Name: Die gleichzeitige Zwei-Photonen In Vivo Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Craniotomie und Zwei-Photonen-Mikroskopie für chronisches In-vivo-Imaging von Neuronen im retrosplenialen Cortex der Maus. Diese Methode ermöglicht die Langzeitbeobachtung von struktureller Plastizität.

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Die Autoren möchten M. Steczkowski für Sprachaufnahmen, M. Borczyk für Zeichnungen, A. Trąbczyńska für die Virusproduktion, M. Ziókowska für die Genotypisierung und A. Mirgos für die Unterstützung bei Dreharbeiten zu danken. KR erkennt die Art Geschenk des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) fluoreszierendes Protein mCherry unter der Kontrolle von CaMK Promotor von K. Deisseroth Ausdruck zu bringen. dem Europäischen Regionalentwicklungsfonds innerhalb - Dieses Projekt wurde in den Kernanlagen des Labors für Tiermodelle und Labor für Tissue Struktur und Funktion, Zentrum für Neurobiologie, Nencki Institut für Experimentelle Biologie, mit dem Einsatz von CePT Infrastruktur von der Europäischen Union finanziert werden durchgeführt das operationelle Programm &quot;Innovative Wirtschaft&quot; für den Zeitraum 2007-2013. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der National Science Centre unterstützt: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 zu KR und Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 bis RC

