf SiO _2. Eine vordefinierte Parylene-C Design ist fotolithographisch auf SiO _2-Wafer gedruckt. Nach der Inkubation mit Serum (oder andere Aktivierungslösung) Zellen anhaften speziell auf (und wachsen nach der Konformität) zugrunde liegenden Parylene-C, und dabei von SiO _2-Regionen zurückgeschlagen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zellen auf Siliziumdioxid-Diensten gemäß einem vordefinierten zugrunde liegenden Design von Paraline zu strukturieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Fotomaske mit dem gewünschten Muster erstellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, einen Siliziumwafer zu oxidieren und anschließend mit Paralin zu beschichten.

Anschließend werden photolithographische Prozesse, die in einem Reinraum für Mikroelektronik durchgeführt werden, verwendet, um die Paralinbeschichtung selektiv zu ätzen, um das gewünschte Design freizulegen. Der letzte Schritt besteht darin, die Chips zunächst mit Piranha-Säure zu aktivieren und dann drei bis 12 Stunden lang in fötalem Kälberserum zu inkubieren, wonach eine Zellsuspension zur Kultur aufgetragen werden kann. Letztendlich kann die Zellmusterbildung entweder durch Live-Zell-Imaging mit einem Präpariermikroskop oder nach der Fixierung mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber mehreren bestehenden Zellstrukturierungsplattformen besteht darin, dass keine biologischen Wirkstoffe in den Reinraum gebracht werden müssen. Außerdem können Musterchips unbegrenzt aufbewahrt werden, bis sie zuerst mit Parsäure und dann mit Serum aktiviert werden. Um die gewünschte Paraline-C-Konfiguration zu entwerfen, verwenden Sie ein Layout-Editor-Softwarepaket, das in der Lage ist, CIF- oder GDS-Dateien zu lesen und zu schreiben.

Lagern Sie den Hersteller von Fotomasken an eine geeignete Mikroelektronikeinrichtung aus oder stellen Sie sie im eigenen Haus her. Wenn es Anlagen gibt, oxidieren Sie einen Siliziumwafer in einem atmosphärischen Horizontalofen bei 950 Grad Celsius für 40 Minuten, um eine 200 Nanometer große Siliziumdioxidschicht herzustellen. Bestätigen Sie danach die Dicke mit einem kleinen Punkt.

Spektroskopisches Reflektometer. Platzieren Sie die Wafer in einem Vakuumabscheidungssystem und tragen Sie einen Sinus-Adhäsionsvermittler auf die Innenseite des Kammerdeckels auf. Während des Abpumpzyklus beschichtet der Sinushaftvermittler das oxidierte Waferlast-Paralin bei Umgebungstemperatur mit einer Geschwindigkeit von 1,3 Nanometern pro Milligramm Dimer unter Verwendung eines Vakuumabscheidungssystems in das Ofenabscheidungsparaline C.

Danach den HMDS-Adhäsionsvermittler auf dem paralinbeschichteten Wafer abscheiden. Mit einem geeigneten Fotolack-Beschichtungssystem drehen Sie den Wafer 30 Sekunden lang bei 4.000 U/min, während Sie positiven Fotolack auftragen, um mit dem Fotolack-Beschichtungssystem eine Dicke von einem Mikrometer zu erhalten, und backen Sie den Wafer dann 60 Sekunden lang bei 90 Grad Celsius weich. Setzen Sie nun sowohl den Wafer als auch die vorgefertigte Fotomaske in einen Masken-Aligner ein.

Belichten Sie den mit Fotolack beschichteten Wafer mit UV-Licht, um das gewünschte Muster in den Fotolack zu übertragen. Anschließend den freigelegten Wafer 60 Sekunden bei 110 Grad Celsius backen. Entfernen Sie dann alle belichteten Fotolacke vom Wafer, indem Sie sie in einer geeigneten Entwicklerlösung bei Hoff entwickeln, das ungeschützte Paralin, indem Sie ein Sauerstoff-Plasma-Ätzsystem verwenden, um das darunter liegende Siliziumdioxid freizulegen.

