Ingénierie cellulaire perméable protéines

La manipulation de la fonction cellulaire peut être réalisée par les approches classiques de la transfection de l’ADN ou de la transduction virale au cours des 15 dernières années. Une autre méthode a évolué. La protéine active biologique de transduction des protéines peut être directement délivrée dans les cellules de mammifères à l’aide de petits peptides fusionnés à la protéine d’intérêt, ce qui favorise l’absorption cellulaire.

Comme aucun ADN n’est utilisé, le risque d’agénésie à l’effort est évité. Contrairement aux méthodes classiques mentionnées ci-dessus. La transduction des protéines permet l’administration de protéines de manière titubable.

De plus, les petites populations cellulaires ainsi que les cellules non divisées, telles que les neurones post-mitotiques, peuvent être modulées. Pour exprimer la protéine recombinante de manière efficace, nous recommandons l’utilisation du système vectoriel Paciz. Il s’agit d’un système vectoriel modulaire composé d’une borne d’extrémité et d’une variante de borne C.

Les deux vecteurs permettent l’insertion facile de votre gène d’intérêt pour les moyens de purification. Un marqueur d’histidine est intégré ainsi qu’un domaine de transduction de protéines. Dans notre cas, le toucher du virus HI favorise l’absorption cellulaire pour la distribution cellulaire.

Un signal de localisation nucléaire complète le vecteur pour des raisons de contrôle : les étiquettes de fusion peuvent simplement être retirées. En outre, la disposition de ces étiquettes peut avoir une influence majeure sur les propriétés des protéines de fusion. L’influence sur le rendement et la pureté ainsi que sur la vendabilité et la fonction biologique n’est pas prévisible.

Bonjour, je m’appelle Bernard Mus et je travaille dans le groupe d’ingénierie des cellules souches de l’Institut de neurobiologie reconstructive de Bond, en Allemagne. Bonjour, je m’appelle Christoph P et je suis également membre du Hoover Lab. Notre groupe de travail exploite intensivement la technique de transduction des protéines pour délivrer directement des protéines biologiques actives dans diverses cellules de mammifères, et aujourd’hui, nous voulons vous guider à travers le processus d’expression et de purification dans et à partir d’E coli.

Par la suite, nous aimerions vous montrer comment appliquer la protéine de fusion permanente cellulaire dans la culture cellulaire pour illustrer l’ensemble de la procédure d’expression, de purification et d’application. Nous utilisons la recombinaison spécifique du site Cree pour modifier génétiquement les cellules souches oniques de souris. D’accord. Commençons.

Pour inoculer la culture de nuit, nous utilisons des bactéries déjà transformées stockées dans un stock de glycérol à moins 80 degrés centigrades. Ces bactéries contiennent déjà le vecteur codant pour la recombinaison du dècre. À l’aide d’une pointe de cornemuse, nous grattons une petite quantité de bactéries sur la pointe de la cornemuse et la déposons dans le bécher contenant la culture de nuit.

La culture de nuit consiste en un milieu LB complété par du glucose à une concentration finale de oh 0,5 % et 50 microgrammes d’insuline carbonique par ml. Le bécher est ensuite placé dans un incubateur fonctionnant à 37 degrés centigrades pour l’expression du Recombinate Cree spécifique au site. Nous utilisons les médias d’avant-guerre pour notre culture d’expression à grande échelle.

Pour accélérer l’expression, nous recommandons l’utilisation d’un milieu antituberculeux chauffé à 37 degrés centigrades, ce qui représente la température lors de l’expression de la protéine recombinante. Ensuite, nous ajoutons du glucose au milieu TB à une concentration finale de oh 0,5 %. Le glucose empêche une augmentation de l’expression basale de la protéine de fusion pendant la croissance de la culture d’expression avant l’induction. Enfin, l’ampicilline est ajoutée à la culture d’expression à une concentration finale de 100 microgrammes par ml pour assurer une culture pure ne contenant que les bactéries qui hébergent encore le plasmide codant pour la protéine décrétée.

Nous pouvons maintenant obtenir notre culture du jour au lendemain et inoculer la culture d’expression dans un rapport de un à 50. Les béchers sont ensuite transférés dans un incubateur fonctionnant à la température de 37 degrés centigrades. Vous devez prélever des échantillons pour mesurer la densité optique de manière régulière tout au long de l’expression.

Dès que la culture a atteint une densité optique de 1,5, les bactéries sont induites avec une concentration finale de oh 0,5 millimolaire d’IPTG. Après une heure d’induction, la culture d’expression est transférée dans des tubes puis récoltée par centrifugation. Pour ce faire, nous utilisons un rotor SLA 3000.

