Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren ( Schistocerca Americana) Olfaktorische Circuits

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die geruchsentzogene neuronale Aktivität mehrerer Einheiten aus den ersten drei Signalverarbeitungszentren des Geruchswegs von Insekten aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Heuschrecke in einer speziell entwickelten Kammer festgehalten und eine ihrer Antennen für elektrophysiologische Aufzeichnungen stabilisiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Mikroelektrode aus Glas herzustellen und sie am Fuß einer Sonne einzuführen, um die hervorgerufenen Geruchsreaktionen zu überwachen.

Als nächstes wird die neuronale Aktivität des Heuschreckengehirns aufgezeichnet. Es wird ein mehrstufiges Dissektionsverfahren durchgeführt, um das Nervengewebe freizulegen, das den Input der olfaktorischen sensorischen Neuronen verarbeitet. Der letzte Schritt beinhaltet die geeignete Platzierung der Multi-Elektroden-Arrays, um die neuronale Aktivität des Ensembles von der Heuschrecke, dem Antennenlappen und dem Pilzkörper aufzuzeichnen.

Letztendlich werden die hier demonstrierten extrazellulären Aufzeichnungsmethoden verwendet, um geruchsevozierte Reaktionen an den ersten drei Verarbeitungszentren entlang des Geruchswegs von Insekten zu charakterisieren. Obwohl diese Methode verwendet wurde, um die durch Gerüche hervorgerufene Neuroreaktion in einem relativ einfachen olfaktorischen System von Wirbellosen zu charakterisieren, kann sie auch angepasst werden, um die Ensembleaktivität in anderen neuronalen Systemen zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da einige Schlüsselaspekte dieses Verfahrens, wie z. B. die Platzierung der Elektrode und einige Präparierschritte, sehr schwer zu erlernen sind.

Darüber hinaus sind die Methoden meist qualitativ und wurden im Laufe der Zeit von verschiedenen Laboren unterschiedlich perfektioniert. Um dieses Verfahren zu beginnen, wählen Sie eine junge adulte Heuschrecke beiderlei Geschlechts mit ausgewachsenen Flügeln, aber vor der Paarungsphase aus einer überfüllten Kolonie. Als nächstes halten Sie die Heuschrecke zurück, indem Sie ihre Beine amputieren.

Versiegeln Sie die Amputationsstellen mit Gewebekleber. Befestigen Sie dann die Heuschrecke mit einem kleinen Stück Isolierband, das um ihren Brustkorb drapiert ist, in der speziell angefertigten Kammer. Machen Sie unter einem Präpariermikroskop eine flache Rille in die Wachsplattform für die Platzierung der Antenne.

Setzen Sie die Antenne in die Nut ein und stabilisieren Sie sie mit Bati-Wachs an den beiden Enden der Antenne. Führen Sie danach eine Masseelektrode in den Brustkorb ein. Verwenden Sie Batikwachs, um die Inzisionsstelle abzudichten und das Erdungskabel an Ort und Stelle zu halten.

Legen Sie anschließend die stabilisierte Heuschreckenantenne unter ein Stereomikroskop auf einen Schwingungsisolationstisch. Verbinden Sie die Auslassleitungen der Geruchsflaschen mit dem Geruchsabgaberohr. Positionieren Sie das Geruchsabgaberohr in einem Abstand von wenigen Zentimetern zur Antenne. Die abgegebenen Geruchsdämpfe werden durch einen Vakuumtrichter entfernt, der etwa 10 Zentimeter hinter der Heuschreckenantenne platziert ist.

Stellen Sie dann Glaselektroden mit einer klötzischen Glaskapillare her, mit einer Mikropipette polare Füllung der Glaselektrode mit Heuschreckensalzlösung. Legen Sie anschließend die Glaselektrode in einen Mikropipethalter, der an einem motorisierten Mikromanipulator befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Basis der Aufnahme-Syn unter dem Mikroskop gut sichtbar ist.

Führen Sie die Elektrode vorsichtig in die Basis eines Syns ein. Verstärken Sie anschließend das Signal 10.000 Mal. Verwendung eines AC-Verstärkers.

