Gleichzeitige Elektrophysiologische Aufzeichnung und Micro-Injektionen von Hemmstoffe im Gehirn von Nagetieren

Hier stellen wir eine Glaspipette mit doppelter Funktion her: Hemmung tiefer Hirnstrukturen durch Mikroinjektionen von Medikamenten und Echtzeitüberwachung ihrer Wirkung durch gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnungen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine erschwingliche Injektionsstraße zu konstruieren, um Neurotransmitter in den Colliculus superior der Ratte zu injizieren und gleichzeitig die neuronale Aktivität mehrerer Einheiten zu überwachen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Glaspipette mit einer Glaskapillare und einem vertikalen Mikropipettenabzieher hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, einen Silberdraht in die Kapillare einzuführen, wobei ein Drahtabschnitt aus dem nicht konischen Ende herausragt.

Als nächstes wird Kleber verwendet, um eine dichte Abdichtung zwischen der Glaspipette und einer Injektionsnadel herzustellen. Die letzten Schritte bestehen darin, die Pipette mit einer himmelblauen GABA-Lösung zu füllen, die an einer mit Mineralöl gefüllten Mikrospritze befestigt und an einem Mikroinjektor befestigt ist. Letztendlich kann diese Konstruktion einer Injektion mit zugänglichen und erschwinglichen Teilen verwendet werden, um tiefe Gehirnstrukturen zu inaktivieren, während die neuronale Aktivität des inaktivierten Bereichs vor, während und nach der Injektion eines Medikaments aufgezeichnet wird.

Es gibt einige Vorteile dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie z. B. gasbasierten Druckimpulsen und photischen Injektionssystemen. Eine davon ist, dass es sich um eine kosteneffiziente Methode handelt, die eine funktionsbasierte Kontrolle über die Verabreichung des Arzneimittels ermöglicht, wodurch die Gewebeschäden, die durch eine übermäßige Injektion verursacht werden, begrenzt werden. Ein weiterer Vorteil, den dieses System bietet, ist eine kombinierte Aufzeichnungsfähigkeit, die eine effiziente Kontrolle über die zeitliche Komponente der neuronalen Deaktivierung ermöglicht.

Um die Aufnahme-Injektionspipetten vorzubereiten, ziehen Sie zunächst eine sieben Zentimeter große Kapillare mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter für ein COP-Vertikalmodell. Seven 20 oder eine ähnliche Einheit. Stellen Sie die Heizung auf 18 und den Magneten auf eins nebeneinander, brechen Sie mit Handschuhen die Spitze manuell auf, um eine Öffnung zu schaffen, und überprüfen Sie unter einem Mikroskop, ob der Innendurchmesser zwischen 30 und 40 Mikrometern liegt.

Messen Sie dies mit dem Sucherlineal. Er wird eine relativ niedrige Impedanz von 0,3 bis 0,6 Megaohm erzeugen. Führen Sie dann vom nicht verjüngten Ende einen etwa sieben Zentimeter langen Silberdraht in die Pipette ein und lassen Sie ein bis zwei Zentimeter aus der Pipette heraushängen.

Biegen Sie diesen überschüssigen Draht orthogonal zur Kapillare. Nehmen Sie als Nächstes eine 30-Gauge-Injektionsnadel und tragen Sie flexiblen Kunststoffkleber auf den Schaft auf. Führen Sie dann die Nadel langsam in die Pipette ein.

So weit wie möglich. Fügen Sie mehr Klebstoff hinzu, um eine Abdichtung an der Verbindungsstelle zwischen Pipette und Nadel zu schaffen. Lassen Sie die Baugruppe mit der Pipettenspitze nach oben ca. 12 Stunden trocknen.

Nachdem Sie die Ratte betäubt und in einen stereotaktischen Rahmen gesetzt haben, tragen Sie eine Augensalbe auf und rasieren Sie den Kopf sauber. Nach dem Auftragen eines Lokalanästhetikums und der Bestätigung einer chirurgischen Anästhesieebene fahren Sie mit dem Einschnitt der Kopfhaut entlang des Medians mit einer Skalpellklinge Nummer 10 fort. Dadurch werden die koronalen und sagittalen Nähte freigelegt.