Lagern Sie die Chips dann nach dem Würfeln in staubfreien Boxen, bis sie benötigt werden. Entfernen Sie bei diesem Verfahren die Reste des Fotolacks von den Chips, indem Sie ein Aceton 10 Sekunden lang waschen. Spülen Sie sie dann dreimal in deionisiertem destilliertem H2O, machen Sie die frische Piranha-Säure anschließend in einem Säureabzug, reinigen und ätzen Sie die Späne durch Eintauchen in Piana-Säure für 10 Minuten.

Spülen Sie dann die Chips dreimal in deionisiertem H2O und geben Sie sie in eine sterile Kulturschale in einer Laminar-Flow-Gewebekulturhaube. Aktivieren Sie die Chips für die Zellstrukturierung, indem Sie zwei Chips pro Vertiefung in eine Platte mit sechs Vertiefungen einsetzen. Fügen Sie anschließend zwei Milliliter fötales Rinderserum hinzu, um alle Chips vollständig einzutauchen.

Inkubieren Sie die Chips drei bis 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Serum. Entfernen Sie nun die Chips aus ihrer Aktivierungslösung. Einmal 10 Sekunden lang in Hanks ausgewogener Salzlösung waschen.

Legen Sie dann die Chips in eine Kulturvertiefung und plattieren Sie den gewählten Zelltyp als Suspension in seinem üblichen Wachstumsmedium. Die optimale Zellplattierungsdichte hängt sowohl vom Zelltyp als auch vom geometrischen Muster von Paraline C auf dem Chip ab. Eine Dichte von fünf mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Milliliter ist ein sinnvoller Ausgangspunkt.

Die Bildgebung ist auf die zugrundeliegende Motivation für die Zellmusterbildung zugeschnitten, aber das Verhalten lebender Zellen kann leicht mit einem Präpariermikroskop und einer Digitalkamera mit einem geeigneten Relaisobjektiv beurteilt werden. Hier ist die Lebendzellbildgebung von HEC 2 93 Zellen, die nach drei Tagen auf Paraline C Siliziumdioxid kultiviert wurden. In vitro wurden die Schiffe drei Stunden lang in fötalem Rinderserum inkubiert, und die Zellen wurden in Suspension in einer Konzentration von fünfmal 10 bis vier Zellen pro Milliliter plattiert.

Paraline C fördert die Zelladhäsion, während blankes Siliziumdioxid Zellen abstößt. Diese Abbildung zeigt die Immunfluoreszenzbilder von primären humanen Gliomen, die auf verschiedenen Mustern von Paraline C auf Siliziumdioxid gezüchtet wurden. Hier veranschaulicht das Schema das retikuläre Paralin-Design, die Fluoreszenzmikroskopaufnahme von fixierten Zellen, die auf saures Protein der Gliafibrillen gefärbt wurden, und die Lichtmikroskopaufnahme von lebenden Zellen auf demselben Chip.

Hier ist ein Fluoreszenzbild, das GFAP-gefärbte Zellen auf einem anderen Paralin-Design zeigt, und das Reflexionsbild des Knotens im Speichen-Paralin-Design. Und diese Abbildung zeigt die lebende Zellbildgebung von drei T-, drei L-, Eins-Zellen, die auf Paraline C-Siliziumdioxid kultiviert wurden. Nach vier Tagen in vitro waren die Chips drei Stunden lang in fötalem Rinderserum aktiviert worden, und die Zellen wurden in Suspension in einer Konzentration von fünfmal 10 der vierten Zellen pro Milliliter plattiert.

In diesem Fall ermöglicht die Plattform keine Musterbildung, bei der Zellen in Lene C- und Siliziumdioxid-Regionen gleichermaßen zusammenfließen. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Serumaktivierung unmittelbar nach der Piranha-Behandlung erfolgen muss. Geschieht dies nicht, wird der Strukturierungsprozess untergraben.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Piranha-Säure extrem gefährlich sein kann. Bereiten Sie Piranha-Säure in einem chemischen Abzug vor und stellen Sie sicher, dass Sie eine geeignete Schutzbrille, Laborkittel und Handschuhe tragen.