Die Mesenteriallymphknoten Duct Cannulated Rattenmodell: Anwendung auf die Bewertung der Darm Lymphatische Drug Transport

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Geschwindigkeit und das Ausmaß des Transports von Lipiden und Medikamenten in das intestinale Lymphsystem nach der intestinalen Verabreichung zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst der Mesenteriallymphgang für die Lymphentnahme isoliert und kanüliert wird. Im zweiten Schritt wird der Zwölffingerdarm kanüliert, um eine Infusion in den Darm zu ermöglichen, und dann wird die Halsschlagader kanüliert, um die Entnahme von Blutproben zu ermöglichen.

Im letzten Schritt wird die experimentelle Behandlung in den Zwölffingerdarm eingebracht und die Lymphe und das Blut für die Quantifizierung der systemischen Lipid- oder Arzneimittelspiegel entnommen. Letztendlich kann dieses Modell verwendet werden, um die Gesamtabsorption und den intestinalen Lymphtransport von Lipiden und Medikamenten nach der intestinalen Verabreichung zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die direkte Kanülierung des mesenterialen Lymphgangs und die Entnahme von Lymphe über den gesamten Versuchszeitraum ermöglicht.

Dies ermöglicht eine Abschätzung des absolut massiven Materials, das in und durch die Mesenteriallymphe fließt. In vivo ermöglicht dieses Modell jedoch die in vivo Bewertung des Wirkstoff- und Lipidtransports. Es kann auch verwendet werden, um den intestinalen Lymphtransport eines beliebigen Faktors von Interesse sowie die Veränderung des Lymphtransports solcher Faktoren als Reaktion auf verschiedene Herausforderungen oder Krankheitszustände zu messen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Kanülierung des Mesenteriallymphgangs durch die Tatsache, dass der Gang klein, zerbrechlich und bei nüchternen Tieren ist, kompliziert und schwierig ist. Transparent Meine Kollegin und Fakultätskollegin hier an der Monash University, Dr. Natalie cus, und ein leitender Postdoc in der Gruppe, Dr. LJ Hugh, werden das Verfahren demonstrieren. Am Tag vor der Operation schneiden Sie die Kanülen auf die entsprechende Länge und verwenden Sie eine sterile chirurgische Klinge, um an der Spitze jedes Schlauchstücks eine Abschrägung zu machen. Um die intraduodenale Kanüle vorzubereiten, legen Sie die Kanüle wieder auf sich selbst und erhitzen Sie dann die Kanüle, um einen Ankerpunkt im Schlauch zu schaffen.

Rasieren Sie am Tag der Operation das Fell von der rechten Seite des Bauches und des Halses sowie der linken Schlüsselbeinregion einer anästhesierten erwachsenen Ratte und reinigen Sie dann die chirurgischen Regionen aseptisch mit drei aufeinanderfolgenden Povidon-Jod-Lösungen und 70%igen Ethanol-Peelings, um den Lymphgang zu kanülieren. Setzen Sie das Tier mit der rechten Seite nach oben auf und öffnen Sie mit einer sterilen Skalpellklinge die oberste Schicht der Bauchmuskelwand mit einem geraden vier Zentimeter langen Schnitt, der sich vom Processus xiphoideus bis zur rechten Flanke erstreckt, etwa zwei Zentimeter unterhalb des Rippenrandes. Ziehen Sie den Dünndarm unter der linken Bauchdecke zurück und verwenden Sie zwei bis drei Stücke sterile Gaze, die mit normaler Kochsalzlösung getränkt ist, um sie an Ort und Stelle zu halten.

Dann überbrücken Sie die Ratte über eine 10-Milliliter-Plastikspritze, die horizontal unter dem Rücken des Tieres auf Höhe der rechten Niere platziert wird. Um die Visualisierung des mesenterialen Lymphgangs zu erleichtern, lokalisieren Sie den oberen mesenterialen Lymphgang mit einem Durchmesser von etwa 0,5 bis einem Millimeter, senkrecht zur rechten Niere und unmittelbar rostral und parallel zur dunkelrot pulsierenden Mesenterialarterie. Beachten Sie, dass bei nicht nüchternen Ratten, wie hier gezeigt, der obere mesenteriale Lymphgang weiß, undurchsichtig und leichter zu visualisieren ist als bei befallenen Ratten.

