التمهيدي لالمناعية على نسيج Cryosectioned دماغ الفئران: مثال تلطيخ لالدبقية الصغيرة والخلايا العصبية

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام الكيمياء المناعية من أجل تصور البروتينات ذات الأهمية. على سبيل المثال ، IBA واحد للدبقية الصغيرة والخلايا العصبية للخلايا العصبية. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع الأقسام المعدة أولا في محلول حجب لمنع الارتباط غير المحدد.

كخطوة ثانية ، يتم وضع الأجسام المضادة ، التي تتعرف على البروتينين المختلفين المعنيين على الأقسام بين عشية وضحاها. يتم غسل الأقسام التالية واحتضانها في أجسام مضادة ثانوية من أجل إضافة علامات الفلورسنت إلى الأجسام المضادة الأولية. يمكن أن تشير نتائج الملصقات المزدوجة إلى البقع الدبقية الصغيرة داخل حقول الخلايا العصبية.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية في البداية لأن هناك العديد من المتغيرات التي يجب تعديلها. ستظهر هذه التقنية اليوم هازل ماي ، طالبة جامعية في مختبرنا. للبدء بإصلاح أدمغة القوارض بعناية وتقسيمها كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب ، ثم تخزينها بعناية عند سالب 80 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إليها.

عندما تكون جاهزا لمتابعة البروتوكول ، قم بإزالة الشرائح من الفريزر وإذابتها في درجة حرارة الغرفة. بمجرد إذابتها ، ضع الشرائح في رف واغسلها ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل منها. من هذه النقطة فصاعدا ، لا تدع الأقسام تجف.

جفف حواف الشرائح وقم بعمل حدود طاردة للسائل حول حافة الشريحة باستخدام قلم عنق الرحم لضمان تغطية متساوية للسائل وتقليل تأثيرات الحافة. بعد ذلك ، قم بحظر الأقسام عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من المصل في PBS إلى كل شريحة. يجب أن يكون المصل من الأنواع التي يتم فيها رفع الجسم المضاد الثانوي.

في هذه الحالة ، تم استخدام مصل الحمار. تأكد من أن محلول الانسداد يمتد إلى حافة الشريحة ويغطي الأنسجة بالكامل. لتجنب البقع غير المتساوية ، ضع الشرائح في غرفة الرطوبة لاحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

أثناء الحضانة ، قم بإعداد الأجسام المضادة الأولية لتخفيف الجسم المضاد IBA واحد إلى 5 ، 000 ، والجسم المضاد العصبي واحد إلى 500 في خليط من مصل الحمار 1٪. في PBS ، قم بإزالة محلول الانسداد وإضافة 300 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد ، الذي يحتوي على كلا الأجسام المضادة ذات الأهمية. أيضا ، قم بإعداد ثلاث شرائح تحكم.

أضف 300 ميكرولتر من IVA ، وتخفيف واحد بمفرده إلى شريحة واحدة ، و 300 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة للخلايا العصبية وحدها إلى شريحة ثانية ، و 300 ميكرولتر من مصل الحمار 1٪ في PBS. في شريحة ثالثة ، ضع جميع الشرائح في غرفة الرطوبة واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية في صباح اليوم التالي. اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل منها.

تحضير خليط الأجسام المضادة الثانوية الفلورية عن طريق تخفيف كلاهما من واحد إلى 250 في مصل الحمار 1٪ في PBS. أضف 300 ميكرولتر من الخليط على كل شريحة ، وضع الشرائح في غرفة رطوبة خفيفة وضيقة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل منها ، وأخيرا اشطفها بالماء المقطر المزدوج.

احم الشرائح من الضوء أثناء الغسيل. في PBS ، أضف بضع قطرات من وسيط التركيب المائي الذي يساعد في الحفاظ على شدة إشارة الفلورسنت لكل شريحة. ثم قم بتغطية الشريحة وانزلاقها وإزالة أي فقاعات هواء متبقية باستخدام قضيب قطني مائل لإغلاق وسائط التثبيت على الشرائح ومنع جفاف الأقسم.

قم بتغطية الحواف بطلاء الأظافر. تترك الشرائح لتجف بشكل مسطح لمدة ساعة واحدة في صندوق محمي بالضوء قبل تخزينها في حاوية محكمة الغلق ملفوفة بورق الألمنيوم عند أربع درجات مئوية. بمجرد أن يجف طلاء الأظافر ، أحضر الشرائح إلى غرفة المجهر للتصوير.

جهز الغرفة عن طريق إطفاء الأضواء العلوية وحجب أي مصادر إضاءة خارجية أخرى. قم بتشغيل المجهر ومصدر ضوء الفلورسنت وكمبيوتر التصوير. ثم ضع شريحة على مرحلة المجهر وقم بتركيزها.

باستخدام البرنامج المصاحب، اضبط التعريض الضوئي لكل طول موجي على حدة. تجنب الإفراط في تعريض الخبيث للضوء لفترات طويلة من الزمن لمنع التبييض الضوئي للعينة. ثم احصل على صور في كل قناة دون تحريك القسم أو ضبط التركيز.

اجمع الصور باستخدام برنامج التصوير واحفظها لتحليل الصور لاحقا. باستخدام بروتوكول التلوين الموصوف للتو ، يمكن الحصول بسهولة على صور الفلورسنت مثل تلك الموضحة هنا في القناة الحمراء IBA تظهر بوضوح صورة دبقية صغيرة موجبة ، وفي القناة الخضراء ، تبرز الخلايا العصبية الإيجابية فوق الخلفية. تظهر صور التحكم لكل من بقع الأجسام المضادة.

توضح الملصقات المزدوجة الداكنة مع IBA واحد وعلامة الخلايا العصبية الموضحة هنا في الغالب الخلايا الدبقية الصغيرة المتشعبة مع إسقاطات عصبية دقيقة طويلة واضحة عبر الطبقات القشرية. نتائج التلوين مثل تلك الموضحة هنا ممكنة أيضا إذا كانت جودة الأنسجة رديئة. يتضح سوء جودة الأنسجة من خلال عدم وجود أجسام خلايا محددة بوضوح وعمليات الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية المجزأة.

هناك نقص في وضوح تلطيخ الخلايا الدبقية الصغيرة والافتقار التام إلى تلطيخ الخلايا العصبية ، مما يجعل الصورة المتراكبة غير ذات مغزى أثناء محاولة هذه التقنية. من المهم تغطية الأقسام بالتساوي وتذكر عدم تركها تجف بين الخطوات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للتقنيات الكيميائية المناعية التمهيدية.