Die gleichzeitige Zwei-Photonen In Vivo Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Alle unten beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Lokalen Ethikkommission des Nenscki-Instituts für experimentelle Biologie der Polnischen Akademie der Wissenschaften genehmigt. Dieses Video zeigt ein Kraniotomieverfahren, das eine chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in dieser transgenen Linie von einem G der Füße ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion des mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Virus, AAV, in den dorsalen Hippocampus kombiniert.

In Kombination ermöglichen diese Techniken eine langfristige Überwachung der erlebten Abhängigkeit und strukturellen Plastizität im retrosplenialen Kortex. In dieser Arbeit schlagen wir vor, dass die Implantation des Schädelfensters oberhalb des retrosplenialen Kortex kein möglicher Bereich von Interesse für die Zwei-Photonen-in-vivo-Mikroskopie ist. Um die morphologischen Veränderungen in den neuronalen Strukturen sichtbar zu machen, verwenden wir dieses eine G von B-Mäusen mit der Expression des fluoreszierenden GFP-Proteins in etwa 10 Prozent der Neuronen im Gehirn.

Eine weitere Innovation, die wir vorschlagen, ist die Injektion eines AAV, der Expression eines fluoreszierenden Proteins mCherry unter einem neuronenspezifischen Promotor in die tieferen Strukturen im Gehirn, wie z.B. den Hippocampus, um Projektionen der Struktur in den retrosplenialen Kortex zu visualisieren. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge, Glasbehälter für Flüssigkeiten und Wattestäbchen im Autoklaven. Sie entbehrliche Handschuhe.

Reinigen Sie den Operationstisch, den stereotaktischen Rahmen und die gesamte Umgebung mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine sterile chirurgische Unterlage, um einen sterilen Raum für alle sterilisierten Geräte zu schaffen. Schneiden Sie den Gelschaum in kleine Stücke und weichen Sie sie in steriler Kochsalzlösung ein.

Setzen Sie das Tier in die Induktionskammer und stellen Sie den Isoflurangehalt auf 5% und den Sauerstofffluss auf zwei Liter pro Minute ein. Dieser Vorgang sollte etwa drei Minuten dauern. Nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer.

Verwenden Sie Schwanz- oder Zehenkneifungen, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig sediert ist. Rasieren Sie die Haare mit präzisen Trimmern vom Hinterkopf zwischen den Ohren bis zu den Augen. Platzieren Sie das Tier in den stereotaktischen Rahmen und stabilisieren Sie den Kopf mit Ohrstangen.

Stellen Sie die Anästhesiewerte auf 1,5 bis 2 % Isofluran und null Komma drei Liter Sauerstoff pro Minute ein. Tragen Sie die Augensalbe auf. Injizieren Sie dem Tier subkutan Tolfedin, vier Milligramm pro Kilogramm, Butomidor, zwei Milligramm pro Kilogramm, und Baytril, fünf Milligramm pro Kilogramm, um Entzündungen, Schmerzen bzw. Infektionen zu verhindern.

Injizieren Sie dem Tier intramuskulär Dexamethason, null Komma zwei Milligramm pro Kilogramm, um eine Schwellung des Gehirns zu verhindern. Reinigen Sie die Haut mit sterilen Wattestäbchen mit Betadin, gefolgt von 70% Ethanol. Wechseln Sie die Handschuhe und sprühen Sie sie mit 70% Ethanol ein.

Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an und schneiden Sie sie mit einer Mikroschere horizontal entlang der Basis des Kopfes und dann schräg zum vorderen Punkt zwischen den Augen. Entfernen Sie den Hautlappen. Tragen Sie Lidocain-Salbe mit einem sterilen Tupfer auf das Periost auf, um übermäßige Blutungen und Schmerzen zu vermeiden.

Verwenden Sie sterile Wattestäbchen oder ein Skalpell, um das Periost zu entfernen. Trocknen Sie den Schädel mit sterilen Tupfern ab. Tragen Sie mit einer sterilen Nadel dichten Cyanacrylatkleber auf die Hautränder auf, um sie zu immobilisieren und einen weiteren Kontakt mit Zahnzement zu verhindern.

Warten Sie, bis der Kleber getrocknet ist. Legen Sie ein steriles, drei Millimeter dickes Deckglas über den Schädel vor der Lambdoid-Naht. Zentrieren Sie das Deckglas an den retrosplenialen Koordinaten, anterior, hinteres Bregma minus zwei Komma acht, mediales laterales Bregma Null.

Markieren Sie die Kanten des Deckglases, indem Sie die Schädeloberfläche mit einer sterilen Nadel zerkratzen. Setzen Sie das Deckglas wieder in den sterilen Behälter mit 70% Ethanol ein. Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeits-Dentalbohrer mit kleinem Durchmesser, um einen Kreis mit einem Durchmesser von drei Millimetern zu konturieren.