La centrifugeuse fonctionne à une vitesse de 5 000 coups par minute pendant 10 minutes à quatre degrés antigrades. Le piège est ensuite jeté et la pastille de bactéries peut être stockée indéfiniment à moins 20 degrés centigrades. Les granulés congelés sont remis en suspension dans un tampon lizza, un appel correspondant à un litre de culture d’expression.

Nous utilisons 10 ml de tampon lizza et attendons environ 15 minutes jusqu’à ce que la solution devienne homogène. Un milligramme de lysozyme est ensuite ajouté pour chaque ML de suspension. La solution est mélangée pendant 20 minutes pour permettre à l’enzyme d’ouvrir les bactéries.

Par la suite, Benson Nase est ajouté dans une dilution de un à 1000 pendant 15 minutes supplémentaires, ce qui coupera l’ADN et donnera une solution non visqueuse. Enfin, un sonateur est utilisé pour assurer la lyse des cellules. Le programme dure une minute et demie avec une puissance de 45 % après l’achèvement de la certification.

N’oubliez pas de prendre un échantillon de chaque étape ici, le lysat brut ou l’analyse de la page FDS de la purification. Il est maintenant très important d’ajouter un ml de tampon TSB glacé par ML de suspension, car les protéines décrétées auront tendance à précipiter dans le stock de glycérol. Si vous sautez cette étape, la solution est mélangée rapidement et le brut est maintenant prêt pour la centrifugation.

Pour cela, nous utilisons un rotor SS 34. La centrifugeuse fonctionne à 17 000 tr/min pendant 30 minutes à quatre degrés centigrades. Une fois terminé, centrifuge Inc a soigneusement transféré le surnageant S dans des tubes Falcon frais de 50 ml.

Ajoutez maintenant de la boue de nickel anti A au nickel surnageant. L’anti-A est un réactif crucial pour la bonne purification des protéines de fusion de l’histidine tech. L’histidine forme un complexe avec les ions nickel permettant la purification d’affinité, secouez maintenant doucement les tubes de stationnement pendant 60 minutes à 40 degrés centigrades.

Après une heure, vous pouvez maintenant appliquer la suspension sur des colonnes de 20 ML et laisser la solution s’écouler par gravité. Pour les productions à grande échelle, il est possible de diviser la suspension sur plusieurs colonnes. Nous lavons ensuite la colonne deux fois avec un tampon contenant 15 millimolaires de semelle intérieure.

La quantité de tampon appliquée dépend du volume de résine. Deux MLS de nickel NTA correspondent à un ml de résine pour les moyens de lavage. Nous mettons cinq volumes de résine de tampon de lavage sur la colonne après le lavage, nous sommes maintenant prêts à échapper à notre protéine.

Par conséquent, nous utilisons un tampon d’élution avec une concentration de 250 millimolaires d’immuno. Remarquez donc comment la couleur de la résine change vers le vert. En raison des concentrations élevées de protéines CRE, la fraction OID devient parfois ébouriffée.

Pour éviter cela, mélangez la solution et ajoutez un tampon lys supplémentaire, toutes les fractions sont maintenant regroupées et ensuite transférées dans un tube de lyse. La lyse éliminera l’ole première étape du dialyseur est effectuée contre le tampon contenant une forte concentration de sel. Après une heure, le tampon à haute teneur en sel est remplacé et la procédure de dialyse est appliquée pendant la nuit.

Le lendemain, le tube de dialyse est retiré du tampon à haute teneur en sel et transféré dans un tampon de glycérol. Après trois à cinq heures, le tampon glycérol est remplacé et les dialyses sont à nouveau effectuées pendant la nuit. La lyse contre le tampon de glycérol donnera une solution mère au moins trois fois concentrée.

La solution mère peut désormais être stockée à moins 20 degrés centigrades pendant plusieurs années sans perte d’activité. Pour l’assurance qualité, vous pouvez charger vos échantillons de pages FDS collectés sur un gel et les colorer par la suite. Pour Kamasi, la protéine de fusion Cree est détectable comme une bande proéminente dans la fraction OID. Afin d’utiliser la concentration appropriée de recombinaison de l’équipage, vous devez déterminer la concentration via le test de Redford.

Comment appliquer des protéines aussi permanentes dans des cellules de mammifères. Tout d’abord, préparez vos cellules cibles afin d’obtenir les meilleures efficacités de transduction des protéines. Voyez les cellules monocouches à la densité résultant en une couche de cellules de confluence de 80 à 90 % le lendemain au cas où vos cellules cibles seraient des cellules oui, qui sont cultivées en colonies compactes.

