Generierung eines dreidimensionalen Sphäroidmodells der Tumorzellinvasion

Nehmen Sie eine Kultur von menschlichen Hirntumorzellen.

Behandeln Sie mit einem Dissoziationsenzym, um Zellverbindungen zu stören und aggregierte Zellen zu trennen.

Wasche mit einem Puffer, um die Enzymaktivität zu stoppen, und füge dann ein Kulturmedium hinzu, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

Führe Methylcellulose ein, ein Suspensionsmittel.

Übertragen Sie die Suspension in eine Mikroplatte mit rundem Boden und inkubieren Sie.

Die viskose Methylcellulose hält die Zellen in der Schwebe und fördert Zell-Zell-Interaktionen für die Aggregation zu Sphäroiden.

Mische die Sphäroide mit einer Kollagenmatrix, die die physiologische extrazelluläre Umgebung nachahmt.

Übertragen Sie die Suspension in eine Mikroplatte und inkubieren Sie, damit die Matrix ein Gel bilden kann, das die Sphäroide einschließt.

Füge das Wachstumsmedium auf das Gel hinzu.

An der sphäroiden Peripherie verlieren Tumorzellen die Zell-Zell-Adhäsion und nehmen einen invasiven Phänotyp an.

Diese Zellen sezernieren Proteasen, um die Matrix abzubauen, Vorsprünge zu erweitern, um sich zu verankern, und bewegen sich vorwärts, indem sie in die Matrix eindringen.

Das Sphäroidmodell, das eine Tumorinvasion zeigt, ist bereit für die Analyse.

Um Tumor-Sphäroide einheitlich zu erzeugen, waschen Sie zunächst die interessierende Tumorzellkultur mit 5 Millilitern PBS und behandeln Sie die Zellen mit 0,5 bis 1 Milliliter Dissoziationsenzym. Nach 5 Minuten bei 37 Grad Celsius stoppen Sie die Reaktion mit 4 bis 4,5 Millilitern PBS und überführen Sie die abgelösten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das 10 Milliliter vollständiges Wachstumsmedium enthält.

Nach dem Zählen resuspendieren Sie die Zellen bei 1 mal 10 zu den 6 Zellen pro 8 Milliliter vollständigem Wachstumsmedium, ergänzt mit 2 Millilitern einer Methylcellulosekonzentration von 2 %, und überführen die Suspension in einen sterilen Systembehälter. Geben Sie dann 100 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und legen Sie die Platte für drei bis vier Tage in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.

Um einen Invasionsassay durchzuführen, wird jede Zellstruktur, wenn die Tumorzellen gleichmäßig große Sphäroide gebildet haben, in ein 500-Mikroliter-Röhrchen überführt und die Sphäroide einmal mit 200 Mikrolitern PBS gewaschen. Übertragen Sie die Sphäroide nach dem zweiten Waschen vorsichtig in 100 Mikroliter frisch zubereitete Kollagenmatrix und geben Sie jede Sphäroidsuspension in die Mitte jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden.

Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius gibst Du 100 Mikroliter vollständiges Wachstumsmedium auf das Gel in jeder Vertiefung

Stellen Sie sicher, dass Sie alle Sphäroide in der Mitte jedes Wells platzieren, um die beste Abbildung der Tumorzellinvasion zu erhalten.