Reinigen Sie die Bohrstelle mit sterilen Tupfern mit Kochsalzlösung vom Knochenstaub. Verwenden Sie den Gelschaum und die Tupfer, um gelegentliche Blutungen zu stoppen und den Knochen zu reinigen. Kontrollieren Sie zwischen den Bohrungen die Knochendicke mit einer feinen Pinzette, indem Sie den Knochenkreis sanft berühren und seine Beweglichkeit überprüfen.

Denken Sie daran, dass der Knochen im Nahtbereich dicker ist. Stoppen Sie das Bohren, wenn der Knochenkreis beweglich ist und nur eine gleichmäßig dünne Knochenschicht am Umfang übrig bleibt. Reinigen Sie das Einsatzfeld von sämtlichem restlichem Knochenstaub mit Tupfern mit Kochsalzlösung.

Lassen Sie die sterile Kochsalzlösung auf den Bohrbereich fallen und decken Sie den gebohrten Kreis ab. Hebeln Sie den Knochenkreis vorsichtig mit einer feinen Pinzette ab und entfernen Sie dann sanft, aber fest den Knochen, indem Sie ihn nach oben heben. Achten Sie darauf, den Knochenkreis beim Anheben nicht zu verzerren, um eine mögliche Beschädigung der Dura zu vermeiden.

Tragen Sie den in steriler Kochsalzlösung getränkten Gelschaum vorsichtig auf die Dura auf, um die Blutung zu verstärken. Warten Sie, bis alle Blutungen vollständig gestoppt sind. Entfernen Sie vorsichtig den Gelschaum, um den Gerinnungsprozess nicht zu stören.

Beachten Sie, dass der Nahtbereich stark vaskularisiert ist, so dass sich die Blutung an dieser Stelle als tiefgreifend erweisen kann. Es ist wichtig, ausreichend Zeit abzuwarten, bis die Blutung aufhört. Befestigen Sie die Infusionspumpe am stereotaktischen Turm und schließen Sie den Controller an.

Führen Sie die 35-Gauge-Nadel in die Füllspritze ein. Spülen Sie die Spritze 10 Mal mit Ethanol, um sie zu sterilisieren, und 10 Mal mit steriler Kochsalzlösung, um Spuren von Ethanol zu entfernen. Entfernen Sie die Luftblasen aus der Spritze.

Führen Sie die Spritze in die Pumpe ein. Füllen Sie eine Einzeldosis des AV-Präparats und halten Sie es auf Eis. Füllen Sie die Spritze mit Viruslösung.

Zentrieren Sie die Nadel auf dem Bregma und führen Sie sie dann vorsichtig mit den folgenden Koordinaten in den Hippocampus ein: Anterior, posterior minus zwei, medial lateral plus minus eins, dorsal ventral minus eins. Diese Koordinaten befinden sich in der Nähe des Randes des Schädelbereichs. Warten Sie fünf Minuten, bis sich das Gewebe stabilisiert hat.

Injizieren Sie sieben Mikroliter AV-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 50 Nanolitern pro Minute. Warten Sie 10 Minuten, bis das Virus vollständig absorbiert ist. Entfernen Sie vorsichtig die Nadel.

Mit Gelschaum abtupfen, wenn Blutungen auftreten. Wiederholen Sie dies mit der kontralateralen Seite. Legen Sie das sterile Trockendeckglas auf die Oberseite der Dura in den gebohrten Kreisrahmen.

Halten Sie das Deckglas mit dem Vorderteil fest, um die Dura sanft zu glätten und die Kanten des Deckglases näher an die Schädeloberfläche zu bringen. Tragen Sie mit einer sterilen Nadel den dichten Cyanacrylatkleber auf die Deckglaskanten auf, um sie am Schädel zu befestigen. Warten Sie, bis der Kleber getrocknet ist.

Platzieren Sie eine Fixierstange, Antonnuss oder eine Sonderanfertigung im vorderen Teil des Schädels. Beachten Sie, dass die Fixierstange in einer Position platziert werden sollte, die eine horizontale Positionierung des Schädelfensters während der Bildgebungssitzung ermöglicht. Trage den Kleber auf die Ränder der Stange auf.

Warten Sie, bis der Kleber getrocknet ist. Beachten Sie, dass die Befestigungsstange so weit wie möglich vom Fenster entfernt platziert werden sollte. Wenn es zu nahe an der Scheibe platziert wird, können die Stange und die Schraube, die sie mit der maßgefertigten Halterung verbindet, während des Bildgebungsprozesses ein Hindernis für das Objektiv darstellen.

