Name: Die Mesenteriallymphknoten Duct Cannulated Rattenmodell: Anwendung auf die Bewertung der Darm Lymphatische Drug Transport (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Lernen Sie die Kanülierung des mesenterialen Lymphgefäßes bei Ratten zur Quantifizierung von Lipid- und Arzneimitteltransport im lymphatischen System. Diese Methode ermöglicht die Bewertung intestinaler Absorptionsmechanismen in vivo.

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Die Finanzierung durch den Australian Research Council (ARC) und den National Health and Medical Research Council (NHMRC) wird dankbar gewürdigt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Ratte Mesenteriallymphknoten Kanülierung Modell ermöglicht eine direkte Quantifizierung der Konzentration und Geschwindigkeit des Transports von verschiedenen Zellen und Molekülen (wie Lipide und Drogen) aus dem Darm in die Lymphe und die Änderungen an diesen, die als Reaktion auftreten, um von verschiedenen Substanzen in Frage (Ernährung Antigen, Drogen, Formulierungen etc.) 10,27 und Krankheiten (Krebs, Viren, Colitis, Insulinresistenz, etc.) 5-7. Die in Lymphknoten gesammel...

Lymph fließt aus dem Dünndarm über eine unidirektionale Prozess, die zu einem Einzel Lacteals die innerhalb jeder Dünndarmzotten 1 enthalten sind, stammt. Lacteals sind relativ durchlässig für Flüssigkeit, Makromoleküle und Zellen und Lymphbildung damit beginnt mit der Eingabe von diesen Faktoren Lacteals. Der anfängliche Lymphe in den Chylusgefässe fließt anschließend aus dem Darm über ein Netz von lymphatischen Mikrogefäße, Sammeln (afferenten) Lymphgefäße, eine Reihe von Mesenteriallymphknoten und letztlich den postKnoten (efferenten) Lymphgefäße. Innerhalb der Knoten geht Lymphe durch eine Reihe von Markhöhlen, wo Austausch mit Knoten resident Immunzellen sowie Material in die Knoten aus dem Blut stattfindet. Alle Lymphe aus dem Dünndarm fließt schließlich konvergiert in den ableitenden überlegen Mesenteriallymphknoten Kanal und anschließend die Cisterna chyli. Die Cisterna chyli speichert auch Lymphdrainage die Schwanz peripheren Geweben, intestinal, Leber- und Lendenwirbelsäule und schließt sich dem Brust Lymphe Kanal zusammen mit Lymphe aus dem Mediastinum und Schädel Teile des Körpers. Der thorakale Lymphe Kanal mündet Lymphknoten direkt in das venöse System an der Verbindungsstelle der linken Vena jugularis und subclavia. Das hier beschriebene Protokoll, das die Sammlung von Lymphe aus der überlegenen Mesenteriallymphknoten Kanal ermöglicht direkt, erleichtert so die Analyse der verschiedenen Faktoren im Transit direkt aus dem Darm in die systemische (allgemein) Kreislauf über die Darm Lymphsystem. Die wichtigsten physiologischen Funktionen der Darm lymphatische System zugeordnet sind, um eine Fluidgleichgewicht aufrechtzuerhalten, um Lipid und lipophilen Molekülabsorption zu erleichtern und die entsprechende Immunantworten 1 zu ermöglichen. Tumorzellen und Viren über die Darm Lymphgefäße 2-4 und wichtigsten Änderungen in den Lymphgefäßen treten in mehreren Entzündungs- und Stoffwechselerkrankungen 5-7 propagieren auch. Könnennulation der Mesenteriallymphknoten Kanal zu sammeln Lymphe in das Mesenterium ermöglicht eine Analyse der Hauptfluidströmung über die Darm Lymphgefäße sowie die Quantifizierung der Konzentration und der Transportgeschwindigkeit von verschiedenen Zellen und Moleküle. Änderungen in der Konzentration oder Transit dieser Faktoren in Reaktion auf verschiedene Herausforderungen (zB Diäten, Antigene, Medikamente) und in Krankheitsmodellen (zB Colitis, HIV, Diabetes) beurteilt werden kann. Während es unmöglich, jede lymph Komponente, die analysiert und verglichen werden können, hier ausführlich beschrieben ist, Mesenteriallymphknoten vereinfachend aus wässrigen, Lipid- und zellulären Phasen. Interessierenden Komponenten in der wässrigen Phase umfassen Peptide und Proteine, wie Antigene oder Tolerogene 8, Immunbotenstoffen wie Zytokinen und Mastzellmediatoren 9 und metabolische Mediatoren wie Inkretine 10. Die Zellfraktion des post-Knoten Mesenteriallymphknoten besteht fast vollständig (über 99%) der lymphocytes 11. Verschiedene Immunzellen (dendritische Zellen, Mastzellen, etc.) geben Sie die Vor-Knoten mesenterialen Lymphgefäße, bleiben aber innerhalb des Knotens 12. Wenn die Zellen in afferenten Lymphknoten von Interesse sind, ist es möglich, diese Zellen durch Entfernen des Mesenteriallymphknoten sammeln Knoten einige Tage vor der Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal 12. Auf diese Weise wird die zu- und abführenden Lymphbahnen direkt verbunden sind und die Lymphzellen in afferenten Lymphe passieren direkt in den Mesenteriallymphknoten Kanal. Die Transit-und Phänotyp der verschiedenen Immunzellen, die durch die Darm Lymphgefäße können so überprüft werden. Vielleicht die häufigste Ursache für das Sammeln Mesenteriallymphknoten bisher zitierten, jedoch ist die Darmverarbeitung, Absorption und den Transport von Nahrungslipiden und lipophile Moleküle 10 zu studieren. Nach Einnahme werden die Nahrungslipiden verdaut (beispielsweise aus Triglyceriden zu Fettsäuren und Monoglyceride, phospholipid Fettsäuren und Lysophospholipid und Cholesterinester zu Fettsäure und Cholesterin, etc.) und aus dem Darmlumen in kleine Mizellen und vesikuläre Strukturen durch die Zugabe von Amphiphilen von Gallen dispergiert (Phospholipide, Cholesterin und Gallensalze) und die Wirkung von Pankreasenzyme 10,13. Von hier aus werden sie in Enterozyten absorbiert. Ein Teil der absorbierten Komponenten werden erneut