Gleichzeitige Langzeit-Aufnahmen auf zwei neuronale Verarbeitungsstufen in Behaving Honigbienen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die olfaktorische Beschichtung und die Gedächtnisbildung unter Verwendung eines langfristigen Zugangs zu zwei unabhängigen neuronalen Prozessstufen bei sich verhaltenden Honigbienen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst kostengünstige Mehrkanalelektroden aus isolierten Kupfer-Mikrodrähten und maßgefertigten Halterungen montiert werden. Der nächste Schritt besteht darin, eine lebende Honigbiene zu präparieren, indem ein Teil ihrer Kopfkapsel entfernt wird, um zwei mit einem Fluoreszenzfarbstoff behandelte Elektroden in das exponierte Gehirn einzuführen.

Der dritte Schritt besteht darin, von den beiden unabhängigen Neuropillen oder -bahnen im Geruchsweg aufzuzeichnen, während sie mit blumigen Gerüchen und Pheromonen stimulieren. Später, nach der Präparierung des Gehirns, wird ein anderer fluoreszierender Tracer in den Antennenlappen injiziert, um die Zielneuronen wieder aufzufüllen. Die verfüllten Spuren und die Elektrodenspuren werden dann visualisiert, um eine dreidimensionale Rekonstruktion der neuronalen Architektur zu erstellen.

Letztendlich können die Beziehungen in der Geruchsbeschichtung zwischen den beiden Neuronenpopulationen auf verschiedenen Verarbeitungsebenen wie dem Antennenlappen und dem Pilzkörper mit diesen Techniken besser verstanden werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht also darin, dass unsere Mehrkanalelektroden sehr klein sind und in Kombination verwendet werden können, was bedeutet, dass wir nach der Verankerung gleichzeitig an verschiedenen Bereichen des Gehirns aufzeichnen können. Die flexiblen Drähte ermöglichen einen mehrstündigen Stallrückruf bei sich verhaltenden Tieren.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neuropathologie zu beantworten, z. B. zu verstehen, wie Tiere Geruchsfabriken im Leben aus ihrer Umgebung aufnehmen, wahrnehmen und schließlich berechnen. Diese doppelte Aufzeichnungstechnik kann einen Einblick in den zugrunde liegenden Mechanismus der Geruchscodierung und neuronaler Netzwerke im Allgemeinen geben. Es kann auch auf andere Modellorganismen in der Wirbellosen- oder Affektion- und Neurobiologie angewendet werden.

Im Allgemeinen werden Individuen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da viel Training erforderlich ist, um Honigbienen-Neuronen nur anhand morphologischer Orientierungspunkte wie dem internen Lappen oder dem vertikalen Lappen des Pilzkörpers zu identifizieren. Erstellen Sie für dieses Protokoll einen Elektrodenadapter, der auf eine Standard-Elektrodenschnittstellenplatine passt. Löten Sie zunächst drei kurze Stücke isolierter Drähte an einen 18-poligen Stecker.

Schneide dann ein Stück Plexiglasplatte ab und setze an der längsten Seite eine flache Rille ein. Schrauben Sie anschließend Lötfahnen in die Plexiglasplatte und kleben Sie die Platte auf die Oberseite des Steckers. Verbinden Sie dann die Basis mit den drei kurzen Drähten mit den Laschen.

Positionieren Sie anschließend eine Glaskapillare in der Nut der Plexiglasplatte. Die Kapillare sollte gleiten können und mit einer Schraube gesichert werden. Verlängern Sie die Glaskapillare mit einem winzigen Stift etwa fünf Millimeter nach außen. Die Kapillare und der Stift werden verwendet, um die Elektroden-Mikrodrähte zu stützen und zu stabilisieren.

Positionieren Sie als Nächstes drei Mikrodrähte. Mit Hilfe von Klebeband für einen besseren Zugang kann die Glaskapillare mit einem 12 Volt Lötnadelkleber entfernt werden. Die Drähte zusammen mit LMP Zahnwachs verkleben das letzte Drittel der Drähte nicht.

Verbinden Sie nun diese mehrkanalige Mikrodrahtbaugruppe mit dem Elektrodenadapter. Positionieren Sie die verlängerte Glaskapillare parallel zu den Mikrodrähten. Befestigen Sie diesen Aufsatz mit Zahnwachs entlang der überlappenden Glaskapillare und des Minutianstifts.

