Détection de détergent-sensibles aux Interactions entre les protéines membranaires

Les auteurs décrivent un protocole pour la détection de détergent sensible des interactions entre les protéines de la membrane à l’aide de liaison du récepteur tri, SORTILINE, pour la première boucle luminale de la protéine de transport du glucose, GLUT4, à titre d’exemple.

L’objectif général de cette procédure est de détecter les interactions sensibles aux détergents entre les protéines membranaires ou d’autres protéines. Cette procédure nécessite qu’une protéine soit marquée à l’histidine et surexprimée dans les cellules, tandis que l’autre est un peptide marqué au myc. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la biochimie d’importantes études d’interaction protéique.

Le principal avantage de cette technique est la capacité de détecter l’interaction entre les protéines membranaires d’une manière sensible aux détergents. La procédure est rapide et facile. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des interactions entre les protéines membranaires, elle peut également être utilisée pour étudier les interactions entre les protéines faibles.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons voulu vérifier l’interaction entre les protéines membranaires, Saltilin et GLUT4, mais les tentatives de co-immunoprécipitation à partir de la lyse des mammifères restent infructueuses. Pour passer une commande pour le peptide, sélectionnez la séquence cible du peptide critique pour l’interaction et ajoutez un épitope myc à l’extrémité ou à l’extrémité C de la séquence. Une fois que le peptide est arrivé, appliquez 100 microgrammes par millilitre de solution de travail du peptide dans de l’eau ultra pure.

Ensemencez trois cellules pré-adipocytaires 3T3-L1 dans quatre boîtes de culture de 10 centimètres et conservez-les dans l’incubateur. Ensuite, transfectez deux boîtes de culture avec la protéine cible marquée avec l’histodyne 6X et étiquetez-la comme HISP dans les deux autres boîtes avec deux plasmides de contrôle et étiquetez-la comme WT. Après la transfection, laissez les cellules dans l’incubateur pendant 48 heures pour atteindre 80 à 90 % de confluence. Pour préparer le lysat cellulaire, lavez les cellules sur de la glace trois fois avec 10 millilitres de solution saline tamponnée 1X refroidie à quatre degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse à chacun d’eux. Ensuite, détachez les cellules des plats à l’aide d’un grattoir cellulaire pour préparer le lysat. Transférez le lysat cellulaire préparé à partir de chaque boîte de culture dans quatre tubes séparés de 1,5 millimètre et étiquetez tous les tubes.

Ensuite, passez le lysat cellulaire dans une seringue avec une aiguille de calibre 26 de haut en bas cinq fois pour une lyse cellulaire totale. Ensuite, centrifugez les lysats cellulaires à 16000xg pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez les surnageants dans quatre nouveaux tubes étiquetés de manière identique.

Pour de futures expériences de dépannage et de contrôle, aliquote 20 microlitres de lysat cellulaire et stockez-le à 20 degrés Celsius. Pour une utilisation ultérieure, titrez le tampon de lavage à PH8 avec de l’acide chlorhydrique pour obtenir PH6 et stockez le tampon à quatre degrés Celsius. Ensuite, pour préparer une suspension homogène des billes de cobalt, faites tourner soigneusement la bouteille.

Ensuite, transférez 40 microlitres de suspension de billes de cobalt dans les quatre tubes marqués individuellement. Après avoir ajouté les billes de cobalt, ajoutez un millilitre de tampon de lyse dans les tubes. Ensuite, centrifugez les tubes à 1000xg pendant cinq secondes.

Jeter le surnageant et pipeter 40 microlitres de tampon de lyse sur les billes décantées. Ensuite, transférez le lysat cellulaire dans les tubes correspondants et incubez à quatre degrés Celsius pendant 90 minutes sur un rotateur de tube. Après 90 minutes, centrifugez les échantillons à 1000xg pendant cinq secondes.

Ensuite, récupérez le surnageant étiqueté Flowthrough-1 et stockez-le à 20 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage avec PH8 dans les tubes individuels et remettez doucement les billes en suspension. Centrifugez les tubes à 1000xg pendant cinq secondes et expulsez les surnageants.

