Name: Zwei-Photonen-Calcium Imaging in Mäuse Navigieren in einer Virtual-Reality-Umgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-20T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Lernen Sie Zwei-Photonen-Calcium-Imaging bei Mäusen in Virtual-Reality-Umgebungen. Diese Methode minimiert Bewegungsartefakte und Lichtleckage für stabile neuronale Aufnahmen während der Navigation.

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Diese Arbeit wurde von der Friedrich-Miescher-Institut für biomedizinische Forschung der Max-Planck-Gesellschaft, und der Human Frontiers Science Program unterstützt.

Alle Tier Verfahren wurden genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Veterinärdirektion des Kantons Basel-Stadt durchgeführt. 1. Hardware-und Software-Setup <ol><li> Zwei-Photonen-Scanning-Mikroskop-Setup: <ol><li> Verwenden eines gepulsten IR-Laser als Beleuchtungsquelle (Pulsbreite &lt;120 fs). </li><li> Verwenden Sie einen Scankopf eines 8 oder 12 kHz Resonanz-Scanner und ein Standard-Galvanometer Hinweis aus:. Dies ermöglicht Bildraten von 40 oder 60 Hz bei 750 x 400 Pixel. Eine hohe Bildrate ist entscheidend für die Minimierung Gehirn Bewegung induzierte Bildverzerrung. Darüber hinaus schnell Resonanzscanergebnisse in einer höheren Signalausbeute und reduziert Bleichen 16 und Phototoxizität. </li><li> Verwenden Sie einen Piezo-Hochgeschwindigkeits-z-Schritt zu erwerben zeitverschachtelten Bilder nacheinander an verschiedenen Tiefen. Hinweis: Dies ist optional und wird verwendet, um Daten-Ausbeute auf Kosten der Framerate zu erhöhen. </li><li> Verwenden Sie amechanische Blanker der Laserbelichtung auf das Gewebe zu reduzieren. Die Breite des Blanker Abhängigkeit von der Amplitude der Resonanzscanner. Hinweis: Wegen der sinusförmigen Natur der Abtastbahn eines Resonanzscanner, bewegt sich der Laserstrahl vergleichsweise langsam an den Scan Wendepunkten. Zu einer Schädigung des Gewebes an diesen Wendepunkten, wo die Laserbelichtung am größten zu verhindern, wird eine mechanische Austaster in der Brennebene zwischen dem Scan-und Rohrlinsen, die den Laserstrahl stoppt eingeführt. </li><li> Zur Datenerfassung mit einem Hochgeschwindigkeits-Digitizer (800 MHz) in Kombination mit einem Field-Programmable Gate Array (FPGA). Hinweis: Die FPGA-Hochpass-Filter und Sortierfächer der PMT-Signal in Pixel. Die Kombination des Hochpass-Filters auf dem FPGA und der wirksamen Tiefpaßfilter auf dem PMT-Verstärker Ergebnis in einem Bandpassfilter zentriert rund um die Wiederholungsrate des Lasers (80 MHz). Probe-FPGA-Code ist als Ergänzung zur Verfügung gestellt. </li></ol></li><li> Air-gestützte Laufband Setup basiert auf dem Design von Dombeck und Kollegen 2 <ol><li> Verbinden der Kugelhalter mit einer Luftversorgungsleitung mit einer Luftzufuhrrohr von mindestens 10 mm Innendurchmesser. Maximieren Sie den Querschnitt des Kugelhalter Luftzufuhreingang und legen reichliche Menge an Schlauch zwischen der Hauptluftzufuhr und dem Kugelhalter. Hinweis: Erhöhte Querschnitt und Länge des erhöhten Luftzufuhrschlauch reduziert die Geräuschentwicklung. </li><li> Legen Sie eine Styropor Kugel (20 cm Durchmesser) in einem speziell entwickelten und 3D-gedruckten Kugelhalter. </li><li> Wenn die Verhaltens Paradigma erfordert nur nach vorne (und hinten) Fortbewegung, beschränken die Bewegung der Kugel auf die horizontale (Pitch)-Achse, indem Sie einen Stift (z. B. eine 19-G-Injektionsnadel) auf der Seite der Kugel. Hinweis: In der Regel passen sich Tiere das Setup viel schneller in dieser reduzierten Dreh