Die Analyse der Genexpression Veränderungen im Hippocampus Ratte nach Tiefenhirnstimulation des Anterior Thalamuskern

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Durchführung einer tiefen Hirnstimulation des vorderen Thalamuskerns und die Untersuchung von Veränderungen der Genexpression im Hippocampus der Ratte. Dies wird erreicht, indem das Tier zunächst betäubt wird. Als nächstes wird das Tier auf die Operation vorbereitet.

Es wird ein Schnitt in die Kopfhaut gemacht und der Schädel freigelegt. Dann werden in der richtigen Position relativ zum bgma die Bohrlöcher gemacht. Die DBS-Elektroden werden eingeführt und die Stimulation durchgeführt.

Schließlich wird das Tier eingeschläfert und das Gehirn präpariert. Um den Hippocampus zu entfernen, wird das Gewebe für die RNA-Extraktion aufbereitet und es werden CDNA-Präparation und QPCR durchgeführt. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass die Tiefe Hirnstimulation die Genexpression im Hippocampus der Ratte beeinflusst.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Tiefenhirnstimulation zu beantworten, wie z.B. welche molekularen Mechanismen der therapeutischen Wirkung der Tiefenhirnstimulation zugrunde liegen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich nicht nur auf die Therapie von Epilepsie, sondern auch auf andere neuronale Erkrankungen wie Parkinson, Alzheimer und Dystonie. Da DPS sich als chirurgischer Ansatz zur Behandlung vieler Neuronenerkrankungen entwickelt Um sich auf die Operation vorzubereiten, verwenden Sie chirurgische Pads, um die Werkbank abzudecken und sicherzustellen, dass eine Entsorgung von biologisch gefährlichen Abfällen zur Verfügung steht.

Wiegen Sie die Ratte und berechnen Sie die Anästhesiedosis gemäß dem Textprotokoll, montieren Sie zwei Elektroden auf dem Elektrodenhalter eines stereotaktischen Operationsrahmens und befestigen Sie sie mit einem Mikroskop und überprüfen Sie die Spitzen der Elektrode auf die richtige Ausrichtung. Befestigen Sie die Elektroden im Abstand von drei Millimetern und achten Sie darauf, die Elektrodenspitze nicht auf harten Oberflächen zu berühren. Injizieren Sie das Ketamin-Xylazin.

Mischen Sie intraperitoneal mit dem Tier und bestätigen Sie, dass das Tier eine chirurgische Anästhesieebene erreicht hat, indem Sie den Zehenquetschreflex, die Atemfrequenz sowie die Tiefe und Regelmäßigkeit der Atmung überprüfen. Befestigen und positionieren Sie das Tier auf dem stereotaktischen Rahmen. Tragen Sie Augenschmiermittel auf die Augen des Tieres auf, um sie vor Übertrocknung zu schützen, und desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei abwechselnden Peelings, jeweils mit Betadin und entweder Alkohol oder steriler Kochsalzlösung.

Legen Sie das Tier auf ein zirkulierendes warmes Wasserkissen oder verwenden Sie Heizlampen, um die Körpertemperatur des Tieres auf einem optimalen Niveau zu halten. Basierend auf dem Rattenhirnatlas von Paxos und Watson verwenden Sie die folgenden stereotaktischen Koordinaten, um auf den vorderen Thalamuskern oder einen NT-vorderen hinteren negativen 1,6 Millimeter zu zielen. Medien lateral 1,5 Millimeter und dorso ventral 5,2 Millimeter.

Machen Sie als Nächstes einen Schnitt in der Kopfhaut sagittal, um den Schädel freizulegen. Sichern Sie mit einem Paar Retraktoren die eingeschnittene Kopfhaut, um den Schädel freizulegen. Reinigen Sie dann mit sterilen, in Ethanol getauchten Tupfern den eingeschnittenen Bereich, um die Nähte deutlich freizulegen. Lokalisieren Sie das bgma und verwenden Sie einen schwarzen Marker zum Vermarkten, um die Position der Bohrlöcher zu bestimmen.

Machen Sie zwei weitere Markierungen bei etwa 1,5 Millimetern. Medien beidseits lateral von der sagittalen Naht und 1,6 Millimeter posterior der Koronalnaht. Um nun die beiden Bohrlöcher zu machen, verwenden Sie Ethanol, um die Spitze des Bohrers zu desinfizieren.

Bohren Sie die Bohrlöcher mit einem Bohrer, der in einem Winkel von 45 Grad gehalten wird, und wechseln Sie häufig zwischen den beiden Löchern, um übermäßige Hitze in der Mitte eines der Bohrlöcher zu vermeiden. Bohren Sie weiter, bis die Dura freigelegt ist. Entfernen Sie mit einer Nadel, deren Spitze in Form eines L gebogen ist, alle Knochenbruchstücke, die das Einführen der Elektrode behindern würden.