Alle nachfolgend beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von lokalen Ethikkommission am Nencki Institut für Experimentelle Biologie, Polnische Akademie der Wissenschaften genehmigt. Hinweis: Einige der Szenen in dem zugehörigen Video beschleunigt werden. Drehzahlfaktor wird in diesen Szenen angezeigt. 1. Eine Operation Vorbereitung <ol><li> Sterilisieren alle Werkzeuge, Glasbehälter für Flüssigkeiten und Wattestäbchen im Autoklaven. Verwenden entbehrlich Handschuhe. Reinigen Sie den OP-Tisch, die Stereotaxierahmen und die ganze Umgebung mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine sterile OP-Pad einen sterilen Raum für alle sterilisierten Ausrüstung zu schaffen. Schneiden Sie Gelfoam in kleine Stücke und genießen sie in steriler Kochsalzlösung. Hinweis: Nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, Ethanol ist weder ein Sterilisierungsmittel noch ein High-Level-Desinfektionsmittel. Es sollte nur als Reinigungs- / Entfettungsmittel auf zuvor sterilisierten Oberflächen verwendet werden. </li><li> Legen Sie das Tier in the Induktionskammer und stellen Sie die Isofluran-Ebene auf 5% und Sauerstoffstrom auf 2 l / min. Dieses Verfahren sollte ca. 3 Minuten dauern. </li><li> Nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer. Verwenden Schwanz oder Zehen kneift, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig sediert. </li><li> Mit Hilfe eines präzisen Trimmer das Haar von der Rückseite des Kopfes (zwischen den Ohren) bis zu den Augen rasieren. </li><li> Legen Sie das Tier in der Stereotaxierahmen und stabilisieren den Kopf mit Ohr-Bars. </li><li> Set Anästhesie Ebenen 1,5-2% Isofluran und 0,3 l / min Sauerstoff. </li><li> Tragen Sie die Augensalbe. </li><li> Injizieren das Tier subkutan mit Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) und Baytril (5 mg / kg) Entzündung, Schmerz und Infektion zu verhindern, respectively. </li><li> Spritzen Sie das Tier intramuskulär mit Dexamethason (0,2 mg / kg) Schwellung des Gehirns zu verhindern. Hinweis: Es ist möglich , Dexamethason subkutan zu injizieren oder intraperitoneal Muskelschäden zu verhindern. </li><li> Reinigen Sie die Haut mit sterile Wattestäbchen mit Betadine um 70% Ethanol. </li><li> Ändern Sie die Handschuhe und sprühen sie mit 70% Ethanol. Hinweis: Während der Einmalhandschuhe verwenden nicht das sterile Feld berühren. Berühren Sie das Tier nur mit den Spitzen der sterilen chirurgischen Instrumenten und sterilen Tupfer. </li></ol> 2. Cranial Fenster Chirurgie <ol><li> Heben Sie die Haut mit einer Pinzette und mit Mikro Schere, um die Haut horizontal entlang der Basis des Kopfes einzuschneiden und dann schräg nach vorne Punkt zwischen den Augen. Entfernen Sie die Hautlappen. </li><li> Bewerben Lidocain Salbe mit einem sterilen Tupfer auf die Knochenhaut übermäßigen Blutungen und Schmerzen zu verhindern. </li><li> Verwenden Sie sterile Wattestäbchen oder einem Skalpell das Periost zu entfernen. Trocknen Sie den Schädel mit einem sterilen Tupfer. </li><li> Mit Anwendung einer sterilen Nadel dicht Sekundenkleber auf die Hautränder sie zu immobilisieren und aus dem Kontakt mit Zahnzement zu verhindern. Warten Sie auf den Leim trocknen. </li><li> Legen Sie eine sterile 3 mm Deckglas über ter Schädel nach vorn auf die Lambdanaht. Zentrieren Sie das Deckglas an RSC-Koordinaten: AP, Bregma -2,8; ML, Bregma 0. Markieren Sie die Deck Kanten durch die Schädeloberfläche mit einer sterilen Nadel zu kratzen. Legen Sie das Deckglas wieder in den sterilen Behälter mit 70% Ethanol. </li><li> Verwenden Sie ein High-Speed-Dentalbohrer mit kleinem Durchmesser Grat mit einem 3 mm Durchmesser-Kreis zu skizzieren. Reinigen Sie die Bohrstelle aus dem Knochenstaub mit steriler Kochsalzlösung getaucht Tupfer. Verwenden Sie die Gelfoam und Tupfer die gelegentliche Blutungen zu stoppen und den Knochen zu reinigen. </li><li> Dazwischen Bohrungen überprüfen Sie die Knochendicke mit einer feinen Pinzette vorsichtig den Knochen Kreis berühren und seine Beweglichkeit zu prüfen. Denken Sie daran, dass der Knochen auf der Naht der Bereich dicker ist. Stoppen Sie die Bohrung, wenn der Knochen Kreis ist mobil und nur eine gleichmäßige, wird dünne Schicht von Knochen auf dem Umfang links. Reinigen Sie das Operationsfeld aller verbleibenden Knochenstaub mit Kochsalzlösung getaucht Tupfer. </li><li> Löschen Sie die sterile Kochsalzlösung auf der Bohrstelle, für den gebohrten circle. den Knochen Kreis mit einer feinen Pinzette vorsichtig hebeln und dann vorsichtig, aber fest den Knochen entfernen, indem Sie ihn nach oben zu heben. Achten Sie darauf, nicht die Knochen Kreis zu neigen, während sie heben eine mögliche Beschädigung der Dura zu verhindern. </li><li> gelten vorsichtig die Gelfoam in steriler Kochsalzlösung auf die Dura getränkt, um die Blutung zu stoppen. Warten Sie, bis alle Blutung vollständig gestoppt wird. Entfernen Sie vorsichtig den Gelfoam nicht den Gerinnungsprozess zu stören. Hinweis: Die Nahtbereich gefäß ist, so dass die an dieser Stelle Blutungen könnte sich tiefgründig zu sein. Es ist wichtig, für die genügend Zeit zu warten, bis die Blutung vollständig zu stoppen. Es ist hilfreich, die Kochsalzlösung getränkten Gelfoam, indem sie auf Eis gestellt gekühlt zu halten. </li></ol> 3. Virus Injection <ol><li> Bringen Sie die Infusionspumpe mit dem stereotaktischen Turm und den Controller angeschlossen werden. </li><li> Legen Sie die 35G Nadel in die Spritze. Spülen Sie die Spritze 10-mal mit Ethanol um sie