Identifizieren Sie dann mit einem chirurgischen Spatel die anatomischen Referenzen von Lambda und bgma. Passen Sie die Position des Kopfes so an, dass diese Orientierungspunkte in derselben horizontalen Ebene liegen. Dann Null, ein feiner starrer Zeiger wie ein Glasrohr auf dem bgma.

Passen Sie als Nächstes die Position des Rohrs anhand von Koordinaten aus dem bgma an eine interessante Stelle an. Zeichnen Sie mit dem Edding ein Quadrat um den Zielbereich für die Kraniotomie. Entfernen Sie nun mit dem chirurgisch sterilisierten Bohrer langsam den Knochen entlang der Markierungen.

Beginnen Sie mit so wenig Druck wie möglich und halten Sie den Bohrer in Bewegung, um eine durch Reibung verursachte Gewebeschäden durch den Kopf zu vermeiden, wenn der Knochen dünn geworden ist, entfernen Sie vorsichtig den quadratischen Abschnitt mit einer Pinzette. Der Dora MA muss nicht entfernt werden, da die Injektion ihn in Zukunft durchdringen wird. Halten Sie die freiliegende Hirnrinde mit zerebraler Rückenmarksflüssigkeit gespült.

Bereiten Sie die Injektion vor, indem Sie zuerst eine Spritze von fünf bis 10 Mikrolitern mit Mineralöl füllen. Bereiten Sie als nächstes das gewünschte Medikament mit einem Farbstoff in physiologischer Kochsalzlösung vor. Hier werden 0,5% Chicagoer Himmelblau mit 300 mikromolaren Gaba gemischt.

Füllen Sie nun die Injektionspipette, indem Sie zuerst eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer vorbereiteten Lösung befüllen und dann die Pipette mit der Spritze befüllen. Halten Sie beim Entfernen der Spritze leichten Druck auf den Kolben, damit ein Vakuum die Lösung nicht von der Injektionsstraße entfernt. Prüfen Sie, ob Flüssigkeit an möglichen Leckstellen austritt.

Tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit ab und prüfen Sie erneut auf Undichtigkeiten. Befestigen Sie nun die Mikrospritze mit Mineralöl an der Einspritzstraße. Wischen Sie dann überschüssige Lösung ab.

Mit Gaze. Überprüfen Sie die Injektionsspitze. Es sollte möglich sein, kleine Tropfen Lösung durchfließen zu lassen, sonst ist es verstopft oder der Injektor wird nun sicher an ein Mikropumpensystem angeschlossen.

Verschieben Sie dann die Position der Injektionsstraße auf die Zielkoordinaten und senken Sie die Elektrode auf die obere Kolus, die durch die Aufzeichnung visuell evozierter Potentiale identifiziert werden kann. Während die Elektrode abgesenkt ist, üben Sie einen kleinen Überdruck aus, indem Sie eine niedrige Injektionsrate anwenden, um ein Verstopfen zu vermeiden. Unterbrechen Sie die Injektion, wenn die Struktur erreicht ist.

Decken Sie nach dem Einführen der Injektion die freiliegende Rinde mit warmem Agar ab, um ein Austrocknen zu verhindern. Warten Sie nach dem endgültigen Platzieren der Elektrode 30 Minuten, um die Stabilisierung des die Elektrode umgebenden Gewebes zu ermöglichen. Injizieren Sie dann 400 bis 800 Nanoliter Lösung mit einer Geschwindigkeit von 40 Nanolitern pro Minute, bis eine Aktivierung der neuronalen Aktivität im oberen Colus erreicht ist, die Elektrode sollte eine Verringerung der Spikes während der Injektion der hemmenden Lösung zeigen.

Visuell evozierte Potentiale wurden im Colus superior erzielt. Nach einem 300 Millisekunden langen Blitz des kontralateralen Auges nach der Injektion von Gaba wurde die Spike-Aktivität als Reaktion auf einen Blitzreiz für 45 bis 60 Minuten unterdrückt. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, während des Ladens auf Undichtigkeiten zu prüfen und sicherzustellen, dass die Arzneimittellösung frei durch die Injektionsspitze fließt.