Schneiden Sie dann die Elektrodendrähte ab, so dass zwei bis drei Zentimeter vom Minutenstift und zwei bis drei Zentimeter vom Elektrodenende entfernt bleiben. Befestigen Sie anschließend die Kapillare in den Elektrodenadapter und stabilisieren Sie alles mit einer Schraube. Bei 360 Grad Celsius.

Löten Sie die Enden der Drähte senkrecht zu den Kabelschuhen. Überprüfen Sie dann, ob ein ausreichend starker elektrischer Kontakt vorhanden ist, indem Sie überprüfen, ob ihre Impedanz etwa 300 Kiloohm bei einem Kilohertz beträgt. Verbinden Sie nun die Kanäle des zweiten Elektrodenadapters mit der Master-Elektrode und löten Sie die Referenz- und Muskelelektroden an die Basis der Master-Elektroden.

Montieren Sie abschließend die Master-Elektrode auf der Schnittstellenplatine des Kopftisches. Befestigen Sie die zweite Elektrode an einem separaten Adapter, nachdem Sie die Honigbienen erhalten haben, kühlen Sie eine auf Eis, bis sie immobilisiert ist. Befestigen Sie als Nächstes die Biene in einem handelsüblichen Plexiglashalter, wobei der Kopf frei liegt.

Tragen Sie erhitztes Zahnwachs auf den Augenansatz und die Verbindung zwischen Kopf und Thorax auf und sichern Sie so den Kopf. Verwenden Sie weiterhin das Wachs, um das Scape-Auge der Antennen auf der Kopfkapsel zu immobilisieren. Vermeiden Sie es, Wachs auf den Fagel aufzutragen, der nach vorne zeigen muss.

Der Pro Bois sollte frei von Impingement sein. Überprüfen Sie, ob es sich bewegen lässt. Rasieren Sie nun die Kopfkapsel, um die Zugänglichkeit zu verbessern.

Füttern Sie dann die Biene mit allen 30 % Saccharose, die sie verbrauchen wird. Dies gewährleistet eine gute Vorbereitung, Rentabilität und Gewebefeuchtigkeit. Schneiden Sie nun mit einem Mikroskalpell vertikal entlang des Augenrandes und horizontal über den Antennenbasen.

Fahren Sie mit dem Schnitt unter dem O-Zell-Auge fort und entfernen Sie die lose Nagelhaut. Die Unterpharynxdrüsen sollten zur Seite geschoben werden, ebenso wie die Luftröhre. Dadurch wird der Weg zum Einführen der Elektrode frei.

Beginnen Sie mit dem Einführen der Referenzelektrode, einem 35 Mikron Silberdraht. Machen Sie zunächst einen kleinen Schnitt in das ipsilaterale Facettenauge. Stecken Sie dann die Elektrode hindurch.

Führen Sie dann den zweiten Draht in den Muskelprojektionsbereich unterhalb des lateralen O-Zell-Auges ein. Um die Positionen der Elektroden später zu visualisieren, tauchen Sie die Elektroden drei Minuten lang in eine Lösung aus 0,5 molar Kaliumchlorid und 5%Alexa Hydrocyte 4 88. Als nächstes positionieren Sie die beiden Elektroden mit Hilfe von Mikromanipulatoren in das Gehirn.

Orientiere dich, indem du den Antennenlappen und den vertikalen Lappen des Pilzkörpers identifizierst. Hier befindet sich eine Elektrode im lateralen Antennenkeulentrakt 180 Mikrometer tief und die andere im medialen Antennenkeulentrakt. Etwa 300 Mikrometer tief eingesetzt.

Schließen Sie die Platzierung der Elektroden ab, indem Sie sie mit zwei Komponenten verankern. Silikon bedeckt den gesamten Raum über dem Gehirn, was auch das Austrocknen des Gewebes verhindert. Fahren Sie dann mit den Aufzeichnungen fort, um die Aktivität der Einheit aus dem extrazellulären aufgezeichneten Signal zu extrahieren.

Verwenden Sie die verfügbare Spike-Sortiersoftware. Verwenden Sie die differenzierten Elektrodenkanäle. Wenden Sie Template-Matching-Techniken gleichzeitig auf alle drei Elektrodenkanäle an, um verschiedene Wellenformkombinationen zu erkennen, die für einzelne Spike-Ereignisse verantwortlich sind.