zu sterilisieren und 10 mal mit steriler Kochsalzlösung zu entfernen Spuren von ethanol. Entfernen Sie Luftblasen aus der Spritze. Legen Sie die Spritze in die Pumpe. Hinweis: Stellen Sie sich andere Desinfektionsmittel verwenden. </li><li> Tauen Sie eine Einzeldosis von rAAV2 / 1 mCherry Vorbereitung (10 12 pfu wird empfohlen) und halten Sie sie auf Eis. Füllen Sie die Spritze mit der Virus-Lösung. </li><li> Zentrieren Sie die Nadel auf dem Bregma und dann sanft in den Hippocampus fügen Sie die folgenden Koordinaten: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Diese Koordinaten werden in der Nähe der Kante der Kraniotomie befinden. Warten Sie 5 Minuten für das Gewebe zu stabilisieren. </li><li> Injizieren 0,7 ul der rAAV2 / 1 mCherry Lösung mit einer Geschwindigkeit von 50 nl / min. Warten Sie 10 min für das Virus vollständig zu adsorbieren. Sie vorsichtig die Nadel entfernen. Blot mit Gelfoam wenn die Blutung auftritt. Wiederholen Sie mit dem kontralateralen Seite. </li></ol> 4. Cranial Fenster Implantierung <ol><li> Legen Sie das sterile, getrocknete Deckglas auf der Oberseite der Dura in dem gebohrten Kreis Rahmen. Halten Sie das Deckglas mit dem forceps die Dura zu sanft flach und bringen Abdeckglas &#39;Kanten an die Schädeloberfläche näher. Hinweis: Es ist möglich , dass das Deckglas das Gerinnsel stört und die Blutung wird fortgesetzt. Wenn das der Fall ist, heben Sie den Deckglas, legen Sie sie in Alkohol, trocken und Rückkehr 2.9 zu treten. </li><li> eine sterile Nadel gelten die dichte Sekundenkleber auf den Abdeckglas Kanten Mit ihnen auf den Schädel zu befestigen. Warten Sie auf den Leim trocknen. </li><li> Legen Sie eine Befestigungsstange (M2 Mutter oder eine Sonderanfertigung) im vorderen Teil des Schädels. Tragen Sie die Sekundenkleber über die Ränder des Balkens. Warten Sie auf den Leim trocknen. <ol><li> Legen Sie die Befestigungsleiste in einer Position, die horizontale Positionierung des Schädelfenster während der Bildgebungssitzung ermöglicht. Stellen Sie sie so weit entfernt wie möglich aus dem Fenster. Wenn es um das Fenster zu schließen platziert wird, die Bar und die Schraube mit dem maßgeschneiderten Halter verbinden könnte als ein Hindernis für das Ziel während des Abbildungsprozesses darstellen. </li></ol></li><li&gt; Bereiten Sie die Dentalacryl und wenden es auf der Schädeloberfläche um das Glas. Es ist hilfreich, um das Fenster eine kraterartige Form zu bilden. Es wird einen Hohlraum zum Wasser schaffen später für die Bildgebung mit dem Wasser Ziel angewandt. </li><li> Erstellen Sie eine Kappe mit dem Dentalacryl, für den Rest des operativen Bereich Hautränder, Fixierung Bar, den Krater um die Schädelfenster verstärken. Warten, bis der Zahnzement zu härten. </li><li> Nehmen Sie das Tier aus dem Stereotaxierahmen und steckte es in die Auffangkammer. </li><li> Warten, bis das Tier von der Operation erholen, während die physiologischen Funktionen zu beobachten. </li><li> Anwenden postoperative Analgesie (Carprofen, 10 mg / kg) und Antibiotika-Behandlung (Baytril, 5 mg / kg) für 48 Stunden. </li></ol> 5. Imaging <ol><li> Starten Sie den Ti: Saphir-Laser, Macht das Mikroskop auf. Das System in diesem Experiment verwendet wird mit einem Zwei-Photonen-Laser, OPO System und Dual GaAsP PMT ausgestattet. </li><li> Legen Sie das Tier in der INDUCtion Kammer und Anästhesie zu induzieren. </li><li> Nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer und in der Gasnarkosemaske unter dem Mikroskop. Verringern Sie den Sauerstofffluss auf 0,3 l / min und die Isofluran-Konzentration auf 1,5 bis 2%. </li><li> Befestigen Sie das Tier auf dem benutzerdefinierten Mikroskop Rahmen mit einem M2 Schraube (oder einem anderen benutzerdefinierten System). Richten Sie die Schädelfenster. Hinweis: Es ist möglich , die Mikroskophersteller Kopf Fixationssystem zu verwenden, obwohl die spezifische benutzerdefinierte Rahmen zu besseren Ergebnissen führt (verbesserte Kopfstabilität, konstante Positionierung in mehreren Sitzungen während einer chronischen Experiment). </li><li> Mit Hilfe der Weitfeld-Mikroskop-Einstellungen und eine geringe Vergrößerung Ziel Zentrum der Blick auf eine der Seiten von retrosplenialen Kortex und fokussieren es auf der Deckfläche. </li><li> Tragen Sie einen Tropfen Wasser in die kraterartigen Acryl gut. Wechseln Sie zu einem Wasserimmersionsobjektiv lange Strecke. Bewegen Sie das Ziel in Richtung Schädelfenster, bis der Wassermeniskus conConnects der Probe und Ziel. </li><li> Wechseln Sie in den Zwei-Photonen-Einstellungen und beginnen Scannen der Probe von oben nach unten niedrigsten Zoom verwendet wird. Die Überquerung der Dura mater wird als Blendung von hohen unspezifischen Signal sichtbar sein. </li><li> Passen Sie die Mikroskop Erwerb Einstellungen in beiden Kanälen (GFP und mCherry) entsprechend der Signalstärke von fluoreszierenden Zellen, um den gesamten Dynamikbereich abzudecken. </li><li> ein geeignetes Neuron (mit dendritischen Baum von anderen Zellen getrennt) führen einen ersten Scan nur mit der GFP filterset mit dem niedrigsten Zoom und z-Abstand von 5 Mikrometer Nach dem Auffinden. </li><li> Besorgen Sie sich einen maximalen Vorsprung des gescannten Stapel und drucken Sie es für Anmerkungen (invertierten Farben verwenden). </li><li> Stellen Sie Zoom auf einen Wert, der die gewünschten morphologischen Details Bild ermöglicht. Bild der gesamten dendritischen Baum in den GFP und mCherry Kanäle mit maximaler Projektion als Führer. </li></ol>

