Mikrobiologisch Induzierte Calcitausfällung Vermittelt durch Sporosarcina pasteurii

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Calcitfällung in einer stagnierenden Kultur von Sporosarcina pasteurii zu induzieren. Diese Methode kann uns helfen, wichtige biophysikalische Fragen zur Calcitfällung von Sporosarcina pasteurii zu beantworten, wie z.B. die relevanten Längen- und Zeitskalen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die komplexen Schritte zur geeigneten Kultivierung und Anreicherung von Sporosarcina pasteurii standardisiert und so eine zuverlässige Kalzitfällung gewährleistet.

Bauen Sie zunächst Petrischale, Kolben, Tris-Basis, HCl, Agar, Millipore-Wasser und ein pH-Messgerät zusammen. Sterilisieren Sie alle Behälter vor Gebrauch durch Autoklavieren bei 121 Grad Celsius. Bereiten Sie einen Liter einer 0,13 molaren wässrigen Lösung von Tris-Puffer vor, indem Sie 15,75 Gramm Tris-Base mit einem Liter Millipore-Wasser mischen.

Fügen Sie etwa 2,8 Milliliter 50%HCl hinzu, um den Puffer auf einen pH-Wert von neun einzustellen. Sobald die Kultur fertig ist, muss sie mit dem richtigen Puffer angereichert werden. Dieser Schritt ist entscheidend für den Erfolg des Experiments, da das Versäumnis, die richtige chemische Umgebung zu schaffen, zu sehr langen Zeiträumen des Niederschlags oder sogar zu einem völligen Fehlen dessen führen kann.

Als nächstes teilen Sie den einen Liter Puffer wie folgt in zwei Teile. In einem 400-Milliliter-Aliquot werden acht Gramm Ammoniumsulfat gelöst. In einem zweiten 400-Milliliter-Aliquot lösen Sie 16 Gramm Hefeextrakt auf.

Mischen Sie in 100 Milliliter des Puffers zwei Gramm Ammoniumsulfat und fügen Sie in die letzten 100 Milliliter Puffer vier Gramm Hefeextrakt und vier Gramm Agar hinzu. Nachdem Sie die Kolben in Aluminiumfolie eingewickelt haben, autoklavieren Sie die vier Lösungen. Unmittelbar nach dem Autoklavieren die beiden 400-Milliliter-Lösungen beiseite stellen.

Kombinieren Sie die beiden 100-Milliliter-Lösungen, mischen Sie sie gut und verteilen Sie sie auf 10 bis 12 Petrischale. Um Bakterienproben zu kultivieren, nehmen Sie die Bakterienbrühe aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und lassen Sie sie richtig auftauen. Legen Sie es dann zusammen mit einer Agarplatte in die Biosicherheitshaube.

Wählen Sie eine Mikropipette mit dem geringstmöglichen Volumen und tauchen Sie eine Mikropipettenspitze in den Sporosarcina pasteurii-Stamm, bevor Sie mit der Spitze eine Agarplatte streifen. Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei 31 Grad Celsius und untersuchen Sie sie dann visuell auf das Vorhandensein einzelner Kolonien. Wenn keine vorhanden sind, inkubieren Sie weitere 24 Stunden.

Wiederholen Sie die Kontrolle und die Inkubationen, bis einzelne Kolonien nachgewiesen werden. Zur Vorbereitung der endgültigen Bakterienkulturproben werden die beiden zuvor autoklavierten 400-Milliliter-Lösungen in einem sterilisierten Becherglas gemischt und 125 Milliliter in einen Kolben überführt. Führen Sie eine visuelle Untersuchung der Agarplatte durch, um Regionen mit hohen Konzentrationen einzelner Kolonien zu identifizieren.

Stoßen Sie mit einer Mikropipettenspitze vorsichtig eine der Kolonien an und brechen Sie sie. Tauchen Sie dann dieselbe Spitze in den 125-Milliliter-Kolben und rühren Sie ihn gründlich um, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anzahl von Zellen übertragen wird. Stellen Sie den Kolben für zwei bis drei Tage bei 30 Grad Celsius und 150 U/min in einen Schüttelinkubator.

Um eine endgültige Zellzahl zu bestimmen, zeichnen Sie sieben parallele äquidistante fette Linien auf die Unterseite einer der Agarplatten, so dass sie von oben sichtbar sind. Geben Sie drei kleine Tropfen von etwa zehn Mikrolitern unverdünnter Kultur in ein Segment. Fügen Sie einen Milliliter unverdünnte Kultur zu neun Millilitern sterilisiertem PBS hinzu, um eine Verdünnung von eins zu zehn zu erhalten.

