Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein zweidimensional strukturiertes Substrat zur Kontrolle der Proteinabsorption und des Zellwachstums zu entwickeln. Dies wird durch die Photolithografie zur Herstellung eines gemusterten Masters erreicht, der zur Herstellung von A-P-D-M-S-Stempeln für den Mikrokontaktdruck verwendet wird. In einem zweiten Schritt wird das gemusterte Goldsubstrat hergestellt, bei dem ein Mikrokontaktdruck verwendet wird, um ein Muster mit Bereichen zu erzeugen, die Protein absorbieren und resistent sind.

Als nächstes werden das Protein und die Zellen auf das Substrat aufgebracht, um das Muster zu visualisieren und zu untersuchen. Es werden zelluläre Wachstums- und Verhaltensergebnisse erhalten, die auf der Grundlage von Fluoreszenz- und Gesichtskontrastmikroskopie einen guten Protein- und Zelleinschluss auf diesen Mustersubstraten zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie z. B. dem MicroCon-Druck von Proteinen, besteht darin, dass die glykolterminierte Monoschicht einer unspezifischen Protein- und Zellabsorption im Hintergrund des Musters widersteht.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die richtige Stempeltechnik für jedes gedruckte Muster optimiert werden muss. Um mit der Vorbereitung des strukturierten Master-Centers zu beginnen, wird der Siliziumwafer auf dem Spin-Coder und während des ersten Schritts des Zwei-Takt-Spin-Programms der Wafer mit Aceton gespült. Während des zweiten Schritts des Spin-Programms verdampft das Aceton, wobei zu Beginn des Spins ein sauberer, trockener Wafer zurückbleibt, der Wafer mit Fotolack versehen und dann unter den zuvor beschriebenen Bedingungen geschleudert wird.

Backen Sie den mit Fotolack beschichteten Wafer zwei Minuten lang bei 110 Grad Celsius mit einer Heizplatte mit hoher Gleichmäßigkeit. Nächstes Fotomuster. Der Fotolack beschichtete Wafer wird mit einem Masken-Aligner-System und einer entsprechenden Maske beschichtet.

Legen Sie zunächst das Substrat auf den Vakuumwagen des Masken-Aligners. Setzen Sie dann die Maske in die Halterschale ein und schalten Sie das Vakuum ein, um die Maske an Ort und Stelle zu halten und einen guten Kontakt zwischen der Maske und dem Substrat zu bestätigen. Heben Sie das Substrat an, bis es auf die Maske trifft.

Verwenden Sie die Optik des Aligners, um zu bestätigen, dass ein guter Kontakt hergestellt wurde. Schalten Sie abschließend die Lampe ein, um das Substrat durch die lithografische Maske UV-Licht auszusetzen. Entwickeln Sie den gemusterten Wafer im Entwickler für eine Minute und 45 Sekunden unter leichtem Rühren.

Gründlich mit deionisiertem Wasser in Halbleiterqualität spülen und mit einem Strom von Stickstoffgas trocknen, um die Entwicklung des Musters mit einem Mikroskop mit UV-Filter zu überprüfen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie einen 10 bis 1 Gew.-Harzhärter vorbereiten. Mischung der Zigarre 180 2 vollständig.

Den fotogemusterten Wafer mit der Mischung in einer Einweg-Petrischale in einem Vakuum-Degas, dem PDMS-bedeckten Master, abdecken, bis keine Blasen mehr sichtbar sind. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass sich der Master am Boden der Form befindet, lassen Sie den Stempel 1,5 Stunden lang bei 65 Grad Celsius im Ofen aushärten. Wenn der PDMS-Stempel ausgehärtet ist, schneiden Sie den Stempel aus dem Master aus und schneiden Sie ihn auf die entsprechende Größe zu.

Bewahren Sie den Stempel in einem abgedeckten Behälter auf, um ihn vor Staub und Schmutz zu schützen. Um die Substrate für die Metallabscheidung vorzubereiten, behandeln Sie runde Glasdeckgläser zunächst 10 Minuten lang mit Sauerstoffplasma. Spülen Sie dann die Deckgläser zweimal mit entionisiertem Wasser, trocknen Sie mit dem Strom des Stickstoffgases zwischen den Spülgängen nach dem Spülen mit Wasser, spülen Sie zweimal mit Ethanol und trocknen Sie erneut mit dem Strom des Stickstoffgases zwischen den Spülgängen.

Mit einem Elektronenstrahlabscheidungssystem mit mehreren Taschen scheiden Sie 50 Angström Titan gefolgt von 150 Angström Gold ab. Den Verdampfer nicht zwischen der Abscheidung der Titanschicht und der Goldschicht verdampfen. Spülen Sie den PDMS-Stempel mit Ethanol aus und trocknen Sie ihn gründlich ab.

Tragen Sie mit Stickstoffgas die Stempellösung tropfenweise auf den Stempel auf, bis er vollständig beschichtet ist. Trocknen Sie den Stempel gründlich mit Stickstoffgas ab. Der Mikrokontaktdruck der HEXA Decane-Datei hängt von den Eigenschaften des PDMS-Stempels ab und ist einer der schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens.

Erfolgreiches Stanzen erfordert die Entwicklung einer guten Technik, die gleichmäßigen Druck ausübt. Während des Stanzens. Für den herkömmlichen Mikrokontaktdruck an der Luft drücken Sie den Stempel vorsichtig auf das Goldsubstrat und lassen die Monoschicht 15 Sekunden lang einwirken.