<ol><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
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<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
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<li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren (KL, MR, KR) haben Rechte für Patent angemeldet (PL410001) für in diesem Artikel verwendete Halterahmen.

In der aktuellen Papier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Zwei-Photonen - in - vivo - Bildgebung der synaptischen Eingänge und postsynaptischen Ziele im RSC durch ein Schädel-Fenster. Das Implantationsverfahren bestehen aus mehreren Schlüsselschritte. Zunächst wird das Tier tief anästhesiert und in dem stereotaktischen Rahmen befestigt, dann wird der Schädel über RSC wird entlang der markierten Kreislinien mit einem Bohrer ausgedünnt und die kreisförmige Knochen entfernt wird. Nachde...

Zwei-Photonen-Mikroskopie revolutioniert die Beobachtung der Gehirnaktivität in lebenden und lebenden Tier. Seit seiner Einführung im Jahr 1990 es schnell Popularität gewonnen und ist nun als eines der interessantesten und innovative Ansätze zur Untersuchung zahlreicher Aspekte der Hirnaktivität in vivo 1,2 umgesetzt. Diese Anwendungen umfassen Blutströmungsmessungen, neuronale Aktivierung (beispielsweise unter Verwendung von Calciumfüllstandsanzeiger oder immediate early Gene expression) und die Morphologie von neuronalen Zellen. Eine zunehmende Anzahl von Laboratorien Zweiphotonen - Mikroskope, die Technik in der gesamten wissenschaftlichen Welt als neuer Standard für die Umsetzung in vivo Bildgebung des Gehirns. Der Standardansatz beinhaltet die Implantation des Schädelfenster (ein rundes Loch in den Schädel mit einem Deckglas bedeckt) über den Lauf oder visuellen Kortex des Gehirns von Mäusen 3. Als nächstes wird in Abhängigkeit von der Versuchsprotokoll, das mouse durchläuft eine Reihe von Visualisierung und Verhaltenstrainingseinheiten, so dass die Veränderungen in der Hirnaktivität und die neuronale Morphologie über 4,5 Zeit zu überwachen. In beiden Fällen wirkt sich die Kraniotomie nur den Scheitelbein, ohne die Nähte kreuzen. Es wird weitgehend angenommen, dass der Hauptnachteil der Technik leicht zugänglich Cortex wie der Lauf oder Sehrinde seine begrenzte Anwendung. Implantieren des kranialen Fenster über anderen Regionen stellt eine Menge Schwierigkeiten, aufgrund einer übermäßigen Blutungen und / oder räumliche Hinderung. In dieser Arbeit schlagen wir vor der Implantation des kranialen Fenster über dem retrosplenialen cortex (RSC) als weitere mögliche interessierende Region für die Zwei-Photonen - Mikroskopie in vivo 6. RSC ist ein wichtiges Element des Gehirns Schaltung verantwortlich für die räumliche Gedächtnisbildung. Anatomisch ist RSC ein Teil eines neuronalen Netzes verbindet cortical, hippocampalen und thalamischen Regionen 7. Es istin einer Reihe von Verhaltensweisen, wie räumliches Lernen und Extinktion sowie räumliche Navigation 6 stark beteiligt. Um die morphologischen Veränderungen der Neuronen zu visualisieren verwenden wir eine transgene Mauslinie, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der THY1 Promotor. Bei diesen Mäusen GFP wird in etwa 10% der Neuronen im Gehirn ermöglicht eine klare Visualisierung der kortikalen Axonen und Dendriten mit Zwei-Photonen - Mikroskopie 8 ausgedrückt. Eine weitere Neuerung , die wir vorschlagen , ist die Injektion eines rekombinanten adeno-assoziierten Virus - Serotyp 2/1 (rAAV2 / 1) Codieren eines rot fluoreszierendes Protein (mCherry) unter einer neuron-spezifischen Promotor CaMKII 9 in die tieferen Strukturen des Gehirns RSC Projizieren wie dem Hippocampus. Die Expression von rAAV2 / 1 mCherry im Hippocampus von Thy1-GFP - Maus ermöglicht die gleichzeitige Darstellung von prä- und postsynaptischen Elemente der Hippocampo-cortical Synapsen 10. Die rAAV-gesteuerte Expression von mCherry erfordert zwei bis drei Wochen für das Protein ausreichendes Niveau in den axonalen Terminals zu erreichen. Diese Frist ist mit der üblichen Zeitaufwand für die Wiederherstellung von Craniotomie konsistent.