Filtern Sie das Signal zwischen 0,3 und 10,0 Kilohertz und erfassen Sie es mit einer Abtastrate von 15 Kilohertz. Mit Hilfe eines Datenerfassungssystems kann bei entsprechender Positionierung der Elektrode spontane neuronale Aktivität erkannt werden. Reizevozierte Reaktionen können überwacht werden, indem ein Geruchsimpuls durch das Geruchsabgaberohr abgegeben wird.

Positioniert in der Nähe der Antenne und verfolgen Sie die Veränderung der extrazellulären Aktivität, befolgen Sie die zuvor beschriebenen Rückhalteverfahren. Positionieren Sie die Heuschrecke in einer speziell entwickelten Kammer. Beginnen Sie den Seziervorgang, indem Sie einen Wachsbecher um den Heuschreckenkopf bauen.

Baue zwei Wachstürme auf beiden Seiten des Heuschreckenkopfes, die bis zur Höhe der Antennen reichen. Führen Sie als Nächstes jede Antenne durch ein kleines Stück Polyethylenschlauch, der fest in einer Gummidichtung sitzt. Befestigen Sie dann die Dichtungen so an den Wachstürmen, dass der Kunststoffschlauch frei zur Basis der Antennen oder von ihr weg gleiten kann, während verhindert wird, dass sich die Antennen bewegen.

Beginnen Sie dann unter dem Mikroskop, einen Wachsbecher um den Heuschreckenkopf zu bauen, um eine Kochsalzlösung während und nach der Dissektion zu ermöglichen. Der Wachsbecher sollte direkt über den Mundwerkzeugen beginnen, beide Wachstürme umfassen und über die Facettenaugen hinausragen. Sobald der Wachsbecher fertig konstruiert ist, befestigen Sie den Boden der Antennen mit Epoxidharz am unteren Ende des Kunststoffschlauchs.

Dadurch wird sichergestellt, dass die Antennen auch nach der Entfernung der umgebenden Nagelhaut an Ort und Stelle bleiben. Halten Sie den Wachsbecher von diesem Zeitpunkt an mit Kochsalzlösung gefüllt. Entfernen Sie nun den zentralen rechteckigen Bereich zwischen den beiden.

Eine Antenne. Anschließend entfernen Sie die Nagelhaut in den benachbarten Regionen, ohne die Facettenaugen oder die Nagelhaut an der Basis der Fühler zu stören. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Luftsäcke und Fettkörper, die das Gehirn umgeben.

Das Heuschreckengehirn sollte nun deutlich zu erkennen sein. Zwischen beiden befinden sich die Hirnregionen, die die Geruchsinformation verarbeiten. Eine Fühlerin zieht vorsichtig am Darm und schneidet ihn mit einer feinen Schere ab.

Entfernen Sie dann die Flügel und machen Sie einen kleinen Schnitt im Bauch direkt über dem Enddarm. Entferne den Darm, indem du mit einer groben Pinzette am hinteren Darm ziehst. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Darmbewegung die Zubereitung nicht destabilisiert.

Um das Austreten von Kochsalzlösung zu verhindern. Binden Sie den Bauch mit Nahtfäden direkt vor der Schnittstelle fest. Verwenden Sie als Nächstes eine kleine Plattform aus einer dünnen Drahtschlaufe, die mit einer feinen Wachsschicht überzogen ist, um das Gehirn anzuheben und es für die Elektrophysiologie zu stabilisieren.

Das Gehirn wird durch eine halbtransparente Hülle geschützt, die vor der Aufzeichnung entfernt werden muss. Um die Hülle zu schwächen, entleeren Sie den Wachsbecher teilweise und verteilen Sie vorsichtig eine kleine Menge Protease auf der Oberfläche des Gehirns. Spülen Sie das Gehirn nach etwa fünf bis 10 Sekunden der Enzymanwendung gründlich mit Kochsalzlösung aus.

