Zwei-Photonen-Calcium Imaging in Mäuse Navigieren in einer Virtual-Reality-Umgebung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Schlüsselaspekte der chronischen Zwei-Photonen-Bildgebung bei Mäusen durchzuführen und eine Virtual-Reality-Umgebung zu untersuchen. Dies wird durch die Modifikation eines Zwei-Photonen-Mikroskops für eine schnelle und stabile Bildgebung bei sich verhaltenden Mäusen erreicht. Als nächstes wird ein druckluftgestütztes Laufband aufgebaut, das in der Lage ist, die Fortbewegung zu verfolgen.

Dann wird eine Virtual-Reality-Umgebung vorbereitet, in der ein LED-Projektor verwendet wird, der mit dem Mikroskop synchronisiert ist, um den Lichtverlust zu minimieren. Dadurch werden gute und stabile Bildaufnahmen durch die Reduzierung von Bewegungsartefakten, die Reduzierung von Lichtlecks und die Minimierung der Lichtbeschädigungskante erzielt. Obwohl diese Methode zur Messung der Neuroaktivität während der Navigation in einer Virtual-Reality-Umgebung verwendet werden kann, kann sie auch leicht an eine Vielzahl unterschiedlicher Verhaltensparadigmen angepasst werden, die eine visuelle Stimulation erfordern.

Alle tierischen Eingriffe wurden nach den Richtlinien des Veterinäramtes des Kantons Basil sta. Das Zwei-Photonen-Mikroskop, das in diesen Experimenten zum Einsatz kommt, besteht aus einem Scankopf, der aus einem Acht- oder 12-Kilohertz-Resonanzscanner und einem Standard-Galvanometer besteht. Dies ermöglicht Bildraten von 40 oder 60 Hertz bei 750 mal 400 Pixeln und reduziert durch Gehirnbewegungen verursachte Bildverzerrungen, Photobleaching und Phototoxizität.

Ein piezoelektrischer Hochgeschwindigkeits-Z-Stepper wird verwendet, um sequenziell zeitverschachtelte Bilder in mehreren Tiefen aufzunehmen. Ein mechanischer Blinder wird verwendet, um die Laserbelastung des Gewebes an den Wendepunkten des Scanpfads zu reduzieren, der Blanker muss einstellbar sein, um seine Breite einzustellen. Abhängig von der Amplitude des Resonanzscanners schließen Sie ein Luftzufuhrrohr mit einem Innendurchmesser von mindestens 10 Millimetern an den Kugelhalter des Laufbandes an und platzieren Sie eine BLE-Menge Schlauch zwischen der Hauptluftzufuhr und dem Ballhalter, um die Geräuschentwicklung zu reduzieren.

Legen Sie eine Kugel aus Polystyrolschaum mit einem Durchmesser von 20 Zentimetern in einen speziell entwickelten und 3D-gedruckten Kugelhalter. Wenn das Verhaltensparadigma nur eine Vorwärts- und Rückwärtsbewegung erfordert, führen Sie einen Stift wie eine 19-Gauge-Injektionsnadel an der Seite des Balls ein. Um die Bewegung des Balls in der horizontalen Achse einzuschränken, verwenden Sie eine oder zwei optische Computermäuse, um die Bewegung des Balls um zwei bzw. alle drei Achsen zu verfolgen.

Um die Virtual-Reality-Umgebung vorzubereiten, verwenden Sie LED-Projektoren oder Computerbildschirme mit LED-Hintergrundbeleuchtung für die Anzeige. Integrieren Sie eine Gating-Schaltung für schnelles Flackern der LEDs während der Bildgebung. Die Flimmerfrequenz von 24 Kilohertz liegt um Größenordnungen über der Flimmerfusionsschwelle, oberhalb derer das Flimmern vom Tier nicht mehr wahrgenommen wird.

Stellen Sie die exakte Flimmerfrequenz und das Tastverhältnis ein, um die Lichtleistung des Projektors mit den Wendepunkten des Resonanzscanners für die Pupillenverfolgung zu synchronisieren, und verwenden Sie eine CMO-basierte Videokamera. Stellen Sie sicher, dass die Kamera keinen Infrarot-Sperrfilter enthält. Etwa zwei bis drei Wochen nach der Injektion des genetischen Kalziumindikators und der Implantation eines Schädelfensters verwenden Sie eine Epi-Fluoreszenzbeleuchtung, um das Schädelfensterimplantat auf Klarheit und Ausprägung zu überprüfen.

