Name: Mikrobiologisch Induzierte Calcitausfällung Vermittelt durch Sporosarcina pasteurii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Erfahren Sie die mikrobiologisch induzierte Calcitausfällung mit Sporosarcina pasteurii für Biomineralisation und Materialwissenschaften. Diese Methode standardisiert die Kultivierung und erhöht die Druckfestigkeit von Schwämmen durch Calcitpräzipitation.

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Wir danken den Partnern in der Helmholtz-Alberta Initiative, der Helmholtz-Gemeinschaft und der University of Alberta für die Unterstützung, die sich aus der Teilnahme an dieser Zusammenarbeit ergibt. Die Forschungsförderung erfolgt durch den Impuls- und Vernetzungsfonds der Helmholtz-Gemeinschaft, die beteiligten Helmholtz-Zentren sowie durch die Regierung von Alberta über das ecoTrust-Programm von Alberta Environment.
Dr. Tanushree Ghosh ist dankbar für ihre kritischen Beiträge in einer Reihe von entscheidenden Phasen.

HINWEIS: Führen Sie die experimentellen Protokolle in der folgenden Reihenfolge beschrieben. Die Bakterienkultur - Protokoll in Abschnitt 1 (siehe auch Abbildung 1) diskutiert wird. Abschnitt 2 beschreibt das Protokoll zur Anreicherung des Kulturmediums mit externen Additiven. Abschnitt 3 beschreibt die Protokolle für die Multi-Mode-Mikroskopie. Gewichte aller einzelnen Komponenten kann unter Verwendung einer Analysenwaage gemessen werden. Volumen jeder Lösung kann unter Verwendung eines volumetrischen Zylinder gemessen werden. HINWEIS: - 2. Wenden Sie sich an institutionelle Sicherheit Büro für Details Proper Biosicherheit Protokolle müssen für die Abschnitte 1 folgen. 1. Bakterienkultur <ol><li> Kultur Bacteria - Agarplattenmedium Vorbereitung <ol><li> Montieren Sie Geräte und Zutaten wie Petrischalen, Kolben, Tris-Base, HCl, Agar, Millipore-Wasser, pH-Meter etc.Sterilize alle Behälter durch Autoklavieren bei 121 ° C vor dem Gebrauch. </li><li> Vorbereitung 1 l 0,13 M wässrige Lösung von Tris-Puffer von 15,75 g Tris-Base mit 1 l Millipore Wasser vermischt. Um den pH-Wert der ursprünglichen Lösung (pH 10,4) in 2.800 &amp; mgr; l HCl (50% Konzentration) zu senken. Überprüfen Sie kontinuierlich mit einem pH-Meter mit pH-Wert einzustellen = 9. </li><li> Teilen Sie die 1 l Pufferlösung in zwei Teile wie folgt: <ol><li> Nehmen Sie 800 ml dieser Lösung. Teilen Sie es gleich in zwei Teile von je 400 ml. Man löst 8 g (NH 4) 2 SO 4 zu einer Lösung und 16 g Hefeextrakt zu der anderen Lösung. </li><li> Nehmen Sie die restlichen (200 ml) Lösung und teilen Sie es wieder in zwei Teile von je 100 ml. Mix 2 g (NH 4) 2 SO 4 zu eins. Hinzufügen, 4 g Hefeextrakt und 4 g Agar zum anderen. </li></ol></li><li> Autoclave die 4 Lösungen getrennt nach der jeweiligen Kolben in Al-Folie wickeln und kleben Autoklaven Bänder. HINWEIS: Wenn ein Benchtop-Autoklav-Einheit verwendet wird, sollte das Volumen auf 500 ml eingestellt werden (Temperatur und Druck automatmatisch in Abhängigkeit von Volumen angegeben). </li><li> Nachdem sie aus dem Autoklaven nehmen, stellen Sie die zwei 400 ml-Lösungen beiseite für Schritt 1.3.1 (unten). Mischen Sie die zwei 100 ml-Lösungen eine 200 ml Lösung. Die Mischung wurde in 10 bis 12 Petrischalen. </li></ol></li><li> Kultur Bacteria - Näh - Probenvorbereitung <ol><li> Entfernen Sie die