Anschließend führen Sie eine gerade Pinzette durch das Dammfettbett am unteren Rand der rechten Niere parallel zum Lymphgang mesenterialis superior und durch die Bindegewebsschichten unmittelbar unterhalb der Hohlvene. Ziehen Sie dann mit der Spitze der Pinzette die Lymphkanüle durch das Perren-Fettbett, wobei ein Ende unmittelbar an den mesenterialen Lymphgang angrenzt und das andere vom Tier aus auf Höhe der rechten Niere nach außen gerichtet ist. Isolieren Sie dann mit einem Operationsmikroskop und einer Juwelierzange den mesenterialen Lymphgang durch die darüber liegenden Schichten des Binde- und Fettgewebes durch stumpfe Dissektion, beginnend am unteren Ende, und achten Sie darauf, den Lymphgang nicht zu beschädigen, wenn der Gang isoliert wurde.

Mit der Spitze der Pinzette mit feiner Spitze ein kleines Loch in den Lymphgang bohren. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Lymphkanüle vollständig mit Antikoagulanzien gefüllt ist und keine Luftspalte vorhanden sind, führen Sie die Lymphkanüle mit einer kleinen Pinzette etwa zwei bis vier Millimeter in den mesenterialen Lymphgang über die Punktion ein. Wenn die Kanülierung erfolgreich ist, wird ein allmählicher Fluss der Darmlymphe aus dem frei sammelnden Ende der Kanüle beobachtet.

Geben Sie in diesem Fall einen kleinen Tropfen Cyanacrylatkleber über das Eingangsloch in den Lymphgang, um die Kanüle zu sichern, und achten Sie darauf, das Gefäß nicht mit überschüssigem Klebstoff zu verschließen, um den Zwölffingerdarm zu kanülieren. Lokalisieren Sie zunächst das Gewebe, da der hellrosa Abschnitt des Dünndarms mit einem sanften Abwärtsziehen den Magen sichtbar macht. Verwenden Sie dann eine sterile 23-Gauge-Nadel, um ein kleines Einstichloch in den Zwölffingerdarm an den pylori zu bohren, etwa zwei Zentimeter unterhalb der Verbindung von Magen und Zwölffingerdarm.

Führen Sie dann das js-förmige Hakenende der Zwölffingerdarmkanüle durch die Punktion und befestigen Sie die Kanüle mit einem Tropfen Sano-Acrylatkleber. Verwenden Sie dann Nähte, um den Schnitt der Bauchmuskelwand zu schließen Und die Kanülierung der Halsschlagader kann vor oder nach der Kanülierung des Lymphgangs mesenterica durchgeführt werden. In der Regel ziehen wir es vor, die Halsschlagader vor der Kanülierung des Lymphgangs zu kanülieren, um das Potenzial einer Verschiebung der Lymphkanüle beim Bewegen des Tieres zu verringern Um die Halsschlagader zu kanülieren, markieren Sie zunächst die Kanüle der Halsschlagader 2,5 Zentimeter von der abgeschrägten Spitze entfernt, um den Teil des Schlauchs zu identifizieren, der in die Arterie eingeführt werden soll.

Verbinden Sie dann das nicht abgeschrägte Ende der Kanüle mit einer 25-Gauge-Nadel, die an einer mit Antikoagulanzienlösung gefüllten Spritze befestigt ist, und füllen Sie die Kanüle mit der Lösung, wobei Sie darauf achten, dass keine Luftspalte vorhanden sind. Machen Sie als nächstes einen ein bis 1,5 Zentimeter langen Schnitt durch die Hautschicht über der linken Seite der Luftröhre in der Sagittalebene und verwenden Sie dann eine Zange mit stumpfer Spitze, um das subkutane Bindegewebe zu präparieren und die darunter liegenden paarigen Halsmuskeln freizulegen. Ziehen Sie die Nackenmuskulatur zurück, um die pulsierende linke Halsschlagader freizulegen, die sich etwa einen Zentimeter unter der Hautoberfläche befindet.

Reinigen Sie dann das darüber liegende Bindegewebe durch stumpfe Dissektion von der Arterie und isolieren Sie mit einer stumpfen Gewebezange einen etwa einen Zentimeter großen Abschnitt der Arterie. Als nächstes fädeln Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze zwei Seidennähte unter die Halsschlagader und platzieren Sie sie an jedem Ende des isolierten Arterienabschnitts. Binden Sie dann die Naht ab, die am weitesten vom Herzen und Schlüsselbein der Ratte entfernt ist, und platzieren Sie eine gerade Pinzette mit feiner Spitze unter der Halsschlagader, um den Blutfluss durch die Arterie zu verschließen.