Séparez les cellules et somatiquement et voyez-les dans une suspension unicellulaire cinq heures à l’avance. Il est important de fabriquer une suspension unicellulaire avant la transduction des protéines, sinon seules les cellules aériennes à la surface d’une colonie peuvent être transfusées. Aspirez les milieux et observez brièvement les cellules d’air avec le PPS avant le traitement d’essai.

Retirez le support Yes, grossier contenant du sérum restant. Après avoir aspiré les cellules de recouvrement PPS avec goutte à goutte et laissez-les incuber trois à cinq minutes. Vérifiez maintenant au microscope si toutes les colonies sont dissoutes dans des cellules uniques.

Les raisons que nous venons de mentionner, c’est qu’il s’agit d’une étape cruciale pour la transduction des protéines dans les cellules oui. Transférez les cellules détachées dans un tube. Placez le tube dans une table, centrifugez et faites tourner les cellules vers le bas, aspirez le super agent et remettez la cellule en suspension.

P dans le milieu de croissance diluer les cellules en nombre de cellules approprié. Cela dépend bien sûr de la taille de la culture tissulaire. Boîte d’incubation des cellules d’air pendant cinq heures supplémentaires.

Cela donnera aux cellules d’air suffisamment de temps pour se fixer au fond et devenir adhérentes. Le stock de rangs de trois classes peut être stocké à moins 20 degrés pendant plus de deux ans. Lorsque l’on travaille avec une protéine de fusion permanente de cellules recombinantes, il est très avantageux d’avoir une telle solution mère qui peut être utilisée à la demande.

En attendant que les cellules se fixent à la boîte, on peut préparer le milieu de transduction C en diluant simplement un volume approprié de protéine de fluage cellulaire permanent du stock de cholestérol en vous-même. Média. Comme la solution mère de Clare n’est pas encore stérile, les milieux trans doivent être filtrés de manière stérile avant d’être appliqués. Nous vous recommandons d’utiliser une seringue qui peut être vissée sur un filtre de liaison aux protéines de lobes.

La concentration finale dans le ruisseau dépend du type de cellule ou des suppléments de milieu. Par exemple, le sérum a une forte influence négative sur l’efficacité de la transduction. Cela peut être surmonté en utilisant des milieux sans sérum ou en augmentant la concentration dans les ruisseaux.

Nous trouvons la condition optimale permettant une efficacité de recombinaison maximale. Hydrater décrète la concentration à partir de oh 0,5 jusqu’à 10 micromolaires. Nous vous recommandons de tester différents temps d’incubation entre six et 18 heures.

Après cinq heures d’incubation, retirez vos cellules cibles et aspirez les milieux croisés. Par la suite, nous le remplaçons par un milieu de transduction de protéines, remettons les cellules d’air dans l’incubateur après une nuit d’incubation. J’ai brièvement lavé les cellules D avec du PPS et changé le milieu de transduction des protéines en milieu ES normal.

48 heures après l’incubation de la cellule, l’expression du gène Cree vent permanent peut être détectée via xul. Les cellules de coloration avec un phénotype bega positif ont été génétiquement modifiées avec succès par recombinaison spécifique du site. Cree le rapport.

Les cellules hébergent l’utilisation de l’ERC Lae construction lors de la recombinaison pré-médiadée. Une séquence d’arrêt du flanc P est excisée et un gène reporter de luxe est activé par le promoteur de l’équipe. Afin d’évaluer l’efficacité de recombinaison dans les cellules d’air rapporteures prétraitées, les cellules doivent être fixées.

Aspirer les cellules de lavage deux fois avec des cellules de recouvrement PBS avec 4 % de PFA et incuber les cellules pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez à nouveau les cellules trois fois avec du PBS. Après avoir aspiré le PBS de la dernière étape de lavage à la solution Xal Stain jusqu’aux puits, incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés dans un incubateur.

Le lendemain, l’activité de Beal peut être surveillée par des cellules à col bleu. L’efficacité de recombinaison peut être déterminée par le nombre de colonies bleues. Dans des conditions optimales, vous devriez être en mesure d’atteindre une efficacité de recombinaison supérieure à 90 %D’accord, aujourd’hui, nous vous avons montré comment exprimer et purifier la recombinaison de requête spécifique au site à partir d’e coli.

Dans cette étude de preuve de principe, nous avons pu induire une recombinaison dans la plupart des sels. D’accord, c’est tout. Bonne chance avec vos Experiments.I.