Bakterien Lager aus dem Gefrierschrank (-80 ° C) und lassen Sie es zu tauen. richtig, legen Sie die bakterielle Lager und die Agar-Platte in einer Biosicherheits Haube Nach dem Auftauen. </li><li> Wählen Sie die Mikropipette aus kleinsten Dimension (0,5 bis 10 &amp; mgr; l ist eine gute Wahl) , um die Spitze mit dem Sporosarcina pasteurii Lager zu verseuchen. Streak eine Agar-Platte mit der Mikropipettenspitze. Legen Sie die Strähnen-Agar-Platte in einem nicht-Schüttelinkubator bei 31 ° C für 48 Stunden. </li><li> Nach 48 Stunden, um die Platte aus dem Inkubator entfernen und visuell auf die Existenz von Einzelkolonien zu untersuchen. Wenn es keine einzelne Kolonien sind, legen Sie sie dann in ter Inkubator für weitere 24 Stunden. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang, bis einzelne Kolonien festgestellt werden. Nicht mehr als 7 Tagen nach der Studie. HINWEIS: Wenn einzelne Kolonien nicht einmal nach einer Woche erscheinen, dann wird der Schluss gezogen, dass die Schritte nicht ordnungsgemäß und der gesamte Prozess muss wiederholt werden Schritt 1 gefolgt. </li></ol></li><li> Kultur Bakterien - Schlussprobenvorbereitung <ol><li> Mischen Sie die zwei 400 ml - Lösungen (Tris - Puffer + (NH 4) 2 SO 4 und Tris - Puffer + Hefeextrakt (1.5.1) zusammen eine 800 ml Lösung zu erhalten. Übertragen 125 ml dieser Lösung in einem Kolben. </li><li> Durchführen einer Sichtprüfung der Oberfläche der Agarplatte Regionen mit hoher Konzentration von Einzelkolonien zu identifizieren. Sanft schubsen und mit einer Mikropipette Spitze einer der Kolonien brechen. </li><li> Tauchen Sie die gleiche Mikropipettenspitze in den 125-ml-Kolben und rühren Sie es gründlich, dass eine ausreichende Anzahl von Zellen für eine robuste Multiplikation, um sicherzustellen, übertragen bekommen. Der Kolben wird in einem Schüttelinkubator bei 150 Umdrehungen pro Minute, 30 ° C für 2 - 3 Tage. Nach 2 - 3 Tage, wird der Kolben aus dem Inkubator entfernen. </li></ol></li><li> Kultur Bakterien - Schluss Cell Count <ol><li> Führen Sie serielle Verdünnung des nicht verdünnten Kulturlösung PBS unter Verwendung einer Verdünnung von mindestens zehn Millionen (10 -7) zu erreichen zählbaren einzelne Kolonien zu gewährleisten , erscheinen. Zeichne sieben parallele äquidistante Linien auf einer der Agar-Platten. <ol><li> Tun Sie dies durch fette Linien auf der Unterseite der Petrischale, prominent genug Zeichnung von oben sichtbar sein. Tropfen-3 kleine Tropfen von nicht-verdünnte Lösung in einem Segment. 1 ml der unverdünnten Lösung auf 9 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) mit einer Verdünnung von 1:10 zu erhalten. </li></ol></li><li> Nehmen Sie eine kleine Teilmenge (~ 0,1 ml) dieser neu verdünnte Lösung mit einer Pipette und Drop 3 weitere kleine Tropfen auf den nächsten Abschnitt. Übertragung der neu verdünnten Lösung in einen neuen Kolben und weiter verdünnt zehnmal (10x) durchZugabe von PBS. Dadurch verringert sich die Verdünnung auf 10 -2 oder 1: 100. <ol><li> Verwenden Sie diese 1: 100-Lösung in den nächsten Abschnitt. Wiederholen Sie diesen Vorgang er mit kleinen Volumina der frisch verdünnten Lösungen verarbeiten , indem nacheinander an neue Kolben übertragen und kontinuierlich verdünnt das Zehnfache (10x) im Tandem mit PBS mehr und mehr verdünnte Proben von 