<table><tbody><tr><td>Drug</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% präoperativ</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1,5-2% während der Operation</td></tr><tr><td>Dexametason</td><td>Scan Vet</td><td>Dexason 2mg/ml</td><td>0,2 mg/kg intramuskulär</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2,50</td>%<td>5 mg/kg subkutan</td></tr><tr><td>Tolfedin</td><td>, Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg subkutan,</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td>, <td>2 mg/kg subkutan,</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>KRKA-Polska,</td><td>Rycarfa 50mg/ml,</td><td>10 mg/kg subkutan,</td></tr><tr><td>Lidocain</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>topisch</td></tr><tr><td>Lidocain</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan Dental; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>topisch</td></tr><tr><td>CA Kleber</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Dental Acryl</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Harvard Gerät</td><td>HSE-64-0720</td> Dentalbohrer <td>mit 3 mm Durchmesser</td></tr><tr><td></td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Fixierstange</td><td>Sonderanfertigungen</td><td>N/A M2</td><td>oder M3 Schraubenmuttern könnten verwendet werden</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>ImagingHolder-Rahmen</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sonderanfertigung</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zwei-Photonen-Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Lasereinheit: Coherent Chameleon 690-1040nm mit optischem parametrischem Oszillator 1050-1300nm. Objektive: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 und LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detektion: Zeiss Bandpassfilter BP 500-550 (GFP) und BP 570-610 (mCherry) getrennt durch Strahlteiler bei 560nm und gekoppelt an zwei GaAsP Photodetektoren.</td></tr><tr><td>Reagenz</td>Virus-Geschenk von K. Deisseroth Rekombinantes Adeno-assoziiertes Virus (rAAV), das das fluoreszierende Protein mCherry unter der Kontrolle des CaMK-Promotors <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>exprimiert</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die gleichzeitige zwei-photonen<em&gt; in vivo</em&gt; imaging der synaptischen eingänge und postsynaptische targets in der maus retrosplenialen cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex (RSC) der Maus unter Verwendung von in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Mauslinie Thy1-GFP ermöglicht. Dieser Ansatz schafft die Möglichkeit, den Zusammenhang von Verhaltensmanipulationen mit Veränderungen in der neuronalen Morphologie in vivo zu untersuchen.
Das Verfahren zur Implantation von Schädelfenstern wurde als nur auf die leicht zugänglichen Kortexregionen wie das Fassfeld beschränkt. Unser Ansatz ermöglicht die Visualisierung von Neuronen im stark vaskularisierten RSC. RSC ist ein wichtiges Element des Gehirnschaltkreises, das für das räumliche Gedächtnis verantwortlich ist und bisher als problematisch für die in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung galt.
Die Schädelfensterimplantation über dem RSC wird mit einer Injektion des mCherry-exprimierenden rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAVmCherry) in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Die exprimierte mCherry breitet sich auf axonale Projektionen vom Hippocampus bis zum RSC aus und ermöglicht so die Visualisierung von Veränderungen sowohl in präsynaptischen axonalen Boutons als auch in postsynaptischen dendritischen Dornen im Kortex. 
Diese Technik ermöglicht die Langzeitüberwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die Expression von GFP in einer Untergruppe von Neuronen im Thy1-GFP reporter Maus in vivo Abbildung der kortikalen Dendriten und lokale axonale Projektionen in RSC ermöglicht. 1A zeigt maximale Projektion eines Stapels von Bildern mit mehreren GFP-positive Dendriten erkennbar. Der Zellkörper wird durch eine Arterie verdeckt. 1B zeigt eine einzige Ebene vergrößerte Bild (Digitalzoom 3x) der dendritischen Verzweigung in 1A angegeben. Details von ...