Ensuite, ajoutez un tampon de lavage avec du PH8 avec ou six dans les tubes, selon les étiquettes et remettez bien les billes en suspension. Centrifugez les tubes à 1000xg pendant cinq secondes et expulsez les surnageants. Préparez une solution de travail d’un microgramme par millilitre de peptide et de tampon d’eau avec PH6 ou huit.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de la solution peptidique aux billes lavées correspondant à un PH similaire. Ensuite, incubez les billes à quatre degrés Celsius sur un rotateur de tube pendant 30 minutes. Ensuite, prenez quatre microcolonnes, étiquetez-les et placez-les dans des tubes de collecte étiquetés Flowthrough-2. Une fois l’incubation terminée, ajoutez le mélange d’incubation dans les colonnes.

Laissez passer la solution par la force gravitationnelle et prélevez l’échantillon de l’écoulement. Placez les colonnes dans de nouveaux tubes de collecte et stockez-les à 20 degrés Celsius. Ensuite, passez 500 microlitres de tampon de lavage avec PH6 ou huit par écoulement gravitationnel à travers les colonnes individuelles et jetez le flux.

Répétez cette étape quatre fois. Centrifugez les tubes à 1000xg pendant cinq secondes. Placez la colonne dans le nouveau tube de collecte étiqueté Elution.

Il est important de laver les billes dans tous les tubes très soigneusement et également pour se débarrasser du peptide non lié. Aux billes lavées, ajoutez 40 microlitres de tampon d’échantillon de tricine avec du bêta-mercaptoéthanol. Laissez reposer 20 minutes à température ambiante.

Centrifugez la colonne à 8000xg pendant deux minutes. Jetez les colonnes et chauffez les tubes collecteurs à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Et ensuite, centrifugez-le à 1000xg pendant cinq secondes.

Vous pouvez également ajouter 40 microlitres de tampon Elution Imidazole aux billes lavées et incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Une fois l’incubation terminée, centrifugez les tubes à 8000xg pendant deux minutes. Jetez les colonnes et ajoutez un échantillon de tricine de 40 microlitres.

Chauffez les tubes collecteurs à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis centrifugez-les à 1000xg pendant cinq secondes. Utilisez les gels à gradient de tricine 10-20 % disponibles dans le commerce. Utilisez le tampon de fonctionnement Tris/Tricine/SDS, puis chargez 20 microlitres chacun des échantillons élués et des lysats totaux sur le gel et commencez à faire fonctionner l’unité d’électrophorèse.

Une fois l’électrophorèse terminée, utilisez un tampon de transfert complété par 20 % de méthanol pour transférer le matériau du gel sur une membrane de nitrocellulose de 0,45 micromètre. Après avoir bloqué la membrane, coupez-la horizontalement. Ensuite, sondez la partie supérieure de la membrane avec l’anticorps Anti His P dans la moitié inférieure de la membrane avec l’anti myc.

Pour étudier l’interaction entre la Sortiline immobilisée et les billes de cobalt dans GLUT4, une analyse par immunotransfert a été effectuée. Les lysats et les éluats cellulaires ont été obtenus de type sauvage et de cellules 3T3-L1 transfectées marquées Sortilin-myc/His, puis chargées sur la page SDS. Le transfert a été sondé avec un anticorps anti-myc.

Le transfert montre une boucle luminale GLUT4 de 110 kilodotines marquées Sortili-myc/His et de cinq kilodotines myc-first luminal loop-GLUT4 à partir des éluats transfectés. Ensuite, pour étudier l’importance du PH et l’interaction entre la Sortiline immobilisée sur les billes de cobalt et le GLUT4, une analyse immunoblot a été effectuée. Dans ce test, la première boucle luminale de Myc, GLUT4, a été incubée avec des billes immobilisées avec des protéines marquées Sortilin-myc/His, à la fois à PH6 et à huit.

Le blot montre une interaction claire entre Sortilin-myc/His et la boucle luminale myc-first GLUT4 à PH6 et huit à partir des éluats obtenus à partir des cellules transfectées 3T3-L1 marquées Sortilin-myc/His. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures jusqu’à ce que les échantillons soient prêts pour l’analyse sanguine occidentale. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de concevoir un peptide soluble, de préférence dans l’eau.

Pour renforcer vos résultats, d’autres méthodes comme l’immunoprécipitation suite à la réticulation peuvent être effectuées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter les interactions entre les protéines membranaires et les protéines dans une procédure sensible aux détergents. Il permet également d’explorer l’interaction entre les fragments de protéines.

Jazz doux et rythmé.