1: Calcium Imaging in Neuronen

Die Kalziumbildgebung ist eine äußerst nützliche Technik, um die vielfältigen Rollen zu untersuchen, die Kalziumionen in funktionierenden Neuronen spielen. Kalziumionen erzeugen eine Vielzahl intrazellulärer Signale, die Schlüsselfunktionen steuern, wie z. B. die Freisetzung von Neurotransmittern aus synaptischen Vesikel. Calcium-Imaging-Verfahren ermöglichen die direkte Messung des dynamischen Calciumflusses innerhalb von Neuronen und neuronalem Gewebe. Dieses Video gibt einen Überblick über die Wirkungsweise von Calcium-Indikatorfarbstoffen, wie ein Calcium-Imaging-Experiment durchgeführt wird und diskutiert schließlich einige der Anwendungen dieser Technik.

Lassen Sie uns zunächst die biochemischen Prinzipien von Kalziumindikatorfarbstoffen überprüfen.

Calcium-Indikatorfarbstoffe sind modifizierte Chelatormoleküle, wie z. B. Fura-2, die aus zwei Hauptkomponenten bestehen. Die erste ist die Chelatorstelle, die Kalzium selektiv bindet. Die zweite ist eine fluoreszierende Stelle, die Licht mit einer bestimmten Wellenlänge emittiert, wenn sie von einer Anregungswellenlänge des ultravioletten Lichts beleuchtet wird.

Die Bindung von Kalzium an den Farbstoff verändert seine Fluoreszenzeigenschaften, was eine Möglichkeit bietet, die Änderungen der Kalziumkonzentration zu quantifizieren, die hier durch den Unterschied in der Fluoreszenzintensität dargestellt werden, die von diesem Neuron bei zwei verschiedenen Anregungswellenlängen emittiert wird.

Die meisten Kalziumindikatorfarbstoffe werden weiter modifiziert, damit sie die Zellmembran leicht passieren können, und werden entweder in die Badelösung mit den Neuronen eingeführt oder in das Gehirngewebe für Ganztierstudien injiziert.

Einige Farbstoffe haben duale Anregungs- oder duale Emissionseigenschaften, je nachdem, ob Calcium gebunden ist oder nicht. Nehmen wir zum Beispiel den Farbstoff Fura-2, der eine andere Anregungswellenlänge hat, wenn Kalzium gebunden ist, als wenn es nicht gebunden ist. Nimmt man das Verhältnis der Emissionsintensität bei den beiden Anregungswellenlängen, kann eine viel genauere Abschätzung der Kalziumkonzentration vorgenommen werden.

Duale Anregungs- oder Emissionsfarbstoffe wie Fura-2 werden als ratiometrische Calciumindikatoren bezeichnet. Es gibt nicht-ratiometrische Farbstoffe, die eine einzige Anregungs- und Emissionswellenlänge haben. Sie sind jedoch anfälliger für Photobleaching, d. h. eine Schwächung oder einen Verlust der Fluoreszenz bei längerer Lichteinwirkung.

Ein wichtiger Schritt vor der Verwendung eines Farbstoffs in einem Experiment besteht darin, die Fluoreszenzmessungen des Farbstoffs mit Lösungen bekannter Kalziumkonzentrationen zu kalibrieren. Dies wird es den Wissenschaftlern ermöglichen, die intrazellulären Kalziumkonzentrationen auf der Grundlage der gemessenen Emissionsintensitäten während der Experimente genau abzuschätzen.

Nachdem wir nun gelernt haben, wie Kalziumindikatoren funktionieren, wollen wir untersuchen, wie man den Kalziumfluss in plattierten Neuronen abbilden kann.

Beginnen Sie mit der Zubereitung des Kalziumindikatorfarbstoffs Ihrer Wahl, wie z. B. Fura-2, und mischen Sie ihn mit zusätzlichen physiologischen Lösungen. Wirbeln Sie die Lösung vor, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Sobald alles gut vermischt ist, in eine Schüssel geben. Legen Sie nun das Deckglas mit den kultivierten Neuronen in die Schale mit der Farbstofflösung. Als nächstes inkubieren Sie die Neuronen im Dunkeln für die erforderliche Zeit bei der entsprechenden Temperatur, in diesem Fall 30 Minuten bei 37 °C. Nach der Inkubationszeit das Deckglas ohne Farbstoff in eine Schale geben.

Der nächste Schritt besteht darin, das Deckglas auf die Bildgebungskammer des Mikroskops zu montieren. Schließen Sie nach der Montage die Eingangsleitung des Perfusionssystems an und füllen Sie die Kammer langsam. Befestigen Sie die Kammer am Mikroskoptisch und installieren Sie die Ausgangsperfusionsleitungen, um einen kontinuierlichen Fluss im gesamten Perfusionssystem zu gewährleisten.