Paradigma. </li><li> Spur der Bewegung der Kugel mit einem oder zwei optische Computermäusezur Bewegung um zwei oder alle drei Achsen zu erfassen, die jeweils. Hinweis: Die Computermäuse sollte idealerweise mit einer Infrarot-Diode für wenigstens Störung der Bildgebung zu betreiben. </li></ol></li><li> Virtuelle Realität Umwelt-Setup <ol><li> Bereiten Sie die Umgebung der virtuellen Realität. Hinweis: Eine Probe Umgebung auf Basis von Panda3D, ein frei verfügbares Spiel-Engine wird als Ergänzung zur Verfügung gestellt. Die Objekte der virtuellen Umgebung verwenden Wings3D, eine Open-Source-3D-Modellierer erzeugt. Das Beispielprogramm liest Positionsinformationen über eine Datenerfassungskarte und übersetzt diese in eine Bewegung in der virtuellen Umgebung. Der Code führt auch die nichtlineare Transformation für die Umwelt, auf eine Leinwand projiziert werden Ringkern erforderlich. Der detaillierte Aufbau des Ringbild anderswo 14,17 beschrieben. </li><li> Verwenden Sie LED-Projektoren oder LED-Hintergrundbeleuchtung und Computer-Bildschirme für die Anzeige der virtuellen Umgebung. Integrieren Sie eine Gating-Kreiscuit für schnelle Flackern der LED während der Bildgebung. Hinweis: Ein inhärentes Problem bei der Zwei-Photonen-Bildgebung bei der visuellen Stimulation Lichtleck von der visuellen Stimulationssystem, die durch Abschirmen des Ziels reduziert werden kann stammen. Allerdings kann die Lichtleck von der visuellen Stimulationssystem vollständig durch Synchronisieren der Lichtleistung des Projektors, der den Wendepunkten der Resonanzscanner (wenn Daten nicht erfasst) abgeschafft werden, da mit LED-Arenen für visuelle Stimulation während der Bildgebung verwendet gemacht wird Drosophila-18. Dies führt zu einer effektiven Hochgeschwindigkeitswechsel von visuellen Stimulation und Datenerfassung (siehe Fig. 2). Das Flackern Frequenz (24 kHz) ist um Größenordnungen über der Flimmerverschmelzungsfrequenz Schwellenwert, über dem Flackern nicht mehr durch das Tier wahrgenommen. Der elektronische Schaltbild dieser Modifikation eines handelsüblichen LED-Projektor ist in Fig. 3 gezeigt. </li></ol></li><li> Welpeil Tracking <ol><li> Verwenden Sie einen CMOS-basierte Video-Kamera (30 fps) für Schüler Positionsverfolgung. Stellen Sie sicher, dass die Kamera nicht ein Infrarot-Sperrfilter enthalten. Hinweis: Der Schüler mit hohem Kontrast bei Aufnahmen durch Streulicht von der Zwei-Photonen-Laser-Anregung durch das Auge verlassen sichtbar ist. Schüler-Position und Durchmesser wird in Echtzeit mit Hilfe von individuell programmierte Software basiert auf dem Design von Sakatani und Isa 19 extrahiert. </li></ol></li></ol> 2. Die Injektion von Genetic Calcium-Indikator-und Fenster-Implantat Das Einspritzen eines Calciumindikator 20 und die Implantation des Schädelfenster 21 durchgeführt werden, wie zuvor mit folgenden Zusätzen beschrieben: <ol><li> Injizieren des Virus in der Region von Interesse unter Verwendung eines Glasinjektionspipette mit Virus-Lösung aufgefüllt und auf einen Druck Einspritzsystem verbunden. Stellen Sie den Druck in Abhängigkeit von der Pipette InnenDurchmesser, in der Regel ca. 70-140 mbar bis etwa 100 nl der Viruslösung im Verlauf von 1-2 min injizieren. Geringes Volumen Einspritzimpulse bei niedriger Frequenz (0,05 sec Impulse bei 2 Hz) geliefert werden sollten, um Überlauf des Virus entlang der Pipette während der Injektion zu verhindern. Hinweis: Um die Einspritzmenge zu überwachen, können die Pipette bei kleinen gekennzeichnet werden gleichmäßigem Abstand Längen (zB 0,5 mm) unter einem