Geben Sie dann drei kleine Tropfen der Verdünnung auf ein zweites Segment der Platte. Die verdünnte Kultur wird in einen neuen Kolben umgefüllt und mit PBS zusätzlich das Zehnfache bis zum Zehnfachen auf minus zwei verdünnt. Wiederholen Sie den Beschichtungs- und Verdünnungsvorgang, bis eine Verdünnung von mindestens zehn bis minus sieben erreicht ist, um sicherzustellen, dass einzelne Kolonien erhalten werden.

Inkubieren Sie die Platte ein bis zwei Tage lang bei 31 Grad Celsius, bevor Sie die Kolonien in jedem Abschnitt der Platte zählen. Neun Milliliter der vorbereiteten Flüssigkultur werden in mehrere sterilisierte Zentrifugenröhrchen mit zehn Millilitern überführt. Bereiten Sie 100 Milliliter der externen Anreicherungslösung vor, indem Sie mit einer Analysenwaage vorsichtig zwei Gramm pro Liter Harnstoff, ein Gramm pro Liter Ammoniumchlorid, 212 Milligramm pro Liter Natriumbicarbonat und 280 Milligramm pro Liter Calciumchlorid abmessen.

In einem Becherglas mit frischem Medium alle Zutaten außer dem Harnstoff vermischen und autoklavieren. Nach dem Autoklavieren wird der Harnstoff mit einem Milliliter frischem Medium gemischt und die Lösung durch eine Spritze mit einem 0,2-Mikrometer-Filter geleitet, bevor sie dem Anreicherungsmedium zugesetzt wird. Geben Sie einen Milliliter des Anreicherungsmediums mit Additiven in die sterilisierten Zentrifugenröhrchen, die neun Milliliter der vorbereiteten Kultur enthalten.

Jedes Röhrchen verwirbeln und in einem schüttelfreien Inkubator bei 30 Grad Celsius inkubieren. Überwachen Sie alle Geräte regelmäßig auf den Beginn des Niederschlags. Sobald der Niederschlag mit bloßem Auge erkannt wurde, übertragen Sie eine kleine Menge Flüssigkeit in ein Kammer-Deckglassystem mit hoher Vergrößerung.

Betrachten Sie zunächst unter 4-facher Vergrößerung, um einen großen Abdeckungsbereich zu beobachten, bevor Sie die Vergrößerung schrittweise erhöhen. Führen Sie Färbe- und REM-Experimente gemäß dem Textprotokoll durch. Wenn S.pasteurii nach dem in diesem Video gezeigten Protokoll kultiviert wird, führen die Bakterien zur Ausfällung von Kalziumkarbonat, das sich im Laufe der Zeit am Boden des Röhrchens absetzt.

Diese Abbildung zeigt Phasenkontrastbilder einer deutlich unterschiedenen, stäbchenförmigen Bakterienpopulation innerhalb des Mediums. Hier sind die klar definierten Spaltlinien zu sehen, ein Kennzeichen der Kristallinität. Dieses Röntgen-Photoelektronenspektroskopie-Diagramm für dieselbe Probe enthält Peaks, die Karbonatgruppen entsprechen, die auf das Vorhandensein von Kalziumkarbonat hinweisen.

In diesem Panel ist ein unbehandelter Schwamm zu sehen, der sich leicht zusammendrückt, wenn er einem Gewicht von einem Kilogramm ausgesetzt wird. Wenn ein Schwamm sieben Tage lang in eine Calcit-Fällungslösung mit S. pasteurii getaucht und dann getrocknet wurde, härtete er aus und zeigte eine erhöhte Druckfestigkeit aufgrund von Porenverstopfungen durch Calcitfällung. Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Stunden abgeschlossen werden, wenn alle Schritte richtig ausgeführt werden.

Obwohl die einzelnen Schritte jeweils nur wenige Minuten dauern, gibt es dazwischen längere Leerlaufzeiten, in denen die Probe über Stunden oder sogar Tage inkubiert werden muss. Im Anschluss an dieses Verfahren können verschiedene andere Techniken, wie z. B. zusätzliche Charakterisierungen, durchgeführt werden, um andere Fragen zu beantworten, z. B. zur statistischen Verteilung polymorpher Formen in Kalziumkarbonat. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein richtiges und klares Verständnis davon haben, wie man Sporosarcina pasteurii angemessen kultiviert, um sie richtig anzureichern, um die Kalzitfällung zu gewährleisten, und wie man den Prozess durch Multi-Mode-Mikroskopie beobachtet.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Hochdruckautoklaven äußerst gefährlich sein kann und daher alle Vorsichtsmaßnahmen wie vollständiges Entlüften der Kammer und das Tragen von PSA vor der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden müssen.