Achten Sie darauf, dass das darunterliegende Dura- und/oder Hirngewebe nicht beschädigt wird, während Knochenfragmente entfernt werden. Befestigen Sie die Doppelelektrodeneinheit am drehbaren Griff des stereotaktischen Rahmens und fixieren Sie den Griff in einem 90-Grad-Winkel. Positionieren Sie mit den Einstellungen im stereotaktischen Rahmen die linke Elektrode genau über dem bgma.

Verwenden der stereotaktischen Anpassungen für Medien. Durch die laterale Positionierung wurde die linke Elektrode präzise um 1,5 Millimeter zur linken Seite der bgma verschoben, so dass nun zwei Elektroden perfekt entlang der koronalen Naht ausgerichtet sind, aber mit Abstand voneinander angeordnet sind. 1,5 Millimeter Medium seitlich vom BGMA.

Bewegen Sie dann mit den stereotaktischen Anpassungen am vorderen hinteren Stellen die Elektroden 1,6 Millimeter nach hinten zur Koronalnaht. Senken Sie dann mit den dorsalen ventralen Anpassungen die Elektroden ab, um zunächst zu überprüfen, ob die Bohrlöcher an der richtigen Stelle angebracht wurden, so dass die Elektroden leicht eingeführt werden können, ohne die rauen Kanten der Bohrlöcher zu berühren. Wenn ja, führen Sie die Elektroden in einer Tiefe von 5,2 Millimetern von der Schädeloberfläche ein.

Verbinden Sie die Elektroden über Kabel mit einem Stimulator, der auf 130 Hertz, 2,5 Volt und 90 Mikrosekunden Pulsbreite eingestellt ist. Liefern Sie eine hochfrequente Stimulation für einen gewünschten Zeitraum. Durchführung einer einseitigen oder bilateralen Stimulation.

Nachdem die Stimulation abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig die Elektroden und nähen Sie mit drei Nullnähten oder sterilen chirurgischen Klammern den Schnitt, verabreichen Sie Buprenorphin subkutan und überwachen Sie das Tier, bis es wieder normal aktiv ist, und bringen Sie es dann in die Haltungseinrichtung zurück. Legen Sie das Gehirn mit einer Rasierklinge auf eine vorgekühlte Acryl-Gehirnmatrix auf Eis. Schneiden Sie die Hirnkorly etwa sieben bis acht Millimeter vom vordersten Rand des Gehirns entfernt.

Machen Sie einen zweiten Schnitt Corly und hinter dem ersten Schnitt, so dass eine etwa fünf Millimeter dicke Hirnscheibe entfernt werden kann. Übertragen Sie die Gehirnscheibe mit einer Rasierklinge mit eiskaltem PBS in eine Petrischale, trennen Sie die beiden halbkugelförmigen Abschnitte und achten Sie darauf, welcher Abschnitt der linken bzw. rechten Seite entspricht. Mit einer feinen Pinzette und einer Schere den Hippocampus-Blitz vorsichtig entfernen, das Gewebe auf Trockeneis einfrieren und bei minus 20 Grad Celsius lagern, bis es für die nachfolgenden RNA-Schritte bereit ist, die gemäß dem Textprotokoll durchgeführt werden: Hier sind die relativen Expressionsniveaus von BDNF im Vergleich zum Kontrollgen Beta-Aktin über die angegebenen Zeitpunkte dargestellt.

Stimulation nach der DBS. Die BDNF-Hochregulation wird unmittelbar nach der THS-Operation beobachtet, zusammen mit der Spitzenexpression drei Stunden nach der Stimulation. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass eine erhöhte BDNF-Expression und die daraus resultierende Neuroprotektion zum therapeutischen Nutzen der THS für epileptische Patienten beitragen könnten.

Dieses Panel veranschaulicht die Expression des GABA-Rezeptors G-A-B-R-D, der bei den stimulierten Tieren drei Stunden nach der DBS eine erhöhte Expression im Vergleich zu unstimulierten Kontrollen zeigt. In Anbetracht der Tatsache, dass GABA-Agonisten als wirksame Anfallssuppressoren eingesetzt werden, ist es interessant, eine erhöhte G-A-B-R-D-Expression nach der THS zu beobachten, was auf eine mögliche Rolle von GABA und die antiepileptische Wirkung der THS hindeutet. Befolgen Sie dieses Verfahren.

Andere Methoden wie Western Block, Chromatin-Immunpräzipitation und viele andere molekularbiologische Standardassays können durchgeführt werden. Dies hilft bei der Beantwortung von Fragen zu Veränderungen in der Proteinexpression, posttranslationalen Modifikationen, der Belegung von Transkriptionsfaktoren auf spezifischen Genpromotorregionen usw. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine tiefe Hirnstimulation bei Ratten durchführt.

Isolieren Sie das Hippocampusgewebe und analysieren Sie es auf Veränderungen der Genexpression.