Darstellende Permanent Distal cerebri mit Arteria carotis communis Occlusion bei alten Ratten zu studieren kortikale Ischämie mit anhaltenden Behinderungs

Hier präsentieren wir ein Protokoll permanent distalen mittleren Hirnarterie bei älteren weiblichen Ratten bei gleichzeitiger Verschluss der Halsschlagadern zu produzieren große kortikale Infarkte und anhaltende Defizite zu erzeugen. Wir zeigen die Bestätigung der Größe der Läsion mit strukturellen MRT bei 24 Stunden und 8 Wochen nach dem Schlaganfall.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen dauerhaften Verschluss der mittleren Hirnarterie oder MCA in einem älteren Rattenmodell durchzuführen. Dies wird erreicht, indem die Halsschlagadern für eine spätere Ligatur zunächst freigelegt und locker geschlungen werden. Im zweiten Schritt wird der Schädel gebohrt, um das MCA freizulegen.

Anschließend wird das Gefäß mit einer Pinzette koaguliert, um den Verschluss einzuleiten. Im letzten Schritt wird die rechte Halsschlagader dauerhaft abgebunden und die linke Halsschlagader vorübergehend verschlossen. Letztendlich wird die T2-gewichtete Magnetresonanztomographie verwendet, um die Größe der Läsion zu beobachten und den Erfolg des Eingriffs zu bestätigen.

Dieses Modell ermöglicht reproduzierbare Infarkte im Bereich der mittleren Hirnarterie und anhaltende Verhaltensdefizite bei älteren Ratten. Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, bestätigen Sie das richtige Maß an Sedierung durch ein fehlendes Ansprechen auf das Einklemmen der Zehen bei einer 16 bis 18 Monate alten älteren weiblichen Lister-Kapuzenratte und verabreichen Sie das geeignete Analgetikum. Rasieren Sie anschließend das Fell am ventralen Hals und in den Schläfenregionen der rechten Hemisphäre des Tieres und verwenden Sie Ethanoltupfer, um die exponierte Haut zu desinfizieren.

Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf eine Korkplatte, die mit einem sterilen Tuch auf einem Heizkissen bedeckt ist, und tragen Sie Lidocaincreme auf die rasierten Bereiche von Kopf und Hals auf. Führen Sie eine rektale Sonde ein, um die Körpertemperatur zwischen 36,5 und 37,5 Grad Celsius zu halten, und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf. Injizieren Sie dann der Ratte 0,05 Milliliter Atropinsulfat, um die Trachealsekrete zu reduzieren, und legen Sie das Tier unter ein Stereomikroskop.

Beginnen Sie den chirurgischen Eingriff mit einem zwei Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie in den freiliegenden Hals und bewegen Sie die Speicheldrüsen sanft seitlich zur Luftröhre auf beiden Seiten des Tieres. Schlingen Sie dann auf der rechten Seite des Halses eine nicht resorbierbare Seidennaht 5-0 durch die Haut, die über dem freiliegenden Bereich liegt, und ziehen Sie die Haut mit den Nähten vorsichtig vom Schnitt weg. Befestigen Sie die Nähte mit chirurgischem Klebeband an der Korkplatte, um die Arteria carotis communis freizulegen.

Präparieren Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig die Arterie von der umgebenden Faszie. Sobald die Arteria carotis communis freigelegt ist, verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Arterie vom Vagusnerv zurückzudisparieren, und achten Sie darauf, dass Sie nicht mit dem Nerv in Berührung kommen. Schlingen Sie das Gefäß mit einer nicht resorbierbaren Naht und kleben Sie die Enden der Naht mit chirurgischem Klebeband zusammen.

Entfernen Sie dann die Nähte, die die darüber liegende Haut zurückhalten, und stellen Sie sicher, dass die Naht, die um die Halsschlagader geschlungen ist, nicht beeinträchtigt wird. Wiederholen Sie den Vorgang auf der linken Seite wie gerade gezeigt. Nachdem beide Arterien geschlungen und die zusätzlichen Nähte entfernt wurden, legen Sie eine sterile, mit Kochsalzlösung getränkte Gaze in die Wunde, um das Gewebe feucht zu halten, und nähen Sie die Haut locker.

Legen Sie eine weitere mit Kochsalzlösung getränkte Gaze über den Bereich, um eine weitere Austrocknung zu verhindern, und bringen Sie die Ratte in eine seitliche Position. Schneiden Sie die Haut in der Mitte zwischen der rechten Augenhöhle und dem äußeren Gehörgang ein. Als nächstes präparieren Sie den Schläfenmuskel, um den Schädel freizulegen.

Ziehen Sie dann mit bis zu fünf elastischen Drei-Millimeter-Hakenhaken die Haut ein und befestigen Sie sie an der Korkplatte. Platzieren Sie dann einen mit dem Daumenrad eingestellten, durch Schwerkraft angetriebenen Kochsalztropfen über der offenen Stelle am höchsten Punkt des Schädels in der Nähe des Ohrs und richten Sie ein Absaugsystem mit der Düse an der tiefsten Stelle ein, um Knochentrümmer zu entfernen und kleinere Blutungen an der freiliegenden Stelle zu entfernen. Stellen Sie das Rad ein, um die Blutungsquelle bei Bedarf zu visualisieren.

Verwenden Sie nun einen Dentalbohrer mit einem groben, 1,6 Millimeter dicken, diamantbeschichteten Bohrgrat bei etwa 8.000 U/min, um eine fünf Millimeter mal fünf Millimeter große Kraniotomie an der freiliegenden Stelle durchzuführen, wobei darauf zu achten ist, dass während des Bohrens kreisförmiger und seitlicher, aber kein Abwärtsdruck ausgeübt wird. Wenn es vollständig durchsichtig ist, verwenden Sie eine Pinzette, um den Knochen zu entfernen. Öffnen Sie dann mit einem selbstgemachten Duralhaken vorsichtig die Dura und achten Sie darauf, dass die großen oberflächlichen Blutgefäße nicht reißen.

Verwenden Sie als Nächstes eine abgewinkelte Juwelier-Diathermiezange mit 0,25 Millimeter spitzen Spitzen, um die MCA von der Stelle, an der sich die Vena cerebral inferior kreuzt, bis zum Punkt der Arteriengabelung und dann entlang des kaudalen Astes der MCA zu koagulieren, bis die Gefäße vollständig verschlossen sind. Um zu bestätigen, dass der Verschluss abgeschlossen ist, schneiden Sie dann mit einer mikrovaskulären Schere den Abschnitt des verschlossenen MCA ab, der unter der Stelle liegt, an der die untere Hirnvene die MCA kreuzt. Decken Sie nun die freiliegende Stelle mit einem mit Kochsalzlösung getränkten Mullkissen ab und bringen Sie die Ratte wieder in die Rückenlage.

Öffnen Sie die lose gebundene Naht am Hals wieder, um die Halsschlagadern wieder freizulegen, und binden Sie einen Knoten in die Naht um die Arterie auf der gleichen Seite wie die verschlossene MCA, um das Gefäß dauerhaft zu ligatisieren. Verwenden Sie dann einen 13 Millimeter großen Arterienclip aus Edelstahl mit einem Druck von etwa 125 Gramm, um die linke Halsschlagader eine Stunde lang vorübergehend zu ligieren. Während der temporären Okklusion nähen Sie den Schnitt im Hals locker zu und legen Sie eine weitere sterile, mit Kochsalzlösung getränkte Gaze über den Schnitt.

Als nächstes nähen Sie den Schnitt im Schläfenbereich, gefolgt von vier subkutanen Injektionen von Kochsalzlösung mit fünf Millilitern. Entfernen Sie am Ende der temporären Okklusionsphase den Clip und tragen Sie Kochsalzlösung topisch auf den umgebenden Muskel auf. Schließen Sie dann mit subkutanen Endlosnähten aus resorbierbaren 4-0-Nähten den Schnitt im Hals und lassen Sie das Tier sich vier Stunden lang in einem 31 Grad Celsius heißen Inkubator von der Narkose erholen.

Wenn eine Ratte nach der Operation einen Gewichtsverlust aufweist, untersuchen Sie die oberen und unteren Zähne. Platzieren Sie dann, während sich das Tier in Rückenlage befindet, einen Spritzenzylinder von einem Millimeter hinter den Zähnen, um die Weichteile zu schützen, und verwenden Sie eine Handkreissäge mit hoher Drehzahl und langsamen, festen Handbewegungen, um die Zähne des Tieres zu schneiden. Zur Messung des Infarktvolumens wird 24 Stunden nach der Einleitung des Verschlusses der mittleren Hirnarterie eine strukturelle MRT verwendet, um T2-gewichtete Scans zu erhalten.

Messen Sie dann die Querschnittsfläche des Infarkts in 20 Volumina, um das Läsionsvolumen in einem medizinischen Bildanzeigepaket zu erhalten, und multiplizieren Sie die Summe dieser Bereiche mit der Dicke, um das Gesamtvolumen des Infarkts zu erhalten. Für die Berechnung des prozentualen Läsionsvolumens erfassen Sie auch die Volumina der ipsilesionalen und kontraläsionalen Hemisphären. Um die Stichprobengröße für zukünftige Studien zu berechnen, verwenden Sie eine Power-Analyse-Software, um die Stichprobengrößenberechnungen für die Schätzung der Gruppengrößen zu bestimmen, die erforderlich sind, um die Behandlungseffekte unterschiedlicher Größenordnungen zu identifizieren.

In diesem Experiment wurde das Schlaganfallergebnis 24 Stunden und acht Wochen nach dem gerade gezeigten MCA-Verschluss bewertet, wobei das Infarktvolumen als die Bereiche des Rattengehirns identifiziert wurde, die ein hyperintensives Signal zeigten. In diesem repräsentativen Experiment betrug das rohe, unangepasste Läsionsvolumen nach 24 Stunden 62,8 Millimeter gewürfelt, wobei die Läsion 9,8 Prozent der betroffenen Hemisphäre einnahm. Bei der Korrektur der Hirnschwellung mit der Gerriets-Formel reduzierte sich dieser Wert auf 4,5 Prozent.

Die Schwere des Schlaganfalls wurde ebenfalls mit dem Montoya-Treppentest gemessen, wobei bei den Tieren mit MCA-Okklusionsschlaganfällen eine etwa 40-prozentige Verringerung der Zuckerpellet-Entnahme beobachtet wurde. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Vagusnerven sorgfältig zu präparieren, wenn Sie die Halsschlagadern für die Ligatur manipulieren, da eine Schädigung dieser Nerven die Genesung des Tieres negativ beeinflussen kann. Nach diesem Verfahren können Behandlungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie sich Neuroprotektion auf die Größe des Infarkts auswirken kann und welche Behandlungen das Ergebnis nach einem Schlaganfall verbessern können.