Stereomikroskop. Verlagerung des Meniskus zwischen den Markierungen kann dann verwendet werden, um das eingespritzte Volumen abzuschätzen. </li><li> Einige Wochen nach der Injektion sollte dies in einem Bolus von dicht markierten Zellen mit einem Durchmesser von etwa 500 &amp;mgr; m führen. Wirksamkeit GECI Expression in der Region von Interesse hängt von der Wahl des GECI und Promotor-sowie infektiösen Titer und Serotyp des rekombinanten AAV verwendet. Hinweis: Als repräsentatives Beispiel Injektion AAV2/1-EF1α-GCaMP5 mit eine Virus titER von 8 x 10 12 GC / ml in primären visuellen Kortex von einer Maus führt zu zufriedenstellenden Ausdruck bei etwa zwei Wochen nach der Injektion (Fig. 1). </li><li> Die Kopfleiste sollte nicht behindern das Sichtfeld der Maus, sollte aber fest genug, um für eine stabile Bildgebung während Verhalten zu ermöglichen. Dies erfordert in der Regel zwei Befestigungspunkten auf beiden Seiten des Kopfleiste (siehe Abbildung 1). Um fest an die Kopfleiste des Schädels, stellen Sie sicher, zu maximieren und trocknen Sie den Bereich des Schädels ausgesetzt, wo der Kopf Leiste angebracht werden. Zusätzlich mit einem Skalpell oder einer Spritze, kratzen die Schädel oberflächliche Rillen, wodurch die Oberfläche vergrößert zum Kleben zu schaffen. Decken Sie die Knochen mit Sekundenkleber Gewebekleber vor dem Anbringen des Kopfbalkens mit Zahnzement. </li></ol> 3. Versuchsdurchführung <ol><li> Zwei bis drei Wochen nach der Virusinjektion, überprüfen Sie die Fenster Schädelimplantat für Klarheit und Expression unter epiFluoreszenzbeleuchtung. Deutlich sichtbar und scharf definierten Grenzen der oberflächlichen Blutgefäße sind ein gutes Indiz dafür, dass das Fenster Implantat geeignet ist für die Bildgebung (siehe Abbildung 1). </li><li> Messen und Einstellen der Laserleistung auf einen Wert unterhalb von 50 mW an der Probe. </li><li> Schalten Sie den Luftstrom zu dem sphärischen Laufband. </li><li> Für Kopf-Fixierung unter dem Mikroskop, kurz betäuben das Tier mit Isofluran, Stress zu reduzieren. Legen Sie das Tier in eine Isofluran-Narkose Behälter und warten, bis die Tierhaltestellen bewegen (ca. 10 sec). Nehmen Sie das Tier sofort und Kopf fixieren unter dem Mikroskop. </li><li> Positionieren der visuellen Anzeigesystem so nahe wie möglich an das Tier noch für den Zugang zu dem Tier zu ermöglichen. Je weniger Sichtkontakt das Tier mit dem Experimentator, der weniger belasteten das Tier während der ersten Phase des Experiments. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Schädelfenster Implantat ist frei von Staub und Schmutz. Mit Wasser reinigenfalls notwendig. </li><li> Bewerben klar Ultraschall-Gel als Immersionsmedium zwischen der Schädelfenster und Wasserimmersionsobjektiv. Dies löst Probleme der langsamen Verschlechterung der Bildqualität durch Wasserverdampfung oder Leckage und verringert die Notwendigkeit, um einen Kegel auf dem Kopf Stangenhalterung, Wasser zu halten. Hinweis: Centrifuge das Gel vor Gebrauch, um alle Luftblasen zu entfernen, und kümmern sich nicht um die Luft zu erstellen Luftblasen während der Anwendung des Gels. Luftblasen können die Bildqualität stark beeinträchtigen. </li><li> Wickeln Sie ein Stück schwarzes Klebeband um den Ziel-und Kopfleiste zur Lichtabschirmung. </li><li> Bewegen Sie den virtuellen Umgebung Arena, um seine endgültige Position und stellen Sie die Videokamera für Schüler-Tracking. </li><li> Stellen Sie den Laser Blanker, um den Scan Amplitude während des Experiments übereinstimmen. </li><li> Starten Sie die Aufnahme-Daten. </li></ol>