Kneifen und ziehen Sie dann die Hülle sehr vorsichtig mit einer superfeinen Pinzette nach oben, um sie aufzureißen und die Aufnahmestellen freizulegen. Bei diesem Verfahren wird das Heuschreckenpräparat unter einem Stereomikroskop auf einen Schwingungsisolationstisch gelegt. Halten Sie eine konstante Kochsalzperfusionsrate von etwa 40 Millilitern pro Stunde aufrecht.

Verwenden Sie während des gesamten Experiments einen Chlorid-Silberdraht, der in den mit Kochsalzlösung gefüllten Wachsbecher getaucht ist, als Erdungselektrode. Bereiten Sie die Einrichtung der Geruchsabgabe vor, ähnlich wie beim Experiment zur Aufzeichnung mit einem einzelnen Sensor. Vor dem Experiment galvanisieren Sie die Elektroden mit Gold, um die Impedanzen im Bereich von 200 bis 300 Kilo zu erreichen.

Verwenden Sie eine 16-Kanal-Siliziumsonde für die Aufzeichnung von Hauptneuronen. Unter dem Mikroskop. Positionieren Sie die Elektrode nahe der Oberfläche eines Antennenlappens und führen Sie sie mit einem manuellen Mikrom-Manipulator an einer idealen Aufnahmestelle vorsichtig in das Gewebe ein, extrazelluläre Signale werden von mehreren Aufzeichnungskanälen aufgenommen und haben ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis.

Für Kenyon-Zellaufzeichnungen wird ein speziell angefertigter Twisted Wire Tero verwendet, der nach den Verfahren für die Galvanisierung galvanisiert wird. Die Silikonsonde platziert dann das Tero auf der Oberfläche des Pilzkörpers. Da die Samara der kenianischen Zellen auf die oberflächliche Schicht dieser Region beschränkt sind, können sowohl die Hauptaufnahmen von Neuronen als auch von kenianischen Zellen gleichzeitig mit demselben Heuschreckenpräparat gemacht werden.

Nachdem Sie den Aufnahmeort identifiziert haben, warten Sie mindestens 15 Minuten, um die Stabilisierung der Elektroden zu ermöglichen. Erfassen Sie dann das extrazelluläre Signal bei 15 Kilohertz. Filtern Sie ihn zwischen 0,3 und sechs Kilohertz und verstärken Sie ihn mit einem 16-Kanal-Wechselstromverstärker, sowohl spontan als auch reizevoziert.

Es kann eine mehrgliedrige neuronale Aktivität von Projektionsneuronen in einem Antennenlappen beobachtet werden. Rohe extrazelluläre Spannungsspuren, die die Reaktionen eines olfaktorischen Rezeptorneurons auf zwei verschiedene Gerüche zeigen. Hier sind zwei Oktal- und ein H-Ethanol dargestellt.

Eine repräsentative extrazelluläre Spur aus einer Aufzeichnung eines Antennenkeulens mit mehreren Einheiten ist hier zu sehen. Die Aktionspotentiale oder -spitzen unterschiedlicher Amplituden, die von verschiedenen Hauptneuronen ausgehen, können in dieser Spannungskurve beobachtet werden. Beachten Sie, dass während des durch das graue Feld angezeigten Zeitraums ein viersekündiger Geruchsimpuls ausgelöst wurde.

Ein Beispiel für eine extrazelluläre Aufzeichnung des Pilzkörpers ist hier zu sehen. Im Gegensatz zu olfaktorischen Rezeptorneuronen und Hauptneuronen haben Kenyon-Zellen im Körper von Insektenpilzen eine geringere Grundaktivität und reagieren spärlich und selektiv auf Gerüche. Um die Antworten einzelner Einheiten aus diesen Aufzeichnungen mit mehreren Einheiten zu isolieren, führen wir ein Spike-Sortierverfahren mit veröffentlichter Software offline durch.

Beispiele für die prinzipielle Sortierung von Neuronen und kenianischen Zellen sind hier zu sehen, nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben. Sollte ein gutes Verständnis dafür haben, wie extrazelluläre Multiunit-Aufzeichnungen durchgeführt werden, um die neuronale Aktivität des Ensembles in den ersten drei olfaktorischen Zentren entlang des Insert-Geruchswegs zu charakterisieren.