Und schließlich die Kontrolle für die richtige Trennung der Einheiten. Unter Verwendung der prinzipiellen Komponentenanalyse an den einzelnen Spike-Ereignissen der drei aufgezeichneten differenzierten Elektrodenkanäle. Entfernen Sie nach der Aufnahme vorsichtig das Silikon und die Elektroden von der Biene.

Spülen Sie anschließend das Gehirn mit Bienenringerlösung aus und entfernen Sie die Drüsen und die Luftröhre. Dann injizieren Sie mit einer Mikropipette 5% Mikrorubin, gelöst in einem molaren Kaliumacetat, in den Antennenlappen. Dadurch erhalten Sie eine anterograde Markierung der Spuren des Lappens.

Von hier an führst du alle Schritte in maximaler Dunkelheit aus. Spülen Sie das Gehirn erneut dreimal mit Bienenringern ab und lassen Sie den Farbstoff 30 bis 45 Minuten lang inkubieren. Immobilisiere die Biene, indem du sie im Kühlschrank abkühlst.

Isolieren Sie dann das Gehirn. Fixieren Sie das Gehirn in 4%Para-Aldehyd in 0,1 molaren PBS über Nacht bei vier Grad Celsius und unter sanftem Rühren. Befolgen Sie dies mit Standardprotokollen für Dehydrierung und Reinigung. Nachdem die Projektionsneuronen im Antennenlappen mit Mikrorubin-Tracer zurückgefüllt worden waren, wurde eine Projektionsansicht dieser Neuronen aus orthografischen Schichten entlang der Z-Achse zusammengesetzt.

Der Farbstoff Alexa Hydrocyte 4 88 auf den beiden Elektroden zeigt deren Insertion am medialen Antennenlappen tracted und im lateralen Antennenlappentrakt. Eine 3D-Rekonstruktion der gefärbten Zielzellen und der Elektrodeneinführstellen wurde verwendet, um ein Schema der beiden Antennenkeulenbahnen zu erstellen. Die gleichzeitige Aufzeichnung der beiden Antennenkeulenbahnen bei gleichzeitiger Stimulation der Biene mit unterschiedlichen Geruchskonzentrationen wurde verwendet, um die zeitliche Verarbeitung zu untersuchen. Die Aktivität wurde in den nachfolgenden Verarbeitungsstufen bewertet.

Die Analyse der Antennenlappen-Projektionsneuronen und der extrinsischen Neuronen zeigt die Hauptkomponentenanalyse der Populationsvektoren, dass der Geruch in den Projektionsneuronen verlängert wurde und den Stimulus überdauerte. Im Gegensatz dazu waren in der extrinsischen Neuronenpopulation nur Odor On- und Odor Off-Typen vertreten. Wenn man also die Aktivität mit der Zeit betrachtet, zeigt die extrinsische Neuronenpopulation auf der rechten Seite die Geruchstrennungsaktivität, kurz bevor die Projektionsneuronenpopulation beginnt, ihre geruchsinduzierte Aktivität zu entwickeln.

Die Geruchsstimulation ist grau markiert. Einmal gemeistert, dauert es etwa 30 Minuten, um eine Elektrode zu bauen. Das Vorbereiten der Biene und das Einführen der Elektroden in die Zielregionen kann in einer weiteren halben Stunde erledigt sein, wenn es richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass jeder Schritt viel Übung und Geduld erfordert, bis er gemeistert wird. Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie die Elektrodendrähte zu ihren Verbindungspunkten aufsteigen lassen und aus der gewünschten Gehirnreichweite aufnehmen. Es erforderte solide Kenntnisse der Anatomie des Gehirns von Honigbienen Nach seiner Entwicklung.

Diese Technik ermöglichte es Forschern auf dem Gebiet der Neuropathologie und des Geruchssinns von Insekten, die genauen zeitlichen Beziehungen zwischen der Aktivität verschiedener neuronaler Bahnen und Gehirnzentren bei sich verhaltenden Honigbienen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mehrkanal-Mikrodrahtelektroden konstruiert und verwendet, um gleichzeitig von zwei Gehirnregionen und sich verhaltenden Honigbienen aufzuzeichnen. Sie sollten auch in der Lage sein, die genauen Positionen Ihrer Aufzeichnungselektroden zu visualisieren.