Jetzt, da der Mikroskoptisch bereit ist, bringen Sie die Neuronen mit sichtbarem Licht in den Fokus. Testen Sie den Farbstoff, indem Sie die Zellen bei Wellenlängen von 340 und 380 nm beleuchten. Zur Erinnerung: Mit Fura-2 sollten nicht-aktivierte Neuronen mehr Licht emittieren, wenn sie durch 380 nm angeregt werden, da Kalzium nicht gebunden ist.

Passen Sie als Nächstes die Kameraeinstellungen an, um den Dynamikbereich zu optimieren, bevor Sie das Experiment starten. Erfassen Sie ein Bild bei jeder Wellenlänge und verwenden Sie dann das Werkzeug "Region of Interest" oder "ROI", um die Hintergrundintensität bei jeder Wellenlänge zu messen. Geben Sie die Hintergrundwerte in die Steuerungssoftware ein, so dass sie von den nachfolgenden Bildern abgezogen werden können.

Sobald die Ersteinrichtung abgeschlossen ist, wählen Sie die etwa fünf Sichtfelder aus, die für das Experiment abgebildet werden sollen, und speichern Sie die Koordinaten in der Steuerungssoftware. Während des Experiments bewegt sich der automatisierte Tisch zu einem Feld, sammelt ein Verhältnis der Feldintensität bei 340 und 380 nm Wellenlängen und bewegt sich zum nächsten Feld, bis alle Felder gesammelt sind.

In einigen Experimenten wird der Perfusionsflüssigkeit ein pharmakologisches Mittel zugesetzt, das Veränderungen des intrazellulären Kalziumspiegels verursacht. Eine kaliumreiche Lösung, die Neuronen depolarisiert, kann die intrazelluläre Kalziumkonzentration ansteigen lassen, wie in dieser Zeitraffer-Bildserie gezeigt, und dient als gute Positivkontrolle. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, fahren Sie mit der Analyse fort.

Um die Ergebnisse zu analysieren, wählen Sie mithilfe der Software interessante Bereiche aus, die Neuronen oder Teile von Neuronen enthalten. Verwenden Sie als Nächstes die Software, um die bildverhältnismetrischen Intensitätsinformationen von beiden Wellenlängen bei jedem ROI in allen gesammelten Bildern zu messen. Mit diesen Informationen kann eine quantitative Abschätzung der Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentrationen im Zeitverlauf vorgenommen werden.

Nachdem Sie nun verstanden haben, wie die Kalziumbildgebung in Neuronen erreicht wird, schauen wir uns einige der Möglichkeiten an, wie diese wertvolle Methode heute in der Forschung angewendet wird.

In erster Linie wird mit Hilfe der Calcium-Bildgebung untersucht, wie intrazelluläres Calcium in Bezug auf die neuronale Aktivität fließt.

In dieser Studie wurden einzelne Neuronen mit einem Kalziumindikatorfarbstoff gefüllt, während sie mit einer Patch-Clamp aufgezeichnet wurden. Die präzise Steuerung des Membranpotentials, die durch die Patch-Clamp-Technik ermöglicht wird, gibt Einblick in die Dynamik des Kalziumflusses.

Die Kalzium-Bildgebung ermöglicht es Forschern, die hochsynchrone Netzwerkaktivität von Neuronen zu untersuchen.

Hier nutzten Neurowissenschaftler Kalzium-Bildgebung, um das Fluoreszenzsignal von 40 Neuronen zu bewerten. Mit diesen Informationen können Netzwerkeigenschaften wie Signalausbreitung und neuronale Korrelationen bestimmt werden.

Die Kalziumdynamik kann auch zeigen, wie Neuronen Signale aus der Außenwelt, wie z. B. Gerüche, verarbeiten.

In diesem Experiment wurden pheromonempfindliche Organe, die aus einer Mausnase gewonnen wurden, in Kultur gezüchtet. Neuronen im Gewebe wurden mit Fura-2 inkubiert und abgebildet, während ihnen Geruchsstoffe wie Urin oder gereinigte Pheromone präsentiert wurden. Durch die Manipulation der Expression von Geruchsrezeptorproteinen in olfaktorischen Neuronen ist es möglich, direkt zu visualisieren, wie ein einzelnes Protein die Fähigkeit einer Zelle beeinflusst, auf einzigartige Gerüche zu reagieren.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Kalziumbildgebung in Neuronen gesehen. In diesem Video haben wir die Eigenschaften hinter der Technik besprochen und ein typisches Experiment überprüft.

Angesichts der vielen wichtigen Funktionen von Kalzium wird die Kalziumbildgebung ein wichtiges Werkzeug für das Verständnis von Neuronen und ihrer Interaktion miteinander bleiben.

Danke fürs Zuschauen!