Die gleichzeitige Zwei-Photonen

Alle unten beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von dem Lokalen Ethikkomitee am Nencki-Institut für Experimentelle Biologie, Polnische Akademie der Wissenschaften, genehmigt. Dieses Video zeigt ein Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie in der Thy1-GFP-Transgenen-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit einer Injektion eines mCherry-exprimierenden adeno-assoziierten Virus (AAV) in den dorsalen Hippocampus kombiniert.

Zusammen ermöglichen diese Techniken die Langzeitüberwachung von erlernter Abhängigkeit und struktureller Plastizität im retrosplenialen Kortex. In dieser Arbeit schlagen wir die Implantation einer Schädelkanüle über dem retrosplenialen Kortex als Region von Interesse für die Zweiphotonen-In-vivo-Mikroskopie vor. Um morphologische Veränderungen in neuronalen Strukturen sichtbar zu machen, verwenden wir Thy1-GFP-Mäuse, bei denen etwa 10 Prozent der Neuronen im Gehirn das fluoreszierende GFP-Protein exprimieren.

Eine weitere Innovation, die wir vorschlagen, ist die Injektion eines AAV, der unter einem neuronenspezifischen Promotor ein fluoreszierendes Protein, mCherry, exprimiert, in tiefere Strukturen des Gehirns, wie beispielsweise das Hippocampus, um Projektionen dieser Struktur in den retrosplenialen Kortex sichtbar zu machen. Sterilisieren Sie alle Instrumente, Glasbehälter für Flüssigkeiten und Wattestäbchen im Autoklaven. Sie verbrauchsübliche Handschuhe.

Reinigen Sie den Operationstisch, den stereotaktischen Halter und den gesamten umgebenden Bereich mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie ein steriles chirurgisches Tuch, um einen sterilen Bereich für alle sterilisierten Geräte zu schaffen. Schneiden Sie Gelatineschwamm in kleine Stücke und tränken Sie diese in steriler Kochsalzlösung.

Stellen Sie das Tier in die Betäubungskammer und stellen Sie die Isofluran-Konzentration auf 5 % und den Sauerstoffdurchfluss auf zwei Liter pro Minute ein. Dieser Vorgang sollte etwa drei Minuten dauern. Nehmen Sie das Tier aus der Betäubungskammer heraus.

Verwenden Sie Schwanz- oder Zehenquetschungen, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig sediert ist. Rasieren Sie mit präzisen Schneidern das Haar vom Hinterkopf zwischen den Ohren bis zu den Augen. Platzieren Sie das Tier im stereotaktischen Rahmen und stabilisieren Sie den Kopf mit Ohrstangen.

Stellen Sie die Anästhesiestufe auf 1,5 bis 2 % Isofluran und 0,3 Liter pro Minute Sauerstoff ein. Tragen Sie die Augensalbe auf. Injizieren Sie dem Tier subkutan Tolfedin, vier Milligramm pro Kilogramm, Butomidor, zwei Milligramm pro Kilogramm, und Baytril, fünf Milligramm pro Kilogramm, um Entzündungen, Schmerzen und Infektionen zu verhindern.

Spritzen Sie das Tier intramuskulär mit Dexamethason, null Komma zwei Milligramm pro Kilogramm, um Gehirnschwellung zu verhindern. Reinigen Sie die Haut mit sterilen Wattestäbchen, die mit Betadine und anschließendem 70 %igen Ethanol behandelt wurden. Wechseln Sie die Handschuhe und besprühen Sie sie mit 70 %igem Ethanol.

Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an und schneiden Sie mit einer Mikroschere entlang der Kopfbasis horizontal und dann schräg bis zur vorderen Stelle zwischen den Augen die Haut ein. Entfernen Sie die Hautlamelle. Tragen Sie mit einem sterilen Tupfer Lidocain-Salbe auf das Periost auf, um übermäßige Blutung und Schmerzen zu verhindern.

Entfernen Sie das Periost mit sterilen Wattestäbchen oder einem Skalpell. Trocknen Sie den Schädel mit sterilen Tupfern ab. Tragen Sie mit einer sterilen Nadel dichten Cyanoacrylat-Kleber an den Hauträndern auf, um diese zu fixieren und einen erneuten Kontakt mit Zahnzement zu verhindern.

Warten Sie, bis der Kleber getrocknet ist. Legen Sie ein steriles Deckglas mit drei Millimeter Durchmesser anterior zur Lambdasnaht auf den Schädel. Zentrieren Sie das Deckglas an retrosplenialen Koordinaten, anterior-posterior Bregma minus 2,8, mediolateral Bregma null.

Markieren Sie die Ränder des Deckglases, indem Sie die Schädeloberfläche mit einer sterilen Nadel ritzen. Legen Sie das Deckglas zurück in den sterilen Behälter mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeits-Zahnbürstbohrer mit einem Bohrer kleinem Durchmesser, um einen Kreis mit einem Durchmesser von drei Millimetern vorzumarkieren.

