Optische Aufnahme überschwellige neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung

Das übergeordnete Ziel des FollowMe-Experiments ist es, die neuronale Spike-Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem im ersten Schritt der Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration in einem Neuron-Soma, das mit jedem Aktionspotential assoziiert ist, mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet wird. Die Zwei-Photonen-Anregung und ein Random-Access-Scanning-Prinzip werden verwendet, um Kalziumfluoreszenzsignale von 40 Neuronen-Somatos mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung aufzuzeichnen.

Im zweiten Schritt werden die genauen Spike-Timings mit Hilfe eines Dekonvolutionsalgorithmus aus den Fluoreszenzsignalen extrahiert. Diese Technik kann verwendet werden, um die Spike-Aktivität von Dutzenden von Neuronen aufzuzeichnen. Die Spike-Daten können dann verwendet werden, um gegenseitige Informationen, die Signalausbreitung zwischen neuronalen Populationen oder Neurokorrelationen zu messen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Mikroelektrodenaufzeichnungen besteht darin, dass man die Neuronen-Spike-Aktivität von einer großen Anzahl von Neuronen aus einer lokalen Population aufzeichnen kann. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zur kortikalen Funktion auf der Ebene lokaler Netzwerke von Neuronen zu beantworten, wie z.B. die Bedeutung von Korrelationen bei der Suche nach Informationen und Änderungen in der Netzwerkdynamik mit der Cortico-Plastizität. Für die Zwei-Photonen-Anregung wird ein Infrarot-Pulslasersystem mit Femtosekundenpulsen verwendet. Eine hohe Laserausgangsleistung ist erforderlich, um die großen Verluste auszugleichen, die durch die optischen Komponenten des Systems verursacht werden.

Ein Prediger pro System, bestehend aus zwei Prismen, überträgt eine negative Gruppengeschwindigkeitsdispersion auf die Laserpulse, bevor die optischen Deflektoren zum Ausgleich der durch die AODs eingeführten zeitlichen Dispersion dienen: Zwei AODs mit großen Öffnungen lenken den Laserstrahl in zwei Dimensionen ab. Eine reflektierende Beugungsabstufung mit 100 Rillen pro Millimeter wird 13 Zentimeter hinter den AODs platziert, um die von den AODs eingebrachte räumliche Dispersion zu kompensieren. Bei der Verwendung von kurzen Laserpulsen wird der Laserstrahl mit zwei Relaisteleskopen in den Kameraport eines aufrechten Mikroskops gelenkt.

Iris werden in regelmäßigen Abständen platziert, um die optischen Komponenten auszurichten. Ein dichroitischer Strahlteiler vor dem Objektiv überträgt das infrarote Anregungslicht auf die Probe und reflektiert das Fluoreszenzlicht von der Probe auf einen Detektor. Epi- und trans-Fluoreszenzdetektoren sammeln das Fluoreszenzsignal durch das Objektiv und die Kondensator-Farbglasfilter sind vor den Detektoren platziert, um zu verhindern, dass Anregungslicht die Detektoren erreicht.

Die Ablenkwinkel des Außendurchmessers A werden von einem Computer gesteuert, der mit einer digitalen Analogwandlerplatine ausgestattet ist, die wiederum spannungsgesteuerte Oszillatoren antreibt. Das Signal von den Photomultipliern wird durch einen Tiefpass-Butterworth-Filter mit einer Grenzfrequenz von 100 Kilohertz weitergeleitet und von einem analogen Digitalwandler mit einer Taktrate von 156,25 Kilohertz digitalisiert, bevor es zur Analyse auf einem Computer gespeichert wird, Ausrichtung und elektrisches Rauschen werden durch Aufzeichnung der Verteilung von Fluoreszenzsignalen mit und ohne Laserlicht bei niedriger und hoher Verstärkung der Photomultiplier getestet, sowie mit und ohne Indikator beruht das Dithered Random Access Scanning auf dem Nachweis eines intrazellulären Kalziumanstiegs. Der erste Schritt im Protokoll besteht darin, eine große Anzahl von Neuronen durch Bolusinjektion mit der Esther-Form eines Kalziumindikators zu färben.

Zeichnen Sie als Nächstes die Aktivität des Somas an jedem Neuron an vier Stellen für 6,4 Mikrosekunden an jedem Ort auf. Um die interessierenden Neuronen auszuwählen, erfassen Sie ein Vollbild mit 256 x 256 Pixeln. Wählen Sie dann manuell die Zentren der Neuronen aus, die in diesem Bild aufgezeichnet werden sollen.

Drei Punkte in einem Abstand von zwei Mikrometern um jedes Zentrum werden von der Steuerungssoftware in jedem Zyklus automatisch hinzugefügt. Das Fluoreszenzsignal wird von den vier Stellen in allen 40 Neuronen aufgezeichnet. Die Aufzeichnung aller Neuronen in einem Zyklus dauert 1,536 Millisekunden.

Wiederholen Sie diese sequenzielle Aufzeichnung aller 40 Neuronen fünf Sekunden lang. Die Spike-Detektion von fluoreszierenden somatischen Kalziumsignalen beruht auf einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis kann durch Erhöhung der Anregungsintensität erreicht werden.