Bereiten Sie das Dentalacryl vor und tragen Sie es auf die Schädeloberfläche um das Glas herum auf. Hilfreich ist es, eine kraterartige Form um das Fenster herum zu bilden. Es entsteht ein Hohlraum für das Wasser, das später für die Abbildung mit dem Wasserobjektiv aufgetragen wird.

Erstellen Sie eine Kappe mit dem Dentalacryl, die den Rest des Operationsbereichs abdeckt Hautränder, Fixierungsstange, um den Krater um das Schädelfenster herum zu verstärken. Warten Sie, bis der Zahnzement ausgehärtet ist. Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie es in die Auffangkammer.

Warten Sie, bis sich das Tier von der Operation erholt hat, und beobachten Sie dabei die physiologischen Funktionen. Tragen Sie postoperative Anästhesie Cyroproferrin, 10 Milligramm pro Kilogramm, und Antibiotikabehandlung Baytril, fünf Milligramm pro Kilogramm, für 48 Stunden auf. Starten Sie den Ti-Saphir-Laser, schalten Sie das Mikroskop ein.

Das in diesem Experiment verwendete System ist mit einem Zwei-Photonen-Laser, einem OPO-System und einem Dual-Galliumarsenid-falsifizierten PMT ausgestattet. Legen Sie das Tier in die Induktionskammer und leiten Sie eine Anästhesie ein. Nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer und legen Sie es in die Gasanästhesiemaske unter das Mikroskop.

Verringern Sie den Sauerstofffluss auf null Punkt drei Liter pro Minute und die Isoflurankonzentration auf 1,52 %Befestigen Sie das Tier mit einer MT-Schraube oder einem anderen benutzerdefinierten System am benutzerdefinierten Mikroskoprahmen. Nivellieren Sie das Schädelfenster. Beachten Sie, dass es möglich ist, das Kopffixierungssystem des Mikroskopherstellers zu verwenden, obwohl der spezifische benutzerdefinierte Rahmen bessere Ergebnisse, eine verbesserte Kopfstabilität und eine konstante Positionierung in mehreren Sitzungen während eines chronischen Experiments liefert.

Zentrieren Sie mit den Einstellungen des Weitfeldmikroskops, einem Objektiv mit geringer Vergrößerung, den Blick auf eine der Seiten des retrosplenialen Kortex und fokussieren Sie ihn auf die Deckglasoberfläche. Tragen Sie einen Tropfen Wasser in die kraterartige Acrylmulde auf. Wechseln Sie zu einem Wasserimmersionsobjektiv über große Entfernungen.

Bewegen Sie das Objektiv in Richtung des Schädelfensters, bis der Wassermeniskus die Probe und das Objektiv verbindet. Wechseln Sie zur Zwei-Photonen-Einstellung und beginnen Sie mit dem Scannen der Probe von oben nach unten mit dem niedrigsten Zoom. Die Kreuzung der Duramaterie wird als Blendung eines hohen unspezifischen Signals sichtbar sein.

Passen Sie die Mikroskopaufnahmeeinstellungen in beiden Kanälen, GFP und mCherry, entsprechend der Signalstärke von fluoreszierenden Zellen an, um den gesamten Dynamikbereich abzudecken. Nachdem Sie ein geeignetes Neuron gefunden haben, bei dem der dendritische Baum von anderen Zellen getrennt ist, führen Sie einen ersten Scan nur mit GFP-Filtern durch, die auf den geringsten Zoom und den Z-Abstand von fünf Mikrometern eingestellt sind. Erhalten Sie eine maximale Projektion des Scanstapels und drucken Sie ihn für Anmerkungen in invertierten Farben.

Stellen Sie den Zoom auf einen Wert ein, der es ermöglicht, die gewünschten morphologischen Details abzubilden. Bilden Sie den gesamten dendritischen Baum im GFP- und mCherry-Kanal ab, wobei die maximale Projektion als Leitfaden dient. Mit diesem Protokoll wird es möglich sein, sowohl prä- als auch postsynaptische Strukturen im retrosplenialen Kortex wiederholt zu überwachen.

Dieser Ansatz könnte mit einem chronischen Experiment verwendet werden, bei dem Verhaltensmanipulationen mit Veränderungen in der Morphologie von Dendriten, synaptischen Stacheln oder präsynaptischen Neutronen korrelieren. Die bildgebenden Verfahren können in beliebiger Häufigkeit durchgeführt werden, jedoch wird ein Zeitintervall von 24 Stunden bevorzugt, um eine ordnungsgemäße Genesung des Tieres zu ermöglichen und die Auswirkungen der Anästhesie zu minimieren. Bei richtiger Anwendung ermöglicht diese Technik die Durchführung mehrerer bildgebender Sitzungen über einen Zeitraum von mehreren Monaten.