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Alle unten beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von dem Lokalen Ethikkomitee am Nencki-Institut für Experimentelle Biologie, Polnische Akademie der Wissenschaften, genehmigt. Dieses Video zeigt ein Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie in der Thy1-GFP-Transgenen-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit einer Injektion eines mCherry-exprimierenden adeno-assoziierten Virus (AAV) in den dorsalen Hippocampus kombiniert.Zusammen ermöglichen diese Techniken die Langzeitüberwachung von erlernter Abhängigkeit und struktureller Plastizität im retrosplenialen Kortex. In dieser Arbeit schlagen wir die Implantation einer Schädelkanüle über dem retrosplenialen Kortex als Region von Interesse für die Zweiphotonen-In-vivo-Mikroskopie vor. Um morphologische Veränderungen in neuronalen Strukturen sichtbar zu machen, verwenden wir Thy1-GFP-Mäuse, bei denen etwa 10 Prozent der Neuronen im Gehirn das fluoreszierende GFP-Protein exprimieren.Eine weitere Innovation, die wir vorschlagen, ist die Injektion eines AAV, der unter einem neuronenspezifischen Promotor ein fluoreszierendes Protein, mCherry, exprimiert, in tiefere Strukturen des Gehirns, wie beispielsweise das Hippocampus, um Projektionen dieser Struktur in den retrosplenialen Kortex sichtbar zu machen. Sterilisieren Sie alle Instrumente, Glasbehälter für Flüssigkeiten und Wattestäbchen im Autoklaven. Sie verbrauchsübliche Handschuhe.Reinigen Sie den Operationstisch, den stereotaktischen Halter und den gesamten umgebenden Bereich mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie ein steriles chirurgisches Tuch, um einen sterilen Bereich für alle sterilisierten Geräte zu schaffen. Schneiden Sie Gelatineschwamm in kleine Stücke und tränken Sie diese in steriler Kochsalzlösung.Stellen Sie das Tier in die Betäubungskammer und stellen Sie die Isofluran-Konzentration auf 5 % und den Sauerstoffdurchfluss auf zwei Liter pro Minute ein. Dieser Vorgang sollte etwa drei Minuten dauern. Nehmen Sie das Tier aus der Betäubungskammer heraus.Verwenden Sie Schwanz- oder Zehenquetschungen, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig sediert ist. Rasieren Sie mit präzisen Schneidern das Haar vom Hinterkopf zwischen den Ohren bis zu den Augen. Platzieren Sie das Tier im stereotaktischen Rahmen und stabilisieren Sie den Kopf mit Ohrstangen.Stellen Sie die Anästhesiestufe auf 1,5 bis 2 % Isofluran und 0,3 Liter pro Minute Sauerstoff ein. Tragen Sie die Augensalbe auf. Injizieren Sie dem Tier subkutan Tolfedin, vier Milligramm pro Kilogramm, Butomidor, zwei Milligramm pro Kilogramm, und Baytril, fünf Milligramm pro Kilogramm, um Entzündungen, Schmerzen und Infektionen zu verhindern.Spritzen Sie das Tier intramuskulär mit Dexamethason, null Komma zwei Milligramm pro Kilogramm, um Gehirnschwellung zu verhindern. Reinigen Sie die Haut mit sterilen Wattestäbchen, die mit Betadine und anschließendem 70 %igen Ethanol behandelt wurden. Wechseln Sie die Handschuhe und besprühen Sie sie mit 70 %igem Ethanol.Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an und schneiden Sie mit einer Mikroschere entlang der Kopfbasis horizontal und dann schräg bis zur vorderen Stelle zwischen den Augen die Haut ein. Entfernen Sie die Hautlamelle. Tragen Sie mit einem sterilen Tupfer Lidocain-Salbe auf das Periost auf, um übermäßige Blutung und Schmerzen zu verhindern.Entfernen Sie das Periost mit sterilen Wattestäbchen oder einem Skalpell. Trocknen Sie den Schädel mit sterilen Tupfern ab. Tragen Sie mit einer sterilen Nadel dichten Cyanoacrylat-Kleber an den Hauträndern auf, um diese zu fixieren und einen erneuten Kontakt mit Zahnzement zu verhindern.Warten Sie, bis der Kleber getrocknet ist. Legen Sie ein steriles Deckglas mit drei Millimeter Durchmesser anterior zur Lambdasnaht auf den Schädel. Zentrieren Sie das Deckglas an retrosplenialen Koordinaten, anterior-posterior Bregma minus 2,8, mediolateral Bregma null.Markieren Sie die Ränder des Deckglases, indem Sie die Schädeloberfläche mit einer sterilen Nadel ritzen. Legen Sie das Deckglas zurück in den sterilen Behälter mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeits-Zahnbürstbohrer mit einem Bohrer kleinem Durchmesser, um einen Kreis mit einem Durchmesser von drei Millimetern vorzumarkieren.Reinigen Sie die Bohrstelle mit sterilen, mit Kochsalzlösung getränkten Tupfern von Knochenspänen. Verwenden Sie Gelatineschwamm und Tupfer, um gelegentliche Blutungen zu stillen und den Knochen zu reinigen. Überprüfen Sie zwischen den Bohrungen mit feinen Pinzetten die Knochendicke, indem Sie vorsichtig den Knochenkreis berühren und dessen Beweglichkeit prüfen.Beachten Sie, dass der Knochen im Bereich der Nähte dicker ist. Stoppen Sie das Bohren, wenn der Knochenkreis beweglich ist und nur noch eine gleichmäßige, dünne Knochenschicht am Umfang verbleibt. Reinigen Sie das Operationsfeld mit auf Salzlösung getränkten Tupfern von allem verbleibenden Knochenschmutz.Den sterilen Salzl&ouml;sungstropfen auf die Bohrfl&auml;che fallen lassen, sodass der gebohrte Kreis bedeckt ist. Den Knochenkreis vorsichtig mit einer feinen Pinzette anhebeln und anschlie&szlig;end behutsam, aber fest, durch Anheben nach oben entfernen. Dabei darauf achten, den Knochenkreis beim Anheben nicht zu verdrehen, um m&ouml;gliche Sch&auml;den an der Dura zu vermeiden.Tragen Sie den in steriler Kochsalzlösung getränkten Gel-Schaum vorsichtig auf die Dura auf, um die Blutung zu stillen. Warten Sie, bis die Blutung vollständig gestoppt ist. Entfernen Sie den Gel-Schaum vorsichtig, um den Gerinnungsprozess nicht zu stören.Beachten Sie, dass das Nahtgebiet stark durchblutet ist, sodass die Blutung an dieser Stelle erheblich sein könnte. Es ist unerlässlich, ausreichend Zeit zu warten, bis die Blutung vollständig gestoppt ist. Befestigen Sie die Infusionspumpe am stereotaktischen Gestell und schließen Sie den Controller an.Setzen Sie die Nadel mit 35 Gauge in die Füllspritze ein. Spülen Sie die Spritze 10-mal mit Ethanol zur Sterilisation und anschließend 10-mal mit steriler Kochsalzlösung, um Rückstände von Ethanol zu entfernen. Entfernen Sie Luftblasen aus der Spritze.Spritze in die Pumpe einführen. Eine Einzeldosis der AV-Präparation auffüllen und auf Eis halten. Die Spritze mit Virenlösung füllen.Zentrieren Sie die Nadel auf der Bregma und bringen Sie sie dann vorsichtig unter Verwendung der folgenden Koordinaten in den Hippocampus ein: anterior, posterior minus zwei, medial lateral plus minus eins, dorsal ventral minus eins. Diese Koordinaten liegen nahe der Grenze des Schädelbereichs. Warten Sie fünf Minuten, damit sich das Gewebe stabilisieren kann.Injizieren Sie 0,7 µL AV-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 50 Nanolitern pro Minute. Warten Sie 10 Minuten, damit sich das Virus vollständig entfalten kann. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig.Bei Blutungen mit Gel-Schaum abtupfen. Wiederholen Sie den Vorgang auf der kontralateralen Seite. Legen Sie die sterile, trockene Deckglaskappe auf die Dura in den gebohrten Kreisrahmen.Halten Sie das Deckglas mit der Pinzette, um die Dura mater vorsichtig zu glätten und die Ränder des Deckglases näher an die Schädeloberfläche heranzuführen. Tragen Sie mit einer sterilen Nadel den dichten Cyanacrylat-Kleber auf die Ränder des Deckglases auf, um sie am Schädel zu befestigen. Warten Sie, bis der Kleber getrocknet ist.Bringen Sie eine Fixierstange, eine Anton-Mutter oder eine individuell angefertigte Konstruktion im vorderen Schädelbereich an. Beachten Sie, dass die Fixierstange so positioniert werden sollte, dass eine horizontale Ausrichtung des Schädel-Fensters während der Bildgebungssitzung ermöglicht wird. Tragen Sie den Klebstoff entlang der Kanten der Stange auf.Warten Sie, bis der Kleber trocken ist. Beachten Sie, dass die Fixierleiste so weit wie möglich vom Fenster entfernt platziert werden sollte. Befindet sie sich zu nahe am Fenster, können die Leiste und die Schraube, die sie mit dem speziell angefertigten Halter verbindet, während des Bildgebungsprozesses ein Hindernis für das Objektiv darstellen.Bereiten Sie die Zahnacrylmasse vor und tragen Sie sie auf der Schädelfläche um das Glas herum auf. Es ist hilfreich, eine kraterähnliche Form um das Fenster herum zu bilden. Dadurch entsteht ein Hohlraum für das später zum Abbilden mit der Wasserimmersionsoptik verwendete Wasser.Erstellen Sie eine Kappe aus Zahnacryl, die den Rest der operativen Fläche abdeckt, die Hautränder fixiert und den Krater um das Schädel Fenster verstärkt. Warten Sie, bis der Zement vollständig ausgehärtet ist. Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie es in die Erholungskammer.Warten Sie, bis sich das Tier von der Operation erholt hat, während Sie die physiologischen Funktionen beobachten. Verabreichen Sie postoperativ das Anästhetikum Cyroproferrin (10 Milligramm pro Kilogramm) und eine antibiotische Behandlung mit Baytril (5 Milligramm pro Kilogramm) über einen Zeitraum von 48 Stunden. Schalten Sie den Ti-Saphir-Laser ein und starten Sie das Mikroskop.Das in diesem Experiment verwendete System ist mit einem Zweiphotonenlaser, einem OPO-System und einem dualen Galliumarsenid-Photomultiplier ausgestattet. Legen Sie das Tier in die Narkosekammer und leiten Sie die Anästhesie ein. Nehmen Sie das Tier aus der Narkosekammer und platzieren Sie es unter dem Mikroskop in die Gasanästhesiemaske.Verringern Sie den Sauerstofffluss auf 0,3 Liter pro Minute und die Isofluran-Konzentration auf 1,52 %. Befestigen Sie das Tier am individuellen Mikroskop-Frame mit einer MT-Schraube oder einem anderen maßgeschneiderten System. Richten Sie das Schädel-Fenster horizontal aus. Beachten Sie, dass es möglich ist, das Kopf-Fixierungssystem des Mikroskop-Herstellers zu verwenden; der spezifische individuelle Frame liefert jedoch bessere Ergebnisse, eine verbesserte Kopf-Stabilität und eine konstante Positionierung über mehrere Sitzungen hinweg bei chronischen Experimenten.Unter Verwendung der Einstellungen des Weitfeldmikroskops und eines Objektivs mit niedriger Vergrößerung wird das Bild auf eine Seite des retrosplenialen Kortex zentriert und auf die Oberfläche der Deckglasplatte fokussiert. Ein Tropfen Wasser wird in die kraterförmige Acrylvertiefung gegeben. Anschließend wird auf ein Wassereintauchobjektiv mit großer Arbeitsdistanz umgeschaltet.Bewegen Sie das Objektiv in Richtung des kraniellen Fensters, bis der Wasser-Meniskus das Präparat und das Objektiv verbindet. Wechseln Sie zu den Zwei-Photonen-Einstellungen und beginnen Sie, das Präparat von oben nach unten mit der niedrigsten Vergrößerung zu scannen. Das Durchqueren der Dura mater wird als Blendung durch ein starkes unspezifisches Signal sichtbar.Passen Sie die Mikroskop-Aufnahmeeinstellungen in beiden Kanälen, GFP und mCherry, entsprechend der Signalstärke fluoreszierender Zellen an, um den gesamten dynamischen Bereich abzudecken. Nachdem Sie ein geeignetes Neuron mit einem von anderen Zellen getrennten dendritischen Baum gefunden haben, führen Sie einen ersten Scan nur mit GFP-Filtern durch, wobei die niedrigste Vergrößerung und ein Z-Abstand von fünf Mikrometern eingestellt sind. Erstellen Sie eine maximale Projektion des Scan-Stacks und drucken Sie diese mit invertierten Farben für Annotationen aus.Stellen Sie den Zoombereich auf einen Wert ein, der es ermöglicht, die gewünschten morphologischen Details abzubilden. Bilden Sie den gesamten dendritischen Baum im GFP- und mCherry-Kanal unter Verwendung einer maximalen Projektion als Orientierungshilfe ab. Mit diesem Protokoll ist es möglich, sowohl prä- als auch postsynaptische Strukturen im retrosplenialen Kortex wiederholt zu überwachen.Dieser Ansatz könnte in einem chronischen Experiment angewendet werden, bei dem Verhaltensmanipulationen erwartet werden, die mit Veränderungen der Morphologie von Dendriten, synaptischen Dornen oder präsynaptischen Neuronen korrelieren. Die Bildgebungssitzungen können mit beliebiger Frequenz durchgeführt werden, jedoch wird ein Zeitabstand von 24 Stunden bevorzugt, um eine ordnungsgemäße Erholung des Tieres zu ermöglichen und die Auswirkungen der Anästhesie zu minimieren. Bei sachgemäßer Anwendung ermöglicht diese Technik die Durchführung mehrerer Bildgebungssitzungen über einen Zeitraum von mehreren Monaten hinweg.