<ol><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).</li>
<li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., Chen, T. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li>
<li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Margolis, D. J., Lütcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li>
<li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+Reality+for+Mice%2C+mousevr.blogspot.com%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li>
<li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li>
<li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2%2F3+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li>
<li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Der Schlüssel zum Erfolg des Verhaltens Zwei-Photonen-Bildgebung ist die Stabilität der Zubereitung in zwei Arten: <ol><li> Im Laufe der Tage nach der Implantation Fenster können entzündliche Reaktionen des Gewebes auf die Verbesserung der Bildung von Granulationsgewebe und Knorpel, behindern oder sogar verhindern Bildgebung führen wird. </li><li> Während des Experiments das Gehirn ausreichend stabil, um Bewegungsartefakte zu korrumpieren neuronalen Aktivität verbunden Fluoreszenzsignals zu verhindern. </li></ol><p ...

Zwei-Photonen-Imaging von Calcium-Indikatoren (genetisch wie GCaMP5 7 oder R-GECO 8, oder synthetische Farbstoffe wie OGB oder Fluo4 kodiert) als leistungsfähige Methode zur Messung der neuronalen Aktivität in Mäusen verhält 6.1 entstanden. Sie ermöglicht die gleichzeitige Messung der Aktivität von Hunderten von Zellen mit nahezu einzelnes Aktionspotential Auflösung, bis zu etwa 800 &amp;mgr; m unter der Hirnoberfläche 9,10. Darüber hinaus mit genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren (GeCIS) neuronale Aktivität gemessen werden kann chronisch 5,11,12 und in genetisch definierten Zelltypen 13. Zusammen bieten diese Methoden einen Grad an zeitlicher und räumlicher Auflösung, die sich eröffnen eine Vielzahl neuer Möglichkeiten bei der Untersuchung von neuronalen Berechnung in vivo. Der chirurgische Eingriff ist notwendig, um für die Bildgebung aussetzen und beschriften Sie die Maus Gehirn. Zellen werden typischerweise unter Verwendung eines rekombinanten Adeno-assoziierten vir transfizierten<html> us (AAV)-System für GECI Lieferung und kranial Fenster auf die Injektionsstelle implantiert, um einen optischen Zugang zum Gehirn zu erhalten. Ein Kopfleiste wird dann an den Schädel für Kopf-Fixierung unter der Zwei-Photonen-Mikroskop angebracht. Das Design und die Implementierung dieser Schritte ist kritisch, da die meisten der Probleme, wach Bildgebung ergeben sich Instabilitäten bei der Herstellung. Idealerweise sollte für chronische Abbildung von bis zu mehreren Monaten nach der Operation die hier beschriebene Vorgehensweise zu ermöglichen. Um visuell geführte Verhalten während der Zwei-Photonen-Imaging ermöglichen, sitzt der Kopf fixiert Maus auf einem Luft unterstützt Kugellaufband, die sie verwenden können, um eine virtuelle Realität Umgebung zu navigieren. Locomotion der Maus auf dem Laufband ist, um die Bewegung in der virtuellen Umgebung, die auf einem Ring Bildschirm rund um die Maus 14,15 angezeigt wird, gekoppelt. Verhaltensvariablen, wie Fortbewegung, visuellen Reiz und Pupillenposition aufgezeichnet 6 werden. t &quot;&gt; Wir beschreiben die Verfahren bei chronischen Zwei-Photonen-Imaging bei Mäusen Erforschung einer virtuellen Umgebung beteiligt Die wichtigsten Punkte angesprochen werden:. Reduzierung von Bewegungsartefakten, Reduzierung der Licht Leck, Maximierung der Anzahl der gleichzeitig aufgenommenen Zellen, und die Minimierung der Foto Schäden. Wir bieten auch Informationen über die Einrichtung des luftgestützten Laufband, Schüler-Tracking und die Umgebung der virtuellen Realität. Die hier beschriebenen Verfahren können zur Abbildung fluoreszenzmarkierten Zellpopulationen im Kopf fixiert Mäuse in einer möglicherweise Vielzahl von Verhaltensparadigmen verwendet werden .

<table><tbody><tr><td>Deckgläser (Durchmesser = 3-5 mm)</td><td>Menzel</td><td></td><td>Fensterimplantat</td></tr><tr><td>InSight DeepSee Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>12 kHz Resonanzscanner</td><td>Cambridge Technology</td><td>G1-003-30026</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Galvometer</td><td>Cambridge Technology</td><td>G6215H</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop FPGA</td><td>National Instruments</td><td>PXIe 7965R</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Erfassungskarte</td><td>National Instruments</td><td>PCIe 6363</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Emissionsfilter 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Piezoelektrischer Z-Antrieb</td><td>Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Controller für piezoelektrisches Mikroskop Antrieb</td><td>Physikinstrumente</td><td>E665 LVPZT</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Objektiv 16X, 0.8NA</td><td>Nikon</td><td>CFI75</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Stromverstärker</td><td>Femto</td><td>DHPCA-100</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Photomultiplier Tube</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>USB Kamera ohne IR-Filter</td><td>ImagingSource</td><td>DMK22BUC03</td><td>Pupillenverfolgung</td></tr><tr><td>Objektiv 50 mm</td><td>ImagingSource</td><td>M5018-MP</td><td>Pupillenverfolgung</td></tr><tr><td>Makro-Adapterringe</td><td>ImagingSource</td><td>LAexSet</td><td>Pupillenverfolgung</td></tr><tr><td>Optische Computermaus</td><td>Logitech</td><td>G500</td><td>Bewegungsverfolgung</td></tr><tr><td>Styroporkugel 20 cm</td><td>z.B. idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>virtuelle Umgebung</td></tr><tr><td>LED-Projektor</td><td>Samsung</td><td>SP-F10M</td><td>virtuell environment</td></tr><tr><td>Acquisition card</td><td>National Instruments</td> NI <td>6009</td><td>virtuelle Umgebung</td></tr><tr><td>Panda3D game engine</td><td></td><td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a>virtuelle</td> <td>Umgebung</td></tr><tr><td>Numpy<Bibliothek für Pythona</td><td></td> <td>href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>virtuelle Umgebung</td></tr><tr><td>Scipy Bibliothek für Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>virtuelle Umgebung</td></tr><tr><td>NI-DAQmx-Treiber</td><td>National Instruments</td><td><a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a></td><td>virtuelle Umgebung</td></tr><tr><td>Ultraschallgel</td><td>Dahlhausen</td><td>5701.0342.10</td><td>Bildgebung</td></tr></tbody></table>

zwei-photonen-calcium imaging in mäuse navigieren in einer virtual-reality-umgebung

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In den letzten Jahren hat Zwei-Photonen-Imaging ist ein wertvolles Werkzeug in den Neurowissenschaften, wie es für chronische Messung der Aktivität von genetisch identifizierten Zellen während Verhalten 6.1. Hier beschreiben wir Methoden, um Zwei-Photonen-Imaging in Maus Kortex, während das Tier navigiert ein Virtual-Reality-Umgebung. Wir konzentrieren uns auf die Aspekte der experimentellen Verfahren, die Schlüssel in einem Tier verhalten in einem hell erleuchteten virtuellen Umgebung Bildgebung sind. Die wichtigsten Probleme, die in diesem Versuchsaufbau, dass wir hier sind, entstehen Adresse: Minimierung Gehirn Bewegung bezogenen Artefakte minimiert Lichtaustritt aus der virtuellen Realität Projektionssystem und der Minimierung der laserinduzierten Gewebeschäden. Wir bieten auch Beispiel-Software, um die Virtual-Reality-Umgebung zu steuern und Schüler Tracking zu tun. Mit diesen Verfahren und Mittel sollte es möglich sein, einen herkömmlichen Zwei-Photonen-Mikroskop zur Verwendung in Mäusen verhalten konvertieren.

Die Bildqualität in Zwei-Photonen-Calcium-Imaging von Zellpopulationen mit einer markierten GECI hängt weitgehend von der Qualität der Schädel Fenster Implantats. Zwei Wochen nach der Virusinjektion in die Schädelfenster sollte für Klarheit geprüft werden. Es sollte kein Granulationsgewebe oder Knochen Nachwachsen sichtbar (Abbildung 1A) sein. Darüber hinaus sollte das Muster der oberflächlichen Blutgefäße unverändert bleiben und die Grenzen des Gefäßsystems sollte scharf sein. Zur gleichen Zeit kann GE...

Hier beschreiben wir die in Zwei-Photonen-Bildgebung von Maus Cortex während Verhalten in einer Umgebung der virtuellen Realität beteiligt experimentellen Verfahren.

Zwei-Photonen-Calcium Imaging in Mäuse Navigieren in einer Virtual-Reality-Umgebung

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Schlüsselaspekte der chronischen Zwei-Photonen-Bildgebung bei Mäusen durchzuführen und eine Virtual-Reality-Umgebung zu untersuchen. Dies wird durch die Modifikation eines Zwei-Photonen-Mikroskops für eine schnelle und stabile Bildgebung bei sich verhaltenden Mäusen erreicht. Als nächstes wird ein druckluftgestütztes Laufband aufgebaut, das in der Lage ist, die Fortbewegung zu verfolgen.Dann wird eine Virtual-Reality-Umgebung vorbereitet, in der ein LED-Projektor verwendet wird, der mit dem Mikroskop synchronisiert ist, um den Lichtverlust zu minimieren. Dadurch werden gute und stabile Bildaufnahmen durch die Reduzierung von Bewegungsartefakten, die Reduzierung von Lichtlecks und die Minimierung der Lichtbeschädigungskante erzielt. Obwohl diese Methode zur Messung der Neuroaktivität während der Navigation in einer Virtual-Reality-Umgebung verwendet werden kann, kann sie auch leicht an eine Vielzahl unterschiedlicher Verhaltensparadigmen angepasst werden, die eine visuelle Stimulation erfordern.Alle tierischen Eingriffe wurden nach den Richtlinien des Veterinäramtes des Kantons Basil sta. Das Zwei-Photonen-Mikroskop, das in diesen Experimenten zum Einsatz kommt, besteht aus einem Scankopf, der aus einem Acht- oder 12-Kilohertz-Resonanzscanner und einem Standard-Galvanometer besteht. Dies ermöglicht Bildraten von 40 oder 60 Hertz bei 750 mal 400 Pixeln und reduziert durch Gehirnbewegungen verursachte Bildverzerrungen, Photobleaching und Phototoxizität.Ein piezoelektrischer Hochgeschwindigkeits-Z-Stepper wird verwendet, um sequenziell zeitverschachtelte Bilder in mehreren Tiefen aufzunehmen. Ein mechanischer Blinder wird verwendet, um die Laserbelastung des Gewebes an den Wendepunkten des Scanpfads zu reduzieren, der Blanker muss einstellbar sein, um seine Breite einzustellen. Abhängig von der Amplitude des Resonanzscanners schließen Sie ein Luftzufuhrrohr mit einem Innendurchmesser von mindestens 10 Millimetern an den Kugelhalter des Laufbandes an und platzieren Sie eine BLE-Menge Schlauch zwischen der Hauptluftzufuhr und dem Ballhalter, um die Geräuschentwicklung zu reduzieren.Legen Sie eine Kugel aus Polystyrolschaum mit einem Durchmesser von 20 Zentimetern in einen speziell entwickelten und 3D-gedruckten Kugelhalter. Wenn das Verhaltensparadigma nur eine Vorwärts- und Rückwärtsbewegung erfordert, führen Sie einen Stift wie eine 19-Gauge-Injektionsnadel an der Seite des Balls ein. Um die Bewegung des Balls in der horizontalen Achse einzuschränken, verwenden Sie eine oder zwei optische Computermäuse, um die Bewegung des Balls um zwei bzw. alle drei Achsen zu verfolgen.Um die Virtual-Reality-Umgebung vorzubereiten, verwenden Sie LED-Projektoren oder Computerbildschirme mit LED-Hintergrundbeleuchtung für die Anzeige. Integrieren Sie eine Gating-Schaltung für schnelles Flackern der LEDs während der Bildgebung. Die Flimmerfrequenz von 24 Kilohertz liegt um Größenordnungen über der Flimmerfusionsschwelle, oberhalb derer das Flimmern vom Tier nicht mehr wahrgenommen wird.Stellen Sie die exakte Flimmerfrequenz und das Tastverhältnis ein, um die Lichtleistung des Projektors mit den Wendepunkten des Resonanzscanners für die Pupillenverfolgung zu synchronisieren, und verwenden Sie eine CMO-basierte Videokamera. Stellen Sie sicher, dass die Kamera keinen Infrarot-Sperrfilter enthält. Etwa zwei bis drei Wochen nach der Injektion des genetischen Kalziumindikators und der Implantation eines Schädelfensters verwenden Sie eine Epi-Fluoreszenzbeleuchtung, um das Schädelfensterimplantat auf Klarheit und Ausprägung zu überprüfen.Deutlich sichtbar und scharf definiert. Die Grenzen der oberflächlichen Blutgefäße sind ein guter