Reinigen Sie die Bohrstelle mit sterilen, mit Kochsalzlösung getränkten Tupfern von Knochenspänen. Verwenden Sie Gelatineschwamm und Tupfer, um gelegentliche Blutungen zu stillen und den Knochen zu reinigen. Überprüfen Sie zwischen den Bohrungen mit feinen Pinzetten die Knochendicke, indem Sie vorsichtig den Knochenkreis berühren und dessen Beweglichkeit prüfen.

Beachten Sie, dass der Knochen im Bereich der Nähte dicker ist. Stoppen Sie das Bohren, wenn der Knochenkreis beweglich ist und nur noch eine gleichmäßige, dünne Knochenschicht am Umfang verbleibt. Reinigen Sie das Operationsfeld mit auf Salzlösung getränkten Tupfern von allem verbleibenden Knochenschmutz.

Den sterilen Salzlösungstropfen auf die Bohrfläche fallen lassen, sodass der gebohrte Kreis bedeckt ist. Den Knochenkreis vorsichtig mit einer feinen Pinzette anhebeln und anschließend behutsam, aber fest, durch Anheben nach oben entfernen. Dabei darauf achten, den Knochenkreis beim Anheben nicht zu verdrehen, um mögliche Schäden an der Dura zu vermeiden.

Tragen Sie den in steriler Kochsalzlösung getränkten Gel-Schaum vorsichtig auf die Dura auf, um die Blutung zu stillen. Warten Sie, bis die Blutung vollständig gestoppt ist. Entfernen Sie den Gel-Schaum vorsichtig, um den Gerinnungsprozess nicht zu stören.

Beachten Sie, dass das Nahtgebiet stark durchblutet ist, sodass die Blutung an dieser Stelle erheblich sein könnte. Es ist unerlässlich, ausreichend Zeit zu warten, bis die Blutung vollständig gestoppt ist. Befestigen Sie die Infusionspumpe am stereotaktischen Gestell und schließen Sie den Controller an.

Setzen Sie die Nadel mit 35 Gauge in die Füllspritze ein. Spülen Sie die Spritze 10-mal mit Ethanol zur Sterilisation und anschließend 10-mal mit steriler Kochsalzlösung, um Rückstände von Ethanol zu entfernen. Entfernen Sie Luftblasen aus der Spritze.

Spritze in die Pumpe einführen. Eine Einzeldosis der AV-Präparation auffüllen und auf Eis halten. Die Spritze mit Virenlösung füllen.

Zentrieren Sie die Nadel auf der Bregma und bringen Sie sie dann vorsichtig unter Verwendung der folgenden Koordinaten in den Hippocampus ein: anterior, posterior minus zwei, medial lateral plus minus eins, dorsal ventral minus eins. Diese Koordinaten liegen nahe der Grenze des Schädelbereichs. Warten Sie fünf Minuten, damit sich das Gewebe stabilisieren kann.

Injizieren Sie 0,7 µL AV-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 50 Nanolitern pro Minute. Warten Sie 10 Minuten, damit sich das Virus vollständig entfalten kann. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig.

Bei Blutungen mit Gel-Schaum abtupfen. Wiederholen Sie den Vorgang auf der kontralateralen Seite. Legen Sie die sterile, trockene Deckglaskappe auf die Dura in den gebohrten Kreisrahmen.

Halten Sie das Deckglas mit der Pinzette, um die Dura mater vorsichtig zu glätten und die Ränder des Deckglases näher an die Schädeloberfläche heranzuführen. Tragen Sie mit einer sterilen Nadel den dichten Cyanacrylat-Kleber auf die Ränder des Deckglases auf, um sie am Schädel zu befestigen. Warten Sie, bis der Kleber getrocknet ist.

Bringen Sie eine Fixierstange, eine Anton-Mutter oder eine individuell angefertigte Konstruktion im vorderen Schädelbereich an. Beachten Sie, dass die Fixierstange so positioniert werden sollte, dass eine horizontale Ausrichtung des Schädel-Fensters während der Bildgebungssitzung ermöglicht wird. Tragen Sie den Klebstoff entlang der Kanten der Stange auf.

Warten Sie, bis der Kleber trocken ist. Beachten Sie, dass die Fixierleiste so weit wie möglich vom Fenster entfernt platziert werden sollte. Befindet sie sich zu nahe am Fenster, können die Leiste und die Schraube, die sie mit dem speziell angefertigten Halter verbindet, während des Bildgebungsprozesses ein Hindernis für das Objektiv darstellen.

Bereiten Sie die Zahnacrylmasse vor und tragen Sie sie auf der Schädelfläche um das Glas herum auf. Es ist hilfreich, eine kraterähnliche Form um das Fenster herum zu bilden. Dadurch entsteht ein Hohlraum für das später zum Abbilden mit der Wasserimmersionsoptik verwendete Wasser.

Erstellen Sie eine Kappe aus Zahnacryl, die den Rest der operativen Fläche abdeckt, die Hautränder fixiert und den Krater um das Schädel Fenster verstärkt. Warten Sie, bis der Zement vollständig ausgehärtet ist. Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie es in die Erholungskammer.

Warten Sie, bis sich das Tier von der Operation erholt hat, während Sie die physiologischen Funktionen beobachten. Verabreichen Sie postoperativ das Anästhetikum Cyroproferrin (10 Milligramm pro Kilogramm) und eine antibiotische Behandlung mit Baytril (5 Milligramm pro Kilogramm) über einen Zeitraum von 48 Stunden. Schalten Sie den Ti-Saphir-Laser ein und starten Sie das Mikroskop.

Das in diesem Experiment verwendete System ist mit einem Zweiphotonenlaser, einem OPO-System und einem dualen Galliumarsenid-Photomultiplier ausgestattet. Legen Sie das Tier in die Narkosekammer und leiten Sie die Anästhesie ein. Nehmen Sie das Tier aus der Narkosekammer und platzieren Sie es unter dem Mikroskop in die Gasanästhesiemaske.

Verringern Sie den Sauerstofffluss auf 0,3 Liter pro Minute und die Isofluran-Konzentration auf 1,52 %. Befestigen Sie das Tier am individuellen Mikroskop-Frame mit einer MT-Schraube oder einem anderen maßgeschneiderten System. Richten Sie das Schädel-Fenster horizontal aus. Beachten Sie, dass es möglich ist, das Kopf-Fixierungssystem des Mikroskop-Herstellers zu verwenden; der spezifische individuelle Frame liefert jedoch bessere Ergebnisse, eine verbesserte Kopf-Stabilität und eine konstante Positionierung über mehrere Sitzungen hinweg bei chronischen Experimenten.

Unter Verwendung der Einstellungen des Weitfeldmikroskops und eines Objektivs mit niedriger Vergrößerung wird das Bild auf eine Seite des retrosplenialen Kortex zentriert und auf die Oberfläche der Deckglasplatte fokussiert. Ein Tropfen Wasser wird in die kraterförmige Acrylvertiefung gegeben. Anschließend wird auf ein Wassereintauchobjektiv mit großer Arbeitsdistanz umgeschaltet.

Bewegen Sie das Objektiv in Richtung des kraniellen Fensters, bis der Wasser-Meniskus das Präparat und das Objektiv verbindet. Wechseln Sie zu den Zwei-Photonen-Einstellungen und beginnen Sie, das Präparat von oben nach unten mit der niedrigsten Vergrößerung zu scannen. Das Durchqueren der Dura mater wird als Blendung durch ein starkes unspezifisches Signal sichtbar.

Passen Sie die Mikroskop-Aufnahmeeinstellungen in beiden Kanälen, GFP und mCherry, entsprechend der Signalstärke fluoreszierender Zellen an, um den gesamten dynamischen Bereich abzudecken. Nachdem Sie ein geeignetes Neuron mit einem von anderen Zellen getrennten dendritischen Baum gefunden haben, führen Sie einen ersten Scan nur mit GFP-Filtern durch, wobei die niedrigste Vergrößerung und ein Z-Abstand von fünf Mikrometern eingestellt sind. Erstellen Sie eine maximale Projektion des Scan-Stacks und drucken Sie diese mit invertierten Farben für Annotationen aus.

Stellen Sie den Zoombereich auf einen Wert ein, der es ermöglicht, die gewünschten morphologischen Details abzubilden. Bilden Sie den gesamten dendritischen Baum im GFP- und mCherry-Kanal unter Verwendung einer maximalen Projektion als Orientierungshilfe ab. Mit diesem Protokoll ist es möglich, sowohl prä- als auch postsynaptische Strukturen im retrosplenialen Kortex wiederholt zu überwachen.

Dieser Ansatz könnte in einem chronischen Experiment angewendet werden, bei dem Verhaltensmanipulationen erwartet werden, die mit Veränderungen der Morphologie von Dendriten, synaptischen Dornen oder präsynaptischen Neuronen korrelieren. Die Bildgebungssitzungen können mit beliebiger Frequenz durchgeführt werden, jedoch wird ein Zeitabstand von 24 Stunden bevorzugt, um eine ordnungsgemäße Erholung des Tieres zu ermöglichen und die Auswirkungen der Anästhesie zu minimieren. Bei sachgemäßer Anwendung ermöglicht diese Technik die Durchführung mehrerer Bildgebungssitzungen über einen Zeitraum von mehreren Monaten hinweg.