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Forschung

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Neurowissenschaften

Quelle: Wang, Z., et al. Transpupilläre Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus.  J. Vis. Exp. (2021). Dieses Video zeigt eine Technik für die in vivo Netzhautbildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Anästhesierte Mäuse werden auf die Bildgebung vorbereitet, indem sie ihren Kopf sichern, Augenschmiermittel auftragen und ein Deckglas über das Auge legen. Retinale Ganglienzellen (RGCs), die fluoreszierende Proteine exprimieren, werden zunächst mittels Epifluoreszenz zur...

Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Quelle: Maruoka, H., et. al. Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei wachen Mäusen. J. vis. exp.,  (2022) Dieses Video zeigt ein Zwei-Photonen-Mikroskopieverfahren zur Abbildung der neuronalen Aktivität und der Mikrogliadynamik bei einer wachen Maus während der visuellen Stimulation, wobei Kalziumtransienten und zelluläre Wechselwirkungen hervorgehoben werden.

Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei einer wachen Maus

Quelle: Kamei, R., et. al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)Das Video zeigt den Aufbau und den Bildgebungsprozess für die in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie der Mikrogliadynamik im hippokampalen CA1 (Cornu ammonis 1) und im Gyrus dentatus, um eine optimale optische Ausrichtung und Beurteilung der strukturellen Integrität zu gewährleisten.

In vivo Zwei-Photonen-Bildgebung der Mikrogliadynamik im Hippocampus der Maus

Es wird ein Verfahren zur Markierung von Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoffen in vorbestimmten funktionellen Mikrodomänen des Neokortex beschrieben. Zuerst wird intrinsische Signal Abbildungsoptik verwendet werden, um eine funktionelle Karte zu erhalten. Dann Zweiphotonenmikroskopie wird Etiketts und Bild Neuronen innerhalb eines Mikro-Domäne von der Karte verwendet.

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in Nervenzellen sind essentiell für die Fähigkeit des Gehirns, in Reaktion auf Verhaltensstörungen Herausforderungen anzupassen.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

Zeitraffer-Bildgebung am lebenden Tier liefert wertvolle Informationen über die strukturelle Reorganisation im intakten Gehirn. Hier stellen wir ein verdünntes Schädelpräparat vor, das die transkranielle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Strukturen in der lebenden Mausrinde mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Wir beschreiben ein experimentelles Verfahren zur Messung der neuronalen Aktivität durch dual optische Fenster über bilaterale primären somatosensorischen Corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene Mäuse mit 2-Photonen (2P) Mikroskopie in Vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

Diese Methode beschreibt eine chronische Zubereitung, die den optischen Zugang zum Hippocampus lebender Mäuse ermöglicht. Dieses Präparat kann verwendet werden, um längsinale optische Bildgebung der neuronalen strukturellen Plastizität und aktivitätsbeschworenen zellulären Plastizität über einen Zeitraum von mehreren Wochen durchzuführen.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

In-vivo-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Biologie in Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt die transpupille Bildgebung der Netzhaut der Maus mit einem Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop. Es zeigt auch verschiedene In-vivoimaging-Methoden, um mehrere zelluläre Kohorten der Netzhaut fluoreszierend zu markieren.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das die Adeno-assoziierte Virusinjektion mit der Implantation eines Schädelfensters kombiniert, um die Dynamik der Mikroglia und die neuronale Aktivität in wachen Mäusen simultan abzubilden.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Erfahren Sie die Craniotomie und Zwei-Photonen-Mikroskopie für chronisches In-vivo-Imaging von Neuronen im retrosplenialen Cortex der Maus. Diese Methode ermöglicht die Langzeitbeobachtung von struktureller Plastizität.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen In Vivo Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex (Video) | JoVE Journal

Die gleichzeitige Zwei-Photonen

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