Hinweis darauf, dass das Fensterimplantat für die Bildgebung ein bis zwei Tage später geeignet ist. Um das Zwei-Photonen-Experiment durchzuführen, messen Sie die Laserleistung und stellen Sie sie an der Probe auf einen Wert unter 50 Milliwatt ein.Schalten Sie dann den Luftstrom zum kugelförmigen Laufband ein. Befestigen Sie das Tier mit dem nächsten Kopf auf dem kugelförmigen Laufband. Die ersten Male ist die Maus kopffixiert.Dieser Prozess kann erleichtert werden, indem das Tier kurzzeitig mit Iso-Fluor sediert wird. Sobald sich das Tier an das Verfahren gewöhnt hat, kann die Montage in der Regel ohne Sedierung durchgeführt werden. Beachten Sie, dass es wichtig ist, den Stress für das Tier während dieses Verfahrens zu minimieren.Positionieren Sie dann das Anzeigesystem so nah wie möglich am Tier, um den Zugang zum Tier zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass das Schädelfensterimplantat frei von Schmutz ist und reinigen Sie es ggf. mit Wasser, tragen Sie klares Ultraschallgel als Tauchmedium zwischen Schädelfenster und Wasserimmersionsobjektiv zur Lichtabschirmung auf. Wickeln Sie ein Stück schwarzes Klebeband um das Objektiv und die Kopfstange.Bewegen Sie die Arena der virtuellen Umgebung in ihre endgültige Position und stellen Sie die Videokamera für die Pupillenverfolgung ein. Stellen Sie abschließend den Laser-Blanker so ein, dass er der während des Experiments verwendeten Scanamplitude entspricht, und beginnen Sie mit der Datenaufzeichnung, wenn die Experimente abgeschlossen sind. Euthanasieren Sie das Tier gemäß den Richtlinien Ihrer Institution.Die Bildqualität in der Zwei-Photonen-Calcium-Bildgebung von Zellpopulationen, die mit einem genetischen Calciumindikator markiert sind, hängt weitgehend von der Qualität des Schädelfensterimplantats ab, wie hier gezeigt: Bei der Überprüfung des Schädelfensters auf Klarheit nach der Virusinjektion sollte kein Granulationsgewebe oder Knochennachwachsen sichtbar sein. Darüber hinaus sollte das Muster der oberflächlichen Blutgefäße unverändert bleiben und die Grenzen des Gefäßsystems scharf definiert werden. Gleichzeitig sollte der BOI der markierten Zellen unter einem Epi-Fluoreszenzmikroskop deutlich sichtbar sein.Im Idealfall ist die Präparation so stabil, dass Verzerrungen der beiden Photonenbilder, die durch die Fortbewegung der Maus induziert werden, im Bild nach der Frameregistrierung nicht sichtbar sind. Lichtlecks aus dem visuellen Stimulationssystem können vollständig beseitigt werden, indem die Lichtleistung des Projektors korrekt auf die Wendepunkte des Resonanzscanners abgestimmt wird. Wenn keine Daten erfasst werden, sollte die Flimmerfrequenz der Lichtquelle doppelt so hoch sein wie die Abtastfrequenz.In diesem Beispiel wurde die Blindblende entfernt, um den Effekt des Lichtlecks zu veranschaulichen, das in den orangefarbenen Kästchen während der visuellen Stimulation gezeigt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie in der Bildgebung eine doppelte Leistung erbringen können: das Verhalten von Mäusen und das Navigieren in einer Virtual-Reality-Umgebung. Neben der Einrichtung der hier beschriebenen Bildgebungs- und Virtual-Reality-Systeme liegt der Schlüssel zum Erfolg bei diesen Experimenten in der Beherrschung der Schädelfensterimplantattechnik.Ein sauberes Implantat ist die Voraussetzung für qualitativ hochwertige Bilder und stabile Aufnahmen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Um zu verstehen, Netzwerk-Dynamik Mikroschaltungen in den Neocortex, ist es wichtig, gleichzeitig aufzeichnen die Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen. In-vivo Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging ist die einzige Methode, dass man, um die Aktivität eines dichten neuronalen Population mit Single-Cell-Auflösung aufzeichnen können.

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse

Quelle: Maruoka, H., et. al. Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei wachen Mäusen. J. vis. exp.,  (2022) Dieses Video zeigt ein Zwei-Photonen-Mikroskopieverfahren zur Abbildung der neuronalen Aktivität und der Mikrogliadynamik bei einer wachen Maus während der visuellen Stimulation, wobei Kalziumtransienten und zelluläre Wechselwirkungen hervorgehoben werden.

Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei einer wachen Maus

Quelle: Lee, H. et. al., Erfolgreiche In vivo Calcium-Bildgebung mit einem miniaturisierten Head-Mount-Mikroskop in der Amygdala einer sich frei verhaltenden Maus. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die In-vivo-Kalziumbildgebung bei einer Maus unter Verwendung einer GRIN-Linse (Gradient Refractive Index) und eines miniaturisierten Mikroskops. Der Aufbau kombiniert die Fixierung des Kopfes in einem reibungslosen mobilen Käfigsystem, stimuliert Neuronen und löst den Einstrom von Kalziumionen...

Mikroendoskopische Calcium-Bildgebung in Echtzeit in einer frei beweglichen Maus

Quelle: Thapa, R., et. al., Stereotaktische Virusinjektion und Gradient-Index-Linsenimplantation für das tiefe Gehirn In vivo Calcium-Bildgebung.  J. Vis. Exp. (2021)Das Video demonstriert die Echtzeit-Kalziumbildgebung mit einem Miniskop in einer transduzierten Maus, die die neuronale Aktivität mit dem Verhalten korreliert.

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Wir präsentieren ein Protokoll, um das Hirnstamm der erwachsenen Maus von der ventralen Seite zu entlarven. Durch die Verwendung einer Gradienten-Refraktiven Indexlinse mit einem Miniaturmikroskop kann die Kalzium-Bildgebung verwendet werden, um die Aktivität von minderwertigen oliv-neuralen Somata nin vivo zu untersuchen.

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Miniscope in vivo Calcium-Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung neuronaler Dynamik und Mikroschaltkreise in sich frei verhaltenden Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von Gehirnoperationen, um eine gute In-vivo-Kalziumbildgebung mit einem Miniskop zu erreichen.

Stereotaktische virale Injektion und Gradientenindex-Linsenimplantation für Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das die Adeno-assoziierte Virusinjektion mit der Implantation eines Schädelfensters kombiniert, um die Dynamik der Mikroglia und die neuronale Aktivität in wachen Mäusen simultan abzubilden.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung eines großen (6 x 3 mm2) Schädelfensters mit Lebensmittelverpackung, transparentem Silikon und Deckglas. Dieses Schädelfenster ermöglicht in vivo Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebungsexperimente in derselben Maus.

Im lebenden Organismus Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung einer Maus mit einem großen Schädelfenster

Hier stellen wir ein vereinfachtes Open-Source-Hardware- und Software-Setup zur Untersuchung des räumlichen Lernens von Mäusen mit Hilfe von Virtual Reality (VR) vor. Dieses System zeigt einer kopfgebundenen Maus, die auf einem Rad läuft, eine virtuelle lineare Spur an, indem es ein Netzwerk von Mikrocontrollern und einen Einplatinencomputer verwendet, auf dem ein einfach zu bedienendes grafisches Python-Softwarepaket ausgeführt wird.

Ein Open-Source-Virtual-Reality-System zur Messung des räumlichen Lernens bei kopfgebundenen Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Bildgebung von Kalziumantworten im Colliculus superior (SC) von wachen Mäusen, einschließlich der Abbildung der Aktivität einzelner Neuronen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, während der Kortex bei Wildtyp-Mäusen intakt bleibt, und der Abbildung des gesamten SC mit Weitfeldmikroskopie bei Mäusen mit Teilkortex-Mutante.

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

In Kombination mit einer Kopfplatte und einem optischen Design, das sowohl mit Einzel- als auch mit Zwei-Photonen-Mikroskopen kompatibel ist, bietet die Mikroprismenlinse einen erheblichen Vorteil bei der Messung neuronaler Reaktionen in einer vertikalen Säule unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich gut kontrollierter Experimente in kopffesten Zuständen oder natürlicher Verhaltensaufgaben bei frei beweglichen Tieren.

Langzeitbildgebung identifizierter neuronaler Populationen mit Mikroprismen bei frei beweglichen und kopffixierten Tieren

Lernen Sie Zwei-Photonen-Calcium-Imaging bei Mäusen in Virtual-Reality-Umgebungen. Diese Methode minimiert Bewegungsartefakte und Lichtleckage für stabile neuronale Aufnahmen während der Navigation.

Zwei-Photonen-Calcium Imaging in Mäuse Navigieren in einer Virtual-Reality-Umgebung

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