veresterte Triglyceride, Phospholipide und Cholesterinester in der absorptionsfähigen Zellen (Enterozyten) zu bilden. Diese Wieder verestert Lipide werden aus einer Kombination von exogen aufgenommen Lipidkomponenten und endogene Lipidkomponenten aus dem sezernierten Gallen, Schleimhautlipidpools oder intestinalen Blutversorgung 13 zusammengesetzt. Von hier werden die veresterten Lipide entweder innerhalb Enterozyten gespeichert oder in Darm Lipoproteine ​​(Chylomikronen, Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDL)), zusammen mit verschiedenen Apoproteine ​​und andere lipophile Moleküle (gebaut <em&gt; zB Vitamine) 10,13. Nach dem Austritt aus Enterozyten Lipoproteine ​​sind spezifisch aus dem Darm in den systemischen Kreislauf über den mesenterischen Lymphsystem transportiert, da die Darm Lacteals durchlässiger sind, ihre Eingabe über das Darm Blutkapillaren. Ein Anteil der absorbierten Lipidkomponenten sind ebenfalls aus dem Darm in die Blutkreislauf über die Blutkapillaren und Pfortader als einzelne, nicht-Lipoprotein-assoziierten transportiert Moleküle 14. Im Allgemeinen ist jedoch die Pfortader Transportweg nur ein wichtiger Akteur bei der Aufnahme von kurz- und mittelfristigen Kettenlänge Lipiden. Die Sammlung von Mesenteriallymphknoten ermöglicht somit die Bewertung der Transport von Lipoproteinen und zugehörige Komponenten (Lipide, lipophile Moleküle, apo-Proteine) aus dem Darm. Die Lipoproteine ​​können quantifiziert werden und dadurch mit dem Vorteil, dass Mesenteriallymphknoten Lipoproteine, sind im allgemeinen in einer nascenT-Zustand, da sie nicht ausführlich durch systemische Enzyme, wie Lipoproteinlipase 15 modifiziert. Während die Mesenteriallymphknoten kanülierte Ratten-Modell hat vielleicht historisch am besten unter zur Analyse von Lipid / Lipoprotein-Transport aus dem Darm beschrieben, ist ein Bereich der expandierenden Interesse die Rolle von Lymphgefäßen in den Transport von lipophilen Arzneimitteln, Prodrugs und andere Xenobiotika 13,16 das ist der Schwerpunkt des hier beschriebenen Modells. Lipophile Medikamente (im allgemeinen solche mit log P&gt; 5 und Löslichkeit in langkettigen Triglycerid&gt; 50 mg / g, obwohl Ausnahmen offensichtlich sind) 17,18, Prodrugs 19 und anderen Fremdstoffen 13,16 kann der Zugriff auf die Darm Lymphgefäße entweder passiv oder gewinnen aktiv die Integration in Darm-Lipoprotein Transportwege 19. Die Ratte Mesenteriallymphknoten Kanülierung Technik hat somit viele Anwendungen. Bollmann et al. Beschriebenen ersten einen technique die Mesenteriallymphknoten Kanal in Ratten 1948 20 kanülieren. Seitdem wurde eine Vielzahl von Variationen des Modells beschrieben. So kann beispielsweise auftreten, wenn die Sammlung Ratte ist mit verschiedenen Anästhetika 21,22 betäubt oder im bewussten Zustand zurückgehalten, während 15 oder frei beweglichen 23,24. (- 5 ml / h in der Regel 0) 25 Ratten unterschiedliche Rehydratationslösungen und andere Substanzen, wie Lipide und Arzneimittelformulierungen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in den Magen, Darm oder parenteral verabreicht werden. In einigen Studien wurde die thorakale Lymphe Kanal anstatt Mesenteriallymphknoten Kanal Kanüle eingeführt, um den Transport vom Darm über die Lymphbahnen zu schätzen, obwohl dies Transit aus dem Dünndarm überschätzen, in Abhängigkeit von der Faktor von Interesse, da die Brust Lymphe Kanal empfängt auch Lymphe anderer Regionen 22,26. Lymph Kanülierung Modelle wurden auch in einigen anderen Spezies einschließlich Mäusen 15,27, Mini pi beschriebengs 12, Schafe 28,29, Schweine und Hunde 30 31. Allerdings ist der Rattenmodell der am weitesten und konsistent zitiert. Detaillierte Protokolle für die Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal gefolgt von Sammlung von Lymphe in bewusster 25 oder 22 narkotisierten Ratten und Mäusen 15,27 vorher veröffentlicht worden und der interessierte Leser wird auf diese Protokolle gerichtet. Dieses Protokoll ist die erste, die Technik in eine visualisierte Format zeigen. Die Lymphe kanülierten Ratten-Modell hat Vorteile gegenüber größeren Tiermodellen in Bezug auf die Kosten, die Leichtigkeit der Operation und ethische Erwägungen. Im Vergleich zum Maus-Modell, ist Mesenteriallymphknoten Kanülierung Chirurgie auch einfacher in der Ratte, obwohl die Maus-Modell ermöglicht genauere Untersuchungen in transgenen Tieren 27. Dennoch gibt es einige Einschränkungen des Rattenmodells, insbesondere mit Unterschieden in der Physiologie assoziiert werden können und die extrapolatIon zu anderen präklinischen und klinischen Situationen. Zum Beispiel bei der Ratte Gallenfluss konstant und unabhängig von der Nahrungsaufnahme während in höheren Arten Essen ist oder Lipide zu stimulieren Gallenfluss 32. Dies schafft Herausforderungen für den Erhalt Vertreter vor und nach dem Essen-Umgebungen in der Ratte, das, was in größeren Arten und Menschen gesehen zu reflektieren. Für den Wirkstofftransport Studien, können die größeren Arten auch bei der Beurteilung Lymphtransports nach der Verabreichung von realistischen menschlichen Dosis bildet 25 vorzuziehen. In einer aktuellen Studie wurden Lipidtransport im Mesenteriallymphknoten gefunden über Artgrenzen (Maus, Ratte, Hund) nach Verabreichung einer äquivalenten Masse und Art der Lipid, das ein gewisses Vertrauen in die Extrapolation Lipidtransport von Daten über Arten 27 liefert vergleichbar sein. Doch der Transport eines Modells lipophiles Arzneimittel, Halofantrin, in der Reihenfolge der Tiergröße (dh Hund&gt; Ratte&gt; Maus) eingestuft. Ein Skalierungsfaktor kann somit ex erforderlichtrapolate lymphatischen Medikamententransportdaten von der Ratte auf andere Arten. Eine Beschränkung der Lymphe Kanülierung Modelle im Allgemeinen ist, dass passive Lymphe Sammlung direkt von einer lymphatischen Kanal kann Lymphfluss und Transport ändern, da Lymphgefäße arbeiten gegen ein Druckgefälle, die geändert wird, wenn das Schiff eine Kanüle 33. Die Lymphe Kanülierung Modell kann auch schwierig sein, in Laboratorien, die nicht vertraut mit der Technik sind zu etablieren. Alternative Modelle wurden somit beschrieben worden. Zum Beispiel kann die Durchfuhr von Faktoren über den Darm lymphatischen Systems, wie Lipoproteine ​​und lipophile Moleküle, wurde indirekt über die Sammlung von Blut untersucht. Ein solches Modell beinhaltet den Vergleich Blutkonzentrationen von Lipiden und / oder Drogen nach oraler Verabreichung in der Anwesenheit und Abwesenheit von Inhibitoren (zB Colchicin, Pluronic L81, Cycloheximid) von Darm Lipoprotein-Produktion, die Lymphtransports 34 zu blockieren. Ein Vorteilvon Modellen, die Lymphtransports quantifizieren indirekt über Entnahme von Blutproben ist, dass es ermöglicht eine Bewertung der Lymphtransports beim Menschen als invasive Chirurgie ist nicht erforderlich 35. Inhibitoren der Lymphtransports sind jedoch nicht spezifisch, und Faktoren, die durch die Lymphgefäße transportiert werden verdünnt und in den systemischen Kreislauf, die eine solche Beurteilung erschwert modifiziert. In vitro-Alternativen sind ebenfalls beschrieben worden. Beispielsweise wurden Caco-2-Zellkulturen oder isolierte Enterozyten verwendet worden, um genauer zu untersuchen die intestinale Sekretion von Molekülen, die Lymphgefäße 36-38 einzugeben. Eine fortschrittliche In-vitro-Modell, das eher dem menschlichen Darm-Mikroumgebung ist auch kürzlich beschrieben 39. In diesem Modell wird eine lymphatische endotheliale Zellschicht co-kultiviert mit Caco-2-Zellen, die eine detaillierte Analyse der Übergang von Stoffen aus dem Darm in das Lymphsystem zu können. Jedoch in vitro Zellsystemen fehlt Wechselstrom und übertragen also die Zusammenschaltung mit einem Darmlumen und die zugrunde liegenden Blut-und lymphatischen Gefäßversorgung. In einem alternativen Ansatz Kassis et al. Wurde ein Dual-Channel (High-Speed-Hellfeld-Video und Fluoreszenz) in situ-Bildgebungssystem, das quantitative Vergleiche zwischen Gefäßkontraktion, den Lymphfluss und fluoreszierende Lipidkonzentrationen in mesenterialen Lymphgefäße 33 ermöglicht. Ein Vorteil dieses Modells gegenüber dem oben erwähnten in-vitro-Systemen ist, dass es ermöglicht, eine genaue Überwachung des Durchgangs von Immunzellen durch die Lymphgefäße. Absolute Messung von Massen Lipid (oder Drogen) Transport sind jedoch noch nicht mit bildgebenden Verfahren fest In vitro. Und in silico Ansätze speziell vorherzusagen das Ausmaß der lipophilen Wirkstofftransport über die Darm Lymphgefäße wurden ebenfalls veröffentlicht 40-42. Zum Beispiel kann die ex vivo-Affinität von mehreren compounds für Plasma Chylomikronen erwies sich recht gut mit ihren lymphatischen Transport in vivo 41 korrelieren. Anschließend etablierte eine dieselbe Gruppe in silico-Modell der Drogenaffinität für Chylomikronen basierend auf mehreren physikalisch-chemischen Eigenschaften 40 vorherzusagen. Holm et al. Darüber hinaus ein in silico-Modell relativ komplex komplett zu prognostizieren lymphatischen Transport lipophiler Verbindungen auf der Basis der molekularen Deskriptoren 42. Diese Modelle können einen sinnvollen Ansatz, um das Ausmaß des lymphatischen Transport von unbekannten Drogen vorherzusagen ist. Validierung der Modelle mit einer breiten Palette von Medikamenten und in verschiedenen Labors werden jedoch aufgefordert werden, ihre Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu bestätigen. Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal bleibt somit das einzige Mittel, um den Inhalt der Lymphdrainage des Dünndarms und der Transitgeschwindigkeit des komplexen Reihe von Faktoren (Zellen, Proteine ​​direkt zu untersuchen,Peptide, Lipide, Arzneimittel) in der Lymphe bei einer in vivo-Situation. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal und Halsschlagader, die die Sammlung von Mesenteriallymphknoten und systemischen Blut von narkotisierten Ratten ermöglicht. Repräsentative Daten zeigen, wie das Modell verwendet, um Lipid- und Arzneistofftransport aus dem Darm über die mesenterischen Lymphsystem zu untersuchen. Dies wird durch eine Erörterung der Schwierigkeiten, die bei der Festlegung des Modells sowie Informationen zur Fehlerbehebung auftreten können, gefolgt. Einmal etabliert das Modell ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Darm-lymphatischen Transport zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Sterile Kochsalzlösung</td><td>Baxter healthcare</td><td>AHB 1307</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Beispiel hier ist Baxter 100 ml Kochsalzbeutel, Schachtel mit 50</td></tr><tr><td>70 % Ethanol in Wasser</td><td>Jede</td><td></td><td>Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Chlorhexidingluconat-Lösung (Microshield 4)</td><td>Livingstone International</td><td>JJ60243L</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L</td></tr><tr><td>Betadin-Lösung</td><td>Livingstone International</td><td>BU0510</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510</td></tr><tr><td>Ilium Ketamil (Ketamin 100 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>KETA I 1</td><td>http://www.provet.com.au/</td></tr> <tr><td>Ilium Xylazil (Xylazin 100 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>TRO-3828</td><td>http://www.provet.com.au/</td></tr> <tr><td>ACP 10 Injektion (Acepromazin 10 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>VTG-DACP010020</td><td>http://www.provet.com.au/</td></tr> <tr><td>Natrium-Pentobarbiton</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>24529</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Beispiel hier ist Lethabarb&reg; 325 mg/ml Natriumpentobarbiton, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au</td></tr><tr><td>Heparin (35000I.E. in 35 mL)</td><td>Sigma Pharmaceuticals</td><td>337220</td><td>http://sigmaco.com.au/</td></tr> <tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Dinatriumsalzdihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel hierfür ist Dinatriumsalz von EDTA von Sigma.</td></tr><tr><td>Kanüle aus Polyethylen (PE) ø 0,96 mm x i.d. 0,58 mm</td><td>Mikroröhrchenverlängerungen</td><td>PE8050</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Beispiel hierfür PE-Schlauch 0,96 x0,58 mm, 30 m</td></tr><tr><td>Kanüle aus Polyethylen (PE) ø 0,8 mm x i.d. 0,5 mm</td><td>Mikroröhrchenverlängerungen</td><td>PE9658</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Beispiel hier ist PE-Schlauch 0,8 x0,5 mm, 30 m</td></tr><tr><td></td><td>Lineal Beliebig</td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td></td><td>Markierungen Jede</td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Zigarettenanzünder</td><td>Jede</td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Veterinärkleber</td> Jede <td>Marke kann verwendet werden</td><td>23</td><td></td></tr><tr><td>Gauge Nadeln</td><td>Livingstone International</td><td>DN23GX0.75LV</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel hier ist die Livingstone Einwegnadel, steril, 23GX0,75 Zoll, 100 / BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6& search=DN23GX0.75LV</td></tr><tr><td>25 Gauge Nadeln</td><td>Livingstone International</td><td>DN25GX1.0LV</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel hierfür ist die Livingstone Einwegnadel, steril, 25GX1,0 Zoll, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV</td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>Livingstone International</td><td>T3SS01TA</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel hier ist Terumo Spritze 1 ml Slip Tuberculin 100/Schachtel. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search = T3SS01TA</td></tr><tr><td>10 ml Spritze</td><td>Livingstone International</td><td>T3SS10SA</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel ist hier die Terumo Spritze 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA</td></tr><tr><td>Mulltupfer</td><td>Livingstone International</td><td>GSC075</td><td>Jede Marke kann verwendet und auf die gewünschte Größe zugeschnitten werden. Beispiel hier sind Mulltupfer mit Baumwollfüllung 7,5x7,5 cm, 8-lagig. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075</td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Livingstone International</td><td>CTAST075DP</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel hierfür ist der Livingstone-Baumwollapplikator aus Kunststoff mit doppelter Spitze. 75MM. 100/STÜCK http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Ratek</td><td>WT1</td><td>Jede Marke, die die Temperatur bei 37 °C hält, kann verwendet werden. Ein Beispiel hierfür ist die Warmhalteschale von Ratek.</td></tr><tr><td>OP-Leuchte</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-0215 mit 72-0267</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel hierfür ist die Harvard-Apparatur V-Lux 1000 Kaltlichtquelle mit gegabeltem Schwanenhals-Lichtleiter, Schwarz, 4,7 mm Faserdurchmesser (jeder Arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail und&nbsp; http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___</td></tr><tr><td>Operationsmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>495005-0014-000</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Beispiel ist hier das Zeiss Stereomikroskop Stemi 2000-C mit Stativ S Double Spot und KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143</td></tr><tr><td>Seidennaht</td><td>Livingstone International</td><td>DTSK163019F4</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Beispiel hier ist &nbsp; 3/8 Kreis Reverse Cut Seidennaht 3/0 Faden 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4</td></tr><tr><td>Skalpellklingen</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10020-00</td><td>Es kann jede Marke verwendet werden. Ein Beispiel hier ist die FST Skalpellklinge #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191</td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10004-13</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel hier ist der FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51</td></tr><tr><td>1 x Kleine chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14060-09</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Beispiel hier ist FST Feinschere, 9 cm mit 21 mm Schneide, scharf, gerade. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17</td></tr><tr><td>2 x Pinzette mit gezackter, gebogener Spitze</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11001-13</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel ist hier die FST 13 cm Pinzette mit Standardmuster und gebogener 2,8x1,4 mm Spitze. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32</td></tr><tr><td>1 x Iridektomie-Schere</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>15000-08</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Beispiel hier ist FST Vannas Federschere - 2,5 mm Schneide, gerade. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16&nbsp;</td></tr><tr><td>1 x Pinzette mit gerader Spitze</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11650-10</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Beispiel hier ist FST Graefe 10 cm gerade mit gezackter 1 x 0,99 mm Spitze. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32</td></tr><tr><td>1 x Pinzette mit glatter, scharfer, gerader, feiner Spitze</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11251-10</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Beispiel hier ist FST Dumont #5 Pinzette gerade 11cm mit 0,08 x 0,04mm Spitze. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29</td></tr><tr><td>1 x Pinzette mit glatter, fein gebogener Pinzette</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11063-07</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel ist hier die FST Delicate Pinzette 9 cm mit glatter 0,4 x 0,3 mm Spitze. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360</td></tr><tr><td>2 x Hämostaten</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>13010-12</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Nicht alle Bediener verwenden die Hämostatika. Beispiel sind FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostate mit 20 mm Länge x 1,3 mm Breite gezackt, gerade Spitze. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33</td></tr><tr><td>1 x Nahtnadelhalter</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12001-13</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel ist hier der FST 13cm Hasley Nadelhalter mit 16 mm Länge x 1,9 mm Breitespitze. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70</td></tr><tr><td>1 x Arterienklemme</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>18050-28</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Beispiel ist hier die FST Bulldog Serrefines gerade, 28 mm lang, 9x1,6 mm Backenmaß mit mittlerer Klemmpresse. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82</td></tr><tr><td>Ölsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1008</td><td>Bei Bedarf kann jede Marke verwendet werden. Beispiel hier ist 99% reine Ölsäure. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>14C-Ölsäure</td><td>Perkin&nbsp;</td><td>NEC317050UC&nbsp;</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Beispiel hier ist Ölsäure, [1-14C]-, 50&micro; Ci (1,85 MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC</td></tr><tr><td>Natriumtaurocholat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4009</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel hierfür ist Taurocholsäure-Natriumsalzhydrat &ge; 95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>Halofantrine</td><td>Glaxo Smith Kline</td><td></td><td>Halofantrine wurde freundlicherweise als Geschenk von Glaxo Smith Kline</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71507</td> zur Verfügung gestellt<td>. Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel hierfür ist das monobasische Natriumphosphat-Monohydrat BioXtra für die Molekularbiologie >99,5 %. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71643</td><td>Jede Marke kann verwendet werden. Ein Beispiel hierfür ist das zweibasische Natriumphosphat-Dihydrat BioUltra für die Molekularbiologie >99 %. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU</td></tr></tbody></table>

die mesenteriallymphknoten duct cannulated rattenmodell: anwendung auf die bewertung der darm lymphatische drug transport

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Die Darm Lymphsystem spielt eine Schlüsselrolle in den Flüssigkeitstransport, Lipidabsorption und Immunfunktion. Lymph fließt direkt aus dem Dünndarm über eine Reihe von Lymphgefäßen und Knoten, die an der oberen Mesenteriallymphknoten Kanal konvergieren. Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal ermöglicht somit die Sammlung von Mesenteriallymphknoten aus dem Darm fließt. Mesenteriallymphknoten aus einer Zellfraktion von Immunzellen (99% Lymphozyten), wässrige Fraktion (Flüssigkeit, Peptide und Proteine, wie Zytokinen und Darmhormone) und Lipoproteinfraktion (Lipide, lipophile Moleküle und apo-Proteine). Die Mesenteriallymphknoten Kanal Kanülierung Modell kann daher verwendet, um die Konzentration und die Geschwindigkeit der Beförderung einer Reihe von Faktoren aus dem Darm über das lymphatische System zu messen. Änderungen dieser Faktoren in Reaktion auf verschiedene Herausforderungen (zB Diäten, Antigene, Medikamente) und bei Krankheiten (zB entzündliche Darmerkrankung, HIV, Diabetes) kann auch be bestimmt. Ein Bereich des expandierenden Interesse ist die Rolle des lymphatischen Transport bei der Absorption von oral verabreichtem lipophile Arzneimittel und Prodrugs, die mit Darmlipidaufnahmewege zuzuordnen. Hier beschreiben wir im Detail eine Mesenteriallymphknoten Kanal kanülierten Ratten-Modell, die Bewertung der Geschwindigkeit und Ausmaß der Lipid- und Wirkstofftransport über das lymphatische System ermöglicht mehrere Stunden nach einer Darm Lieferung. Das Verfahren ist leicht an die Messung von anderen Parametern in der Lymphe. Wir bieten ausführliche Beschreibungen der Schwierigkeiten, die bei der Festlegung dieser komplexen chirurgischen Verfahren auftreten können, sowie repräsentative Daten aus fehlgeschlagenen und erfolgreichen Experimenten Anleitung zur experimentellen Erfolg zu bestätigen und die erhaltenen Daten zu interpretieren ist.

Die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments, das kumulierte Ausmaß und Geschwindigkeit der Lipid- und Arzneistofftransport über das Lymphsystem folgenden Intestinallieferung Verwendung der Mesenteriallymphknoten Kanülierung Modell zur Quantifizierung sind in Abbildung 4 und 5 gezeigt. In diesem Experiment wurden 200 ug des Modells lipophilen und 7,1 mg 2-Monoolein in 5,6 ml 5 mM Natriumtaurocholat in Phosphat-gepufferte verteilt - Drogen Halofantrin wurde in den Zwölffingerdarm von...

Hier beschreiben wir eine Technik zur Kanülierung des mesenterialen Lymphgangs bei Ratten, die die Quantifizierung des Lipid- und Wirkstofftransports über das Lymphsystem nach der intestinalen Verabreichung ermöglicht. Die Technik kann angepasst werden, um die mesenteriale Lymphkonzentration und/oder den Transport von Flüssigkeit, Immunzellen, Peptiden, Proteinen und lipophilen Molekülen zu beurteilen.

Die Mesenteriallymphknoten Duct Cannulated Rattenmodell: Anwendung auf die Bewertung der Darm Lymphatische Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Rate und das Ausmaß des Transports von Lipiden und Arzneimitteln in das intestinale lymphatische System nach intestinaler Applikation zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst der Ductus lymphaticus mesentericus zur Sammlung von Lymphflüssigkeit isoliert und kaniert wird. Im zweiten Schritt wird der Duodenum kaniert, um eine Infusion in den Darm zu ermöglichen, und anschließend wird die Arteria carotis kaniert, um die Entnahme von Blutproben zu ermöglichen.Im letzten Schritt wird die experimentelle Behandlung in das Duodenum appliziert, und Lymphe sowie Blut werden zur Quantifizierung systemischer Lipid- oder Arzneimittelkonzentrationen gesammelt. Letztendlich kann dieses Modell verwendet werden, um die gesamte Absorption und den intestinalen lymphatischen Transport von Lipiden und Arzneimitteln nach intestinaler Applikation zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die direkte Kanülierung des Darmlymphstamms und die Sammlung von Lymphe über den gesamten experimentellen Zeitraum hinweg ermöglicht.Dies ermöglicht eine Abschätzung der absoluten Masse an Material, das in die mesenteriale Lymphe gelangt und durch sie hindurchströmt. In vivo erlaubt dieses Modell die in-vivo-Beurteilung des Transports von Wirkstoffen und Lipiden. Es kann außerdem verwendet werden, um den intestinalen lymphatischen Transport beliebiger Faktoren sowie die Veränderung des lymphatischen Transports solcher Faktoren als Reaktion auf unterschiedliche Herausforderungen oder Krankheitszustände zu messen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Kanülierung des mesenterischen Lymphgangs aufgrund der geringen Größe und Zerbrechlichkeit des Gangs sowie des nüchternen Zustands der Tiere kompliziert und schwierig ist. Die Veranschaulichung des Verfahrens wird mein Kollege und Mitkollege an der Monash University, Dr. Natalie Cus, sowie ein leitender Postdoktorand der Arbeitsgruppe, Dr. LJ Hugh, übernehmen. Am Tag vor der Operation schneiden Sie die Kanülen auf die geeigneten Längen zu und verwenden eine sterile chirurgische Klinge, um an der Spitze jedes Tubing-Stücks eine Schräge anzufertigen. Bereiten Sie als Nächstes die intra-duodenale Kanüle vor, indem Sie die Kanüle rückwärts in eine Schleife führen und diese anschließend erhitzen, um einen Verankerungspunkt im Tubing zu erzeugen.Am Tag der Operation rasieren Sie das Fell von der rechten Bauch- und Nackenseite sowie vom linken Schlüsselbeinbereich einer anästhesierten erwachsenen Ratte und desinfizieren Sie die Operationsstellen anschließend aseptisch durch dreimaliges Abwischen mit Povidon-Iod-Lösung und 70 %igem Ethanol, um den Lymphgang zu kanülieren. Legen Sie das Tier mit der rechten Seite nach oben und öffnen Sie mit einer sterilen Skalpellklinge durch einen geraden vier Zentimeter langen Schnitt, der sich vom Schwertfortsatz bis zum rechten Flankenbereich etwa zwei Zentimeter unterhalb des Rippenbogens erstreckt, die oberste Schicht der Bauchmuskulatur. Heben Sie den Dünndarm unter die linke Bauchwand und fixieren Sie ihn mit zwei bis drei mit physiologischer Kochsalzlösung getränkten sterilen Mullkompressen an dieser Position.Bringen Sie dann die Ratte über eine horizontal unter dem Tierkörper auf Höhe der rechten Niere platzierte 10-Milliliter-Kunststoffspritze. Um die Visualisierung des mesenterialen Lymphgefäßes zu erleichtern, lokalisieren Sie den oberen mesenterialen Lymphgang, der einen Durchmesser von etwa 0,5 bis einem Millimeter aufweist, senkrecht zur rechten Niere verläuft und unmittelbar kranial sowie parallel zur dunkelroten, pulsierenden Mesenterialarterie liegt. Beachten Sie, dass der obere mesenteriale Lymphgang bei nicht nüchternen Ratten, wie hier dargestellt, weiß, undurchsichtig und leichter sichtbar ist als bei nüchternen Ratten.Anschließend führen Sie ein Paar gerader Pinzetten parallel zum oberen mesenterischen Lymphgang durch das perineale Fettgewebe am unteren Rand der rechten Niere und durch die darunterliegenden Bindegewebsschichten direkt unterhalb der Vena cava. Ziehen Sie dann mit der Spitze der Pinzette die Lymphkatheter durch das perirenale Fettgewebe, sodass ein Ende unmittelbar neben dem mesenterialen Lymphgang liegt und das andere Ende auf Höhe der rechten Niere aus dem Tier herausgeführt wird. Danach isolieren Sie mithilfe eines Operationsmikroskops und einer Juwelierspinzette den mesenterialen Lymphgang durch stumpfe Präparation aus den überlagernden Schichten von Bindegewebe und Fettgewebe, beginnend am unteren Ende, wobei darauf zu achten ist, den Lymphgang nicht zu beschädigen, sobald dieser freigelegt ist.Verwenden Sie die Spitze der feinen Pinzette, um ein kleines Loch in den Lymphgang zu bohren. Stellen Sie sicher, dass die Lymphkaniüle vollständig mit der Antikoagulanslösung gefüllt ist und keine Luftblasen vorhanden sind, und führen Sie die Lymphkaniüle mithilfe einer kleinen Pinzette etwa zwei bis vier Millimeter über die Einstichstelle in den mesenterialen Lymphgang ein. Falls die Kanülierung erfolgreich ist, wird ein allmählicher Fluss von Darmlympe am freien Sammelende der Kaniüle beobachtet.Wenn dies der Fall ist, geben Sie einen kleinen Tropfen Cyanacrylat-Kleber über die Eintrittsöffnung in den Lymphgang, um die Kanüle zu sichern, und achten Sie darauf, dass überschüssiger Kleber die Gefäße nicht verstopft, um den Zwölffingerdarm zu kanülieren. Zunächst wird das Gewebe als hellrosafarbener Abschnitt des Dünndarms identifiziert, bei vorsichtigem nach unten ziehenden Zugriff wird der Magen sichtbar. Anschließend wird mit einer sterilen 23-Gauge-Nadel ein kleines Einstichloch im Bereich des Pylorus des Zwölffingerdarms angelegt, etwa zwei Zentimeter unterhalb des Übergangs von Magen zum Zwölffingerdarm.Als Nächstes wird das js-förmig gebogene Hakenende der duodenalen Kanüle durch die Punktionsstelle eingeführt und die Kanüle mit einem Tropfen Sano-Acrylkleber fixiert. Anschließend wird der Schnitt in der Bauchmuskelwand mit Nähten verschlossen. Die Kanülierung der Arteria carotis kann vor oder nach der Kanülierung des Ductus thoracicus durchgeführt werden. Üblicherweise bevorzugen wir die Kanülierung der Arteria carotis vor der des Lymphgefäßes, um die Gefahr zu verringern, dass die Lymphkanüle beim Bewegen des Tieres verrutscht. Zur Kanülierung der Arteria carotis markieren Sie zunächst die Kanüle der Arteria carotis 2,5 Zentimeter von der abgeschrägten Spitze entfernt, um den einzuführenden Tubing-Abschnitt zu kennzeichnen.Verbinden Sie dann das nicht abgeschr&auml;gte Ende der Kan&uuml;le mit einer mit einer Antikoagulansl&ouml;sung gef&uuml;llten Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und f&uuml;llen Sie die Kan&uuml;le mit der L&ouml;sung, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Luftblasen vorhanden sind. F&uuml;hren Sie anschlie&szlig;end einen ein bis 1,5 Zentimeter langen longitudinalen Schnitt durch die Hautschicht links der Luftr&ouml;hre in sagittaler Ebene durch und verwenden Sie dann stumpfe Pinzetten, um das subkutane Bindegewebe zu pr&auml;parieren und die darunterliegenden Halsmuskeln freizulegen. Klappen Sie die Halsmuskeln zur&uuml;ck, um die pulsierende linke A. carotis zu enth&uuml;llen, die sich etwa einen Zentimeter unterhalb der Hautoberfl&auml;che befindet.Reinigen Sie dann das überlagernde Bindegewebe der Arterie durch stumpfe Dissektion und isolieren Sie mithilfe stumpfer Gewebezangen einen etwa ein Zentimeter langen Abschnitt der Arterie. Anschließend führen Sie mit feinen Pinzetten zwei Seidenfäden unterhalb der Arteria carotis ein, wobei Sie diese an beiden Enden des isolierten Arterienabschnitts platzieren. Danach binden Sie den Faden zu, der weiter vom Herzen und Schlüsselbein der Ratte entfernt liegt, und legen ein Paar gerade, feine Pinzetten unter die Arteria carotis, um den Blutfluss durch die Arterie zu unterbinden.Verwenden Sie nun feine Iris-Scheren, um einen kleinen Einschnitt auf der Oberseite der Arterie etwa ein Drittel vom oberen Ende des isolierten Bereichs entfernt vorzunehmen. Führen Sie die Spitze der Kanüle mit einer gebogenen Pinzette ein. Sobald die Kanüle eingeführt ist, entfernen Sie die gerade feine Pinzette, um den Blutfluss zu verschließen, und schieben Sie die Kanüle unter Verwendung von zwei Paar Pinzetten 2,5 Zentimeter weit in die Arterie voran.Eine zum Halten der Kanüle innerhalb der Arterie, um ein Zurückfließen von Blut zu verhindern, und die andere zum Einführen der Kanüle. Anschließend eine kleine Arterienklemme verwenden, um die Kanüle in der Arterie zu fixieren. Antikoagulanslösung in die Kanüle injizieren und danach eine geringe Menge Blut aspirieren, um die Durchgängigkeit der Schläuche zu bestätigen.Spülen Sie dann die Kanüle mit einer Antikoagulanslösung aus und verschließen Sie das Ende mit der Flamme eines Feuerzeugs. Befestigen Sie die Kanüle abschließend mit Nähten und entfernen Sie die Arterienklemme. Anschließend eine dritte Naht um die Arterie und die Kanüle legen, die Länge der Nähte um die Arterie verkürzen und die Halswunde nach der Erholungsphase mit weiteren Nähten verschließen, wobei über die Duodenalkanüle eine Formulierung der Untersuchungsinteresse in das Tier infundiert wird.Wie in der Grafik nach der Verabreichung des Modells veranschaulicht, lag die mittlere Lymphflussrate bei erfolgreich kanierten Ratten nach Gabe des lipophilen Wirkstoffs Halofanefen zwischen 0,4 und 1,3 Milliliter pro Stunde. Bei einigen Tieren war die Lymphflussrate während der ersten ein bis drei Stunden nach der Kaniulation leicht niedriger, bevor sie anstieg – ein häufig beobachtetes Phänomen nach erfolgreicher Lymphkaniulation bei nicht erfolgreich kanierten Ratten. Die Flussrate blieb jedoch während des gesamten Sammelperiods deutlich niedriger als in den erfolgreichen Experimenten.Ebenso war in diesen repräsentativen Experimenten der kumulative lymphatische Transport von Triglycerid und Halal-RIN bei den erfolglos kanierten Tieren deutlich geringer. Dagegen betrug im Erfolgreich-Kanierten-Gruppen der mittlere kumulative Halalan-Transport 15,1 % der Dosis und der kumulative Triglycerid-Transport 61 Milligramm über 10 Stunden. In diesem repräsentativen Lipidtransport-Experiment lag der Anteil der verabreichten radioaktiv markierten exogenen Lipiddosis, der über die Lymphe transportiert wurde, bei 54 %. Diese Werte unterschieden sich nicht signifikant von zuvor beobachteten Werten.Für eine ähnliche Formulierung erreichen die Transportraten sowohl von Triglyceriden als auch von Arzneimitteln in die Lymphe einige Zeit nach der Verabreichung von Lipid und Arzneimittel ein Maximum und kehren anschließend auf Ausgangswerte zurück. Wie typisch für Experimente zum intestinalen lymphatischen Lipid- und Arzneimitteltransport. Die Rate des Arzneimitteltransports in die Lymphe während jedes Zeitintervalls spiegelt dabei das Szenario des Triglyceridtransports wider, da das Arzneimittel in die Lymphe transportiert wird.In Verbindung mit den triglyceridreichen Lipoproteinen kann die Kanülierung, einmal beherrscht, innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen werden, sofern keine Schwierigkeiten auftreten. Nach diesem Verfahren können die Bestandteile des gesammelten Lymphflüssigkeit isoliert und für weitere Experimente verwendet werden, beispielsweise zur Reinfusion in Empfängertiere, um direkt deren Funktion, Stoffwechsel, Clearance oder Verteilungsmuster zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis der Techniken zur Isolierung und Kanülierung des Ductus lymphaticus mesentericus, der Arteria carotis und des Duodenums haben.Mithilfe dieser Techniken sollten Sie in der Lage sein, den Transport von Arzneistoffen, Lipiden und anderen Faktoren aus dem Darm über das Mesenteriallymph durch und in das Mesenteriallymph in Viva zu bewerten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Kanülierung des mesenterialen Lymphgangs in einem Rattenmodell zur Entnahme von Lymphflüssigkeit

Dieses Video zeigt die intraduodenale Kanülierung in einem Rattenmodell. Nach der Betäubung der Ratte wird der Zwölffingerdarm lokalisiert und eine kleine Punktion erstellt. Eine J-förmige Kanüle mit abgeschrägter Spitze wird vorsichtig eingeführt und gesichert und der Schnitt verschlossen. Das kanülierte Rattenmodell ermöglicht die intraintestinale Infusion für immunpathologische Studien.

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