Alternativ können Sie bei Mustern, die aus sehr kleinen Merkmalen und hohen Aspektverhältnissen bestehen, das Goldsubstrat in eine Petrischale mit 18,2 Mega om deionisiertem Wasser legen und sicherstellen, dass das Substrat untergetaucht ist. Drücken Sie dann den Stempel vorsichtig auf das Goldsubstrat und lassen Sie die Mono-A-Schicht 15 Sekunden lang einwirken. Spülen Sie anschließend das gestanzte Substrat zweimal mit Ethanol ab, das mit Stickstoffgas getrocknet wird.

Legen Sie das Substrat nach jedem Spülen in eine Petrischale und bedecken Sie das Substrat mit Rückenfülllösung. Verschließen Sie die Schüssel mit Param, um eine Verdunstung zu verhindern. Lassen Sie die Hintergrundmonoschicht 12 bis 14 Stunden lang im Dunkeln entstehen.

Entfernen Sie abschließend den gemusterten Deckslip von der Rückenfülllösung und spülen Sie nach jedem Spülen zweimal mit Ethanol und Trocknung mit Stickstoffgas nach. Um Protein auf das gemusterte Deckglas aufzutragen, legen Sie das Deckglas entweder in eine kleine Petrischale oder eine Zellkulturkammer Mit 500 Mikrolitern bis einem Milliliter Delcos phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Das DPBS muss das Substrat während der Proteininkubation vollständig bedecken.

Um eine gleichmäßige Proteinabdeckung zu gewährleisten, fügen Sie dem DPBS eine konzentrierte Proteinlösung hinzu und mischen Sie die Lösung durch mehrmaliges Pipettieren. Inkubieren Sie das Proteingemisch mit dem Substrat bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Spülen Sie das Substrat nach der Inkubation gründlich mit DPBS, um ungebundenes Protein zu entfernen, und achten Sie darauf, das Substrat nicht zu trocknen oder durch die Luft-Wasser-Grenzfläche zu bringen.

Nach drei Spülgängen wird das DPBS abgesaugt. Fügen Sie dann etwa 500 Mikroliter des kompletten Zellwachstumsmediums hinzu, um ein nasses Substrat zu erhalten. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium, das zum Spülen des Substrats verwendet wurde.

Mit frischen Medien ist das Substrat nun bereit für die Beschichtung mit Zellen. Typischerweise werden 30 bis 200 Zellen pro Quadratmillimeter auf das Substrat aufgebracht. Dieses Bild zeigt den A-P-D-M-S-Stempel, der unter einem Mikroskop visualisiert wird, indem der Stempel mit der Seite nach unten auf ein Glasdeckglas gelegt wird, der Maßstabsbalken beträgt 100 Mikrometer.

Die richtige Prägung führt zu einem scharfen, klaren Proteinmuster, das durch die Anwendung eines fluoreszenzmarkierten Proteins wie LOR 6 47 markiertes Fibronektin sichtbar gemacht werden kann. Hier wird die Bindung von chk one Zellen an das Proteinmuster gezeigt. Die Maßstabsbalken sind in diesen Bildern 100 Mikrometer groß.

Alternativ kann die Immunhistochemie verwendet werden, um das Proteinmuster nach der SU-Fixierung sichtbar zu machen. Hier wird LOR drei 50 konjugierte Anti-Laminat-Antikörper verwendet, um gemustertes Laminat zu visualisieren, das mit E 18 Maus-Hippocampus-Neuronen besiedelt wurde, die nach vier Tagen in vitro gezeigt wurden. E 18 Maus-Hippocampus-Neuronen, die mit dem MIT-Tracker rot fünf 80 gefärbt wurden, zeigen, dass das Zellwachstum gut auf das Proteinmuster beschränkt ist. Obwohl diese Technik leicht zu beherrschen ist, können mehrere häufige Probleme auftreten, wie diese Mustersubstratpräparationen veranschaulichen, die durch LOR 6 47 konjugierte Fibronektinabsorption visualisiert werden.

Die Applikation von Protein ohne ausreichende Durchmischung der konzentrierten Proteinlösung im DPBS kann zu ungleichmäßigen Proteinmustern führen. Unsachgemäßes Stempeln kann zu einer teilweisen Musterübertragung oder zum Zusammenbruch des Stempels führen. Darüber hinaus kann das Aussetzen des Mustersubstrats, das absorbiertes Protein enthält, an der Luft auftreten, die Monoschicht stören, was zu einer verminderten Widerstandsfähigkeit führt.

Im Hintergrund können durch die Unterwassermusterung Muster mit kleinen Merkmalen erzeugt werden, die mit herkömmlichem Mikrokontaktdruck und Luft nur schwer zu drucken sind. Diese beiden Bilder zeigen verschiedene Bereiche desselben Musters, die mit demselben PDMS-Stempel in Luft oder deionisiertem Wasser gedruckt wurden. Stützlinien sind in der Abbildung links dargestellt, um zu zeigen, dass nur die kleinen Merkmale des Musters nicht erfolgreich gedruckt werden konnten. Die Maßstabsbalken betragen 20 Mikrometer. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 18 bis 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Mustersubstrat herstellt. Produzieren Sie den A-P-D-M-S-Stempel. Verwenden Sie den Mikrokontaktdruck, um ein Muster aus Goldsubstrat vorzubereiten und dieses Muster mithilfe von Proteinen und Zellen zu visualisieren.