Die Anregungsintensität kann jedoch nur aufgrund von Lichtschäden bis zu einer gewissen Grenze erhöht werden. Es gibt nur ein sehr kleines Fenster der Anregungsintensität, in dem die Lichtschädigung gering ist und das Signal-Rausch-Verhältnis ausreicht, um einzelne Spitzen zu erkennen, um sicherzustellen, dass die aufgezeichneten Signale innerhalb des Fensters der Erkennung hoher Spitzen liegen. Während eines Experiments werden eine Reihe von Online-Analysesoftwares verwendet, die von unserem Labor entwickelt wurden.

Berechnen Sie als Nächstes die ungefähre Photonenrate pro Neuron aus einem kurzen Zeitfenster des Basisrauschens von etwa 100 bis 200 Millisekunden. Die Anzahl der Photonen und die Photonenrate werden aus den Fluoreszenzwerten berechnet, indem die Verteilung der relativen Fluoreszenzänderungen an diese Gleichung angepasst wird, dann die Basislinienfluoreszenz aus demselben Zeitfenster berechnet und als Funktion von Zeit oder Versuchen dargestellt wird. Halten Sie den durchschnittlichen Abfall der Basislinie unter 0,0002 pro Sekunde, indem Sie die Laserleistung anpassen.

Denn die Spike-Erkennung nimmt bei Überschreitung dieses Grenzwerts rapide ab. Überprüfen Sie danach alle 10 bis 20 Minuten die somatischen Positionen der Neuronen, indem Sie ein Vollbildbild aufnehmen. Passen Sie die Aufnahmeorte bei Bedarf an.

Die fluoreszierenden Signale, die aus der neuronalen Aktivität resultieren, fressen aufgrund des langen Zerfalls des transienten Kalziums oft in der Zeit. Bei diesem Verfahren wird eine Dekonvolutionsmethode verwendet, um Spikes und Spike-Timings aus den Fluoreszenzsignalen zu erzeugen. Hier verwenden wir einen genetischen Algorithmus, um das wahrscheinlichste Spike-Train-Modell zu bestimmen, das dem aufgezeichneten Fluoreszenzsignal entspricht.

Mit jeder Iteration des Algorithmus nähert sich die maximale Wahrscheinlichkeit asymptotisch ihrem Maximum, das durch das Rauschen der Fluoreszenzaufnahmen gegeben ist. In homogenen Populationen von Neuronen kann das Spike-evozierte Kalziumsignal zwischen den Neuronen variieren. Für die unüberwachte Analyse großer Datensätze haben wir einen Algorithmus entwickelt, der die Variation des Spike-evozierten Kalziumsignals von Neuron zu Neuron berücksichtigt, um eine große Anzahl falsch positiver Detektionen zu vermeiden.

Die gemeinsame Verteilung der Amplituden- und Abklingzeitkonstante von Single-Spike-evoziertem Calcium-Transient wird in einer separaten Reihe von Experimenten mit demselben Neuronentyp unter denselben experimentellen Bedingungen aufgezeichnet. Um langsame Basislinienänderungen zu berücksichtigen und die Rechenkosten der Dekon zu reduzieren, werden längere Aufzeichnungen in mehrere kürzere Kurven von ein bis fünf Sekunden für jedes Neuron in jeder Aufzeichnung unterteilt, der Dekonvolutionsalgorithmus kann eine große Anzahl von Modellen testen, bis zu 1 Million verschiedene Modelle oder mehr, um die Dekonvolution zu beschleunigen. Ein Experiment wird auf bis zu 10 verschiedenen Computern entfaltet. Parallel dazu.

Nach der Dekonvolution werden die Spike-Daten analysiert und inspiziert. Das Peri-Stimulus-Zeit-Histogramm, die Spike-Wahrscheinlichkeit und die Neuronen-Feuerrate werden automatisiert berechnet. Hier sind die Beispiele für ein Fluoreszenzsignal, das mit einer sehr niedrigen Anregungsrate aufgezeichnet wurde, und das andere mit einer sehr hohen Anregungsrate innerhalb des Nachweisfensters.

Beachten Sie, dass jedes Beispiel die Reaktion auf eine Spitze zeigt. Hier ist eine mikroskopische Aufnahme eines akuten Hirnschnitts und zweier Stimulationspipetten, die in derselben kortikalen Säule platziert sind. In Schicht vier zeigen diese neuronale Reaktionen auf die sich wiederholenden Reize, und dieses Diagramm zeigt Shannons gegenseitige Information, die von der aufgezeichneten Population von Neuronen signalisiert wird.

Hier ist die Messung der Ausbreitung der Superschwellen-Spike-Aktivität zwischen verschiedenen Populationen kortikaler Neuronen. Dies sind die detektierten Spikes in kortikalen Neuronen, die Reaktion auf elektrische Stimulation der thal kortikalen Fasern. Bei der Aufzeichnung neuronaler Aktivität mit Random Access Scanning ist es sehr wichtig, innerhalb des Erkennungsfensters aufzuzeichnen.

Andernfalls ist es sehr leicht, mit unbrauchbaren Datensätzen zu enden. Die optische Spike-Erkennung steckt noch in den Kinderschuhen. Es gibt viel Raum für Verbesserungen.

Mit einigen Verbesserungen zeichnen wir von noch mehr Neuronen auf. Mit anderen Verbesserungen werden wir sogar in der Lage sein, wache und sich verhaltende Tiere aufzunehmen.