10 -3 oder 1 zu erhalten: 1000 den ganzen Weg bis zu 10 -7 oder 1.10 Millionen in das letzte Segment. </li></ol></li><li> Führen Colony-Forming Unit (CFU) Plattenzahl die Anzahl der Zellen in der Agar-Platte zu zählen, nachdem die Platte für 1 Inkubation - 2 Tage bei 31 ° C. Dies ergibt ein quantitatives Maß für die Bakterienzahl in der unverdünnten Probe. HINWEIS: Die CFU-Wert gemessen wird, basierend auf der Fähigkeit des Systems, Anlass zu Kolonien unter den spezifischen Bedingungen des Nährmediums zu geben, die Temperatur und die Zeit unter der Annahme, dass jede Kolonie getrennt ist und durch eine einzige lebensfähige mikrobielle Zelle gegründet. </li><li> Dichtungdie Petrischalen mit selbstdichtenden Film und speichern verbleibenden Elemente in einem Kühlschrank für die zukünftige Verwendung. </li></ol></li></ol> 2. Protokoll zur Anreicherung von Nährstoffen Precipitation zu beschleunigen <ol><li> Transfer 9 ml der hergestellten Kulturflüssigkeit (Zellen + Medium) in mehrere sterilisierten Zentrifugenröhrchen, die jeweils 10 ml Volumen. </li><li> Bereiten Sie eine 100 ml-Stammlösung der externen Anreicherung bestehend aus vier Komponenten in den folgenden Konzentrationen in frischem Medium: Harnstoff: 2 g / l, Ammoniumchlorid: 1 g / l, Natriumbicarbonat: 212 mg / l, Calciumchlorid: 280 mg / L. messen Sie sorgfältig alle Zutaten einer Analysenwaage mit und im Autoklaven (121 ° C, 15 psi, 15 min) alle, aber Harnstoff mit frischem Medium in einem Becherglas und Ort mischen. <ol><li> Nach Autoklaven, mischen, um die erforderliche Menge an Harnstoff (2 mg) mit 1 ml frischem Medium und durch eine Spritze mit 0,22 um Spritzenfilter ausgestattet, um den Prozess der Anreicherung abzuschließen. </li><li> 1ml dieser Anreicherungsmedium mit Additiven zu den 9 ml der Flüssigkeit hergestellten Kultur enthält Zentrifugenröhrchen sterilisiert (Zellen + Medium) (siehe Schritt 2.1). HINWEIS: all dieser Komponenten, Harnstoff bei erhöhten Temperaturen abbaubar, nicht in einem Autoklaven sterilisiert werden. Daher wird, nachdem die anderen Bestandteile autoklaviert wurden (121 ° C, 15 psi, 15 min) wird Harnstoff zuletzt zugegeben durch einen 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter. </li></ol></li><li> Vortex jedes Rohr eine mechanische Vortexer gründlich mit. Legen Sie die angereicherten Flüssigkeiten (Zellen + Medium + Additive) in einem nicht-Schüttelinkubator bei 30 ° C. Überwachen Sie alle Einheiten regelmäßig für die Initiierung der Fällung. Unter Verwendung eines Lichtmikroskops, beginnen mikroskopische Beobachtungen einmal Einsetzen der Präzipitation mit dem bloßen Auge festgestellt wird. Dies ist in der Regel zwischen 30 bis 36 Stunden nach dem Beginn der Versuche. </li></ol> 3. Protokoll für Multi-Mode-Mikroskopie <ol><li> Übertragen ein kleines Volumen (ca. 1 ml) der Flüssigkeit zu einem Hoch magnificatIonenmikroskopie-chambered Abdeckglas System ersten Beobachtungen mit Hellfeld-Modus auszuführen. Um damit zu beginnen, starten alle Beobachtungen mit der geringsten Vergrößerung (4X). das bietet eine breite Bereich der Abdeckung und damit globale Informationen über die Verteilung von Niederschlägen. </li><li> Wählen Sie bestimmte Bereiche mit erheblichen Mengen von Ausfällungen und vergrößern (20X, 40X, 60X) durch schrittweise die