Mache nun mit einer Irisschere mit feiner Spitze einen kleinen Schnitt an der Oberseite der Arterie etwa ein Drittel des oberen Teils des isolierten Bereichs. Führen Sie die Spitze der Kanüle mit einer Pinzette mit gebogener Spitze in die Arterie ein. Entfernen Sie nach dem Einführen die gerade Pinzette mit feiner Spitze, die den Blutfluss blockiert, und schieben Sie die Kanüle mit zwei Pinzettenpaaren 2,5 Zentimeter in die Arterie vor.

Einer, um die Kanüle in der Arterie zu halten, um zu verhindern, dass Blut zurückfließt, und der andere, um die Kanüle einzuführen. Verwenden Sie dann eine kleine Arterienklemme, um die Kanüle in der Arterie zu halten. Injizieren Sie eine gerinnungshemmende Lösung in die Kanüle und ziehen Sie anschließend eine kleine Menge Blut zurück, um die Durchgängigkeit des Schlauchs zu bestätigen.

Spülen Sie dann die Kanüle mit Antikoagulanslösung und verschließen Sie das Ende mit der Flamme eines Feuerzeugs. Zum Schluss binden Sie die Kanüle mit den Nähten fest und entfernen die Arterienklemme. Befestigen Sie dann eine dritte Naht um die Arterie und die Kanüle, verkürzen Sie die Länge der Nähte um die Arterie und schließen Sie die Halswunde nach der Erholungsphase mit weiteren Nähten, injizieren Sie dem Tier über die Zwölffingerdarmkanüle eine interessante Formulierung.

Wie in der Grafik nach Verabreichung des Modells, dem lipophilen Halal-Fanen, dargestellt, lag die mittlere Lymphflussrate bei erfolgreich kanülierten Ratten zwischen 0,4 und 1,3 Millilitern pro Stunde. Bei einigen Tieren war die Lymphflussrate in den ersten ein bis drei Stunden nach der Kanülierung etwas niedriger, bevor sie zunahm, ein häufig beobachtetes Phänomen nach erfolgreicher Lymphkanülierung bei erfolglos kanülierten Ratten. Die Flussrate bleibt jedoch während des gesamten Erfassungszeitraums wesentlich niedriger als in den erfolgreichen Experimenten.

In ähnlicher Weise war in diesen repräsentativen Versuchen der kumulative Lymphtransport von Triglyceriden und halal RIN bei den erfolglos kanülierten Tieren wesentlich geringer. In den erfolgreich kanülierten Gruppen betrug der mittlere kumulative Halalantransport 15,1 % der Dosis und der kumulative Triglyceridtransport 61 Milligramm über 10 Stunden. In diesem repräsentativen Lipidtransportexperiment betrug der Anteil der verabreichten radiomarkierten exogenen Lipiddosis, der in der Lymphe transportiert wurde, 54%Diese Werte unterschieden sich nicht signifikant von den zuvor beobachteten.

Bei einer ähnlichen Formulierung erreicht die Transportrate sowohl von Triglyceriden als auch von Arzneimitteln in die Lymphe ihren Höhepunkt, einige nach der Verabreichung von Lipiden und Arzneimitteln, und kehrt dann zu den Ausgangswerten zurück. Wie es typisch ist und intestinale lymphatische Lipid- und Wirkstofftransportexperimente. Die Geschwindigkeit des Wirkstofftransports in der Lymphe während jedes Zeitraums spiegelt die Szene für den Triglyceridtransport wider, wenn das Medikament in die Lymphe transportiert wird.

In Verbindung mit den triglyceridreichen Lipoproteinen Einmal gemeistert, kann die Kanülierung innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen werden, wenn keine Schwierigkeiten auftreten. Nach diesem Verfahren können die Komponenten in der gesammelten Lymphe isoliert und für zusätzliche Experimente verwendet werden, wie z. B. für die Reinfusion an Empfängertiere, um ihre Funktion, ihren Stoffwechsel, ihre Clearance oder ihre Dispositionsmuster direkt zu bewerten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Techniken zur Isolierung und Kanülierung des mesenterialen Lymphgangs, der Halsschlagader und des Zwölffingerdarms haben.

Mit diesen Techniken sollten Sie in der Lage sein, den Transport von Medikamenten, Lipiden und anderen Faktoren aus dem Darm durch und in die Mesenteriallymphe in Viva zu beurteilen.