Deutlich sichtbar und scharf definiert. Die Grenzen der oberflächlichen Blutgefäße sind ein guter Hinweis darauf, dass das Fensterimplantat für die Bildgebung ein bis zwei Tage später geeignet ist. Um das Zwei-Photonen-Experiment durchzuführen, messen Sie die Laserleistung und stellen Sie sie an der Probe auf einen Wert unter 50 Milliwatt ein.

Schalten Sie dann den Luftstrom zum kugelförmigen Laufband ein. Befestigen Sie das Tier mit dem nächsten Kopf auf dem kugelförmigen Laufband. Die ersten Male ist die Maus kopffixiert.

Dieser Prozess kann erleichtert werden, indem das Tier kurzzeitig mit Iso-Fluor sediert wird. Sobald sich das Tier an das Verfahren gewöhnt hat, kann die Montage in der Regel ohne Sedierung durchgeführt werden. Beachten Sie, dass es wichtig ist, den Stress für das Tier während dieses Verfahrens zu minimieren.

Positionieren Sie dann das Anzeigesystem so nah wie möglich am Tier, um den Zugang zum Tier zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass das Schädelfensterimplantat frei von Schmutz ist und reinigen Sie es ggf. mit Wasser, tragen Sie klares Ultraschallgel als Tauchmedium zwischen Schädelfenster und Wasserimmersionsobjektiv zur Lichtabschirmung auf. Wickeln Sie ein Stück schwarzes Klebeband um das Objektiv und die Kopfstange.

Bewegen Sie die Arena der virtuellen Umgebung in ihre endgültige Position und stellen Sie die Videokamera für die Pupillenverfolgung ein. Stellen Sie abschließend den Laser-Blanker so ein, dass er der während des Experiments verwendeten Scanamplitude entspricht, und beginnen Sie mit der Datenaufzeichnung, wenn die Experimente abgeschlossen sind. Euthanasieren Sie das Tier gemäß den Richtlinien Ihrer Institution.

Die Bildqualität in der Zwei-Photonen-Calcium-Bildgebung von Zellpopulationen, die mit einem genetischen Calciumindikator markiert sind, hängt weitgehend von der Qualität des Schädelfensterimplantats ab, wie hier gezeigt: Bei der Überprüfung des Schädelfensters auf Klarheit nach der Virusinjektion sollte kein Granulationsgewebe oder Knochennachwachsen sichtbar sein. Darüber hinaus sollte das Muster der oberflächlichen Blutgefäße unverändert bleiben und die Grenzen des Gefäßsystems scharf definiert werden. Gleichzeitig sollte der BOI der markierten Zellen unter einem Epi-Fluoreszenzmikroskop deutlich sichtbar sein.

Im Idealfall ist die Präparation so stabil, dass Verzerrungen der beiden Photonenbilder, die durch die Fortbewegung der Maus induziert werden, im Bild nach der Frameregistrierung nicht sichtbar sind. Lichtlecks aus dem visuellen Stimulationssystem können vollständig beseitigt werden, indem die Lichtleistung des Projektors korrekt auf die Wendepunkte des Resonanzscanners abgestimmt wird. Wenn keine Daten erfasst werden, sollte die Flimmerfrequenz der Lichtquelle doppelt so hoch sein wie die Abtastfrequenz.

In diesem Beispiel wurde die Blindblende entfernt, um den Effekt des Lichtlecks zu veranschaulichen, das in den orangefarbenen Kästchen während der visuellen Stimulation gezeigt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie in der Bildgebung eine doppelte Leistung erbringen können: das Verhalten von Mäusen und das Navigieren in einer Virtual-Reality-Umgebung. Neben der Einrichtung der hier beschriebenen Bildgebungs- und Virtual-Reality-Systeme liegt der Schlüssel zum Erfolg bei diesen Experimenten in der Beherrschung der Schädelfensterimplantattechnik.

Ein sauberes Implantat ist die Voraussetzung für qualitativ hochwertige Bilder und stabile Aufnahmen.