Vergrößerung zu erhöhen. HINWEIS: Da es unmöglich ist, um richtig die Zellen aus dem extrazellulären polymeren Substanz (EPS) unter Hellfeld (aufgrund sehr nahe Brechungsindizes) zu lösen, schalten Sie Phasenkontrast-Modus bei Bedarf. In diesem Modus sind nur die Umrisse der Zellmembranen (eine andere Phase als die bulk Zelle ist) sichtbar ist, wodurch optische Differenzierung ermöglicht. </li><li> Schließlich färben einige Kammern mit Live / Dead-Färbung, die selektiv die Live-Komponenten als grüne Farbstoffe, während die toten Komponenten in roten Färbung. Siehe Standardprotokolle 28 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Schalten Sie Fluoreszenzmodus richtig zwischen den roten und grünen Bereichen unterscheiden. Red (Red Filterwürfel mit Anregungswellenlänge von 540 bis 580 nm dichroitische Spiegel von 595 nm und Sperrfilter von 600 bis 660 nm) und Green (GFP Langpassgrünfilterwürfel mit Anregungswellenlänge von 440 bis 480 nm dichroitische Spiegel 505 nm und Sperrfilter von 510 nm) Filterwürfel verwendet Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zu erleichtern. </li><li> Sobald alle Multi-Mode-Daten wurden gesammelt, wählen Sie die besten Bilder und manuell Overlay (individuelle Hellfeld, Phasenkontrast und Fluoreszenz-Bilder), um den bestmöglichen Kontrast und Klarheit zu erhalten. </li><li> Führen Sie SEM auf den getrockneten festen Proben Kristallstrukturen zu verstehen. Dies ist ein gut etabliertes und Standardverfahren. 22 Führen XPS chemischen Signaturen von funktionellen Gruppen (Carbonate) zu identifizieren. Dies ist ein gut etabliertes und Standardverfahren als auch. 23 </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Kritische Schritte: Dieses Manuskript beschreibt detailliert die Protokolle für die Kultivierung einer tragfähigen Probe von S. pasteurii. Sobald die Kultur bereit gemacht worden ist, muss es in geeigneter Weise angereichert werden. Dies ist ein wichtiger Schritt , entscheidend für den Erfolg des Experiments , weil ein Fehler die richtige chemische Umgebung zu schaffen , führt entweder zu sehr langen Zeitskalen von Ausfällen oder einem vollständigen Fehlen derselben. S. pasteurii ist s...

Sporosarcina pasteurii ist ein gram-positives Bakterium der Lage , in stark alkalischen Umgebungen (pH ~ 10) 1 , um zu überleben und ist einer der bakteriellen Spezies , die ein Erreger eines Phänomen kann Mikrobiologisch Induced Calcite Precipitation (MICP) 2-4 genannt. MICP ist ein Verfahren , bei dem die Ausfällung von Calciumcarbonat durch bestimmte Mikroben unter geeigneten Umweltbedingungen induziert wird. S. pasteurii hat Bedeutung in den letzten Jahren angenommen aufgrund seiner Identifizierung als mögliche Mittel für bedeutende Mengen MICP unter bestimmten Bedingungen zu induzieren. Diese Möglichkeit ergibt sich aus der Tatsache , dass S. pasteurii hat die einzigartige Fähigkeit , reichliche Mengen des Enzyms Urease absondern. Dieses Enzym wirkt als Katalysator, um einen beschleunigten Lyse von Harnstoff (ein natürlich vorkommendes biochemische Verbindung mit der weit verbreiteten und reichliche Versorgung) in Gegenwart von Wassermolekülen zu fördern. Durch eine Kaskade von Reaktionen, diesen Prozess ultimatively führt zur Erzeugung von Carbo negativ geladen. Diese Ionen, die wiederum reagieren mit positiