Livraison des protéines, des peptides ou imperméable aux cellules petites molécules dans des cellules vivantes par incubation avec le réactif dfTAT endosomolytique

L’objectif global de l’expérience suivante est d’administrer des macromolécules dans des cellules vivantes à l’aide d’un dimère, d’un tat fluorescent ou d’un df tat, un réactif capable de pénétrer très efficacement dans les cellules sans les endommager. Ceci est réalisé en générant et en purifiant d’abord l’agent de livraison. Dfta comme deuxième étape.

Dfta est incubé avec des cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius en présence de la cargaison de macromolécules d’intérêt, df tat induit l’absorption de la cargaison à l’intérieur des vésicules endocytaires. Les vésicules se transforment en endosomes précoces, atteignant finalement le stade tardif de l’endosome où DF tat est capable de libérer la cargaison dans l’espace cytosolique des cellules. Ensuite, les cellules sont imagées par microscopie à fluorescence afin d’évaluer l’efficacité de livraison de la detta et de la cargaison d’intérêt.

Les résultats montrent que la DF TT peut pénétrer dans les cellules avec une efficacité élevée et aucune cytotoxicité observable. La DF tat peut délivrer des macromolécules de différentes tailles dans l’espace cytosolique des cellules, comme on peut l’observer par microscopie à fluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux approches d’administration solides existantes est que notre agent d’administration a une efficacité d’administration élevée sans impact négatif observable sur la physiologie cellulaire. De plus, il est facile à utiliser car il ne nécessite qu’une simple étape de co-incubation.

Pour commencer, la synthèse FTA gonfle 500 milligrammes de Ramide, de résine MBHA et de diméthylformamide ou DMF dans un récipient SPPS standard de 50 millilitres pendant une heure pour effectuer la réaction à température ambiante en utilisant juste assez d’azote gazeux pour faire bouillonner la réaction. Synthétisez FTA sur la résine MBHA amide de patinoire en utilisant 1,2 millimole de chaque acide aminé protégé FM répertorié dans le protocole de texte pour chaque réaction de couplage d’acides aminés. Ajoutez également le point 44 grammes de HBTU et le point 51 millilitres de DIEA dissous dans le DMF pour effectuer chaque réaction de couplage d’acides aminés pendant quatre heures après le couplage de quatre heures.

Lavez la résine avec du DMF et effectuez l’étape de protection FD comme décrit dans le protocole texte. Répétez l’opération jusqu’à ce que la chaîne peptidique linéaire de FTA soit synthétisée. Ensuite, Lubrifiez le groupe protecteur MTT en incubant la résine avec 20 millilitres d’une solution composée de 1 % d’acide tri-fluoracétique ou TFA et de 2 % de tri-isopropylique ou TIS dans du DCM pendant cinq minutes.

Comme l’élimination du groupe protecteur MTT entraînerait l’apparition d’une couleur jaune. Répétez cette opération jusqu’à ce qu’aucune couleur jaune n’apparaisse en lavant la résine avec du DCM et du DMF entre les deux. Ajoutez une solution supplémentaire avec 1 % de TFA dans DCM à la résine pour vous assurer qu’aucun MTT n’est éliminé et que la solution reste claire.

Ensuite, dissolvez T-M-R-H-B-T-u et DIEA dans du DMF et ajoutez ce mélange à la résine. Effectuer la réaction pendant la nuit en utilisant de l’azote sec pour assurer l’agitation après la protection contre la fm d et la conjugaison des acides aminés. Lavez la résine avec du DCM et laissez-la sécher pour un clivage complet du peptide de la résine.

Ajoutez une solution contenant 92,5 % de TFA, 2,5 % d’eau, 2,5 % de TIS et 2,5 % d’éthane di thiol à la résine peptidylique pendant trois heures à température ambiante pour obtenir une protection globale en profondeur et un clivage de la résine. Précipiter les produits peptidiques bruts à l’aide d’éther éthylique anhydre froid en égouttant la solution préparée dans 40 millilitres d’éther de l’eyl. Faites-le tourner à quatre degrés Celsius et 4 000 G pendant 20 à 25 minutes.

Répétez cette étape pour permettre le lavage du précipité avec de l’éther éthylique anhydre froid. Mettre en suspension les précipités dans l’eau et lyophiliser puis remettre en suspension les produits obtenus dans l’essai aqueux TFA ACEDONITE à 0,1 %. Effectuez une analyse par chromatographie liquide ou HPLC haute performance avec une colonne analytique C 18.

Pour analyser chaque peptide, utilisez un débit d’un millilitre par minute et une détection à 214 nanomètres et 550 nanomètres. Ensuite, effectuez une HPLC semi-préparative sur une colonne C 18 pour la purification des peptides. Utiliser un débit de quatre millilitres par minute et une détection à 214 nanomètres et 550 nanomètres pour toutes les séries.

Utilisez des gradients linéaires avant d’effectuer la réaction d’oxydation. Confirmez l’identité correcte des peptides par MALDI conformément au protocole du fabricant. Dissoudre le FTA dans une solution saline aérée tamponnée au phosphate.

Assurez-vous que le pH est compris entre 7,0 et 7,5. Après l’ajout du peptide, faites muter la réaction pendant la nuit pour lui permettre de réagir jusqu’à la fin. Purifier le produit à l’aide d’une HPLC en phase inverse et l’analyser par spectrométrie de masse comme précédemment, lyophiliser le DF pur, le tat et le réhydrater en suspension dans 200 microlitres d’eau pour mesurer la concentration.

Tout d’abord, Resus met en suspension une aliquote du DF tat purifié dans 149 microlitres de solution de TCEP de 50 millimolaires, ce qui permet à l’échantillon de réagir pendant environ 20 minutes. Au cours de cette étape, le DF tat est réduit à son homologue monomère F tat afin d’éliminer l’extinction de l’absorbance qui se produit en raison de la proximité du quatrième étage de la RTM et du DF tat. Ajoutez toutes les solutions à un CVE de quartz et mesurez l’absorbance à 556 nanomètres.

Utilisation de la loi de la bière. Déterminez la concentration de la solution. Cela correspond à la concentration de fta.

Divisez la concentration de l’ALE par deux pour obtenir la concentration de l’AFC. Cultivez les cellules dans un milieu approprié jusqu’à ce qu’elles atteignent une fluidité de 80 à 90 % dans une atmosphère humidifiée à 37 degrés Celsius contenant 5 % de CO2, lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS et une fois avec du NRL 15. Incuber les cellules avec cinq micromolaires df tat avec ou sans cargaison, comme une protéine fluorescente verte améliorée et maintenir à 37 degrés Celsius pendant une heure pour induire une fuite endosomale après l’incubation.

Lavez les cellules trois fois avec de l’héparine dans un milieu L 15 pour éliminer le DF lié à la membrane plasmique des cellules. Comme image de dernière étape, les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence imagent DF tat à l’aide d’une protéine fluorescente rouge ou d’un filtre RFP pour évaluer la différence entre F TAT et D ftt. Les cellules heela sont incubées avec chaque peptide pour déterminer la différence dans leur localisation cellulaire.

Comme illustré ici, FTA localise dans une distribution ponctuée. Cette distribution est cohérente avec le fait que le peptide reste piégé à l’intérieur des endosomes. En revanche, le signal fluorescent de dfta présente une distribution homogène dans tout le cytosol et le noyau.

La distribution cytosolique de DF tat est observée dans un certain nombre de lignées cellulaires différentes. Les images 20 x montrent qu’un pourcentage très élevé dans une boîte présente une distribution cytosolique de DF tat sans toxicité cellulaire comme le montre l’absence de coloration nucléaire au bleu de cyt pour déterminer si la fuite endosomale médiée par DFTA délivre de grandes protéines dans le cytosol des cellules. L’EGFP a été utilisé pour détecter l’administration de protéines correctement repliées.

L’EGFP a montré une distribution cytosolique et fluorescente vert nucléaire, similaire à ce qui est observé pour le DF tat dans plus de 90 % des cellules sans toxicité observable. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les cellules ne doivent pas être trop confluentes. De plus, les cellules doivent être soigneusement lavées pour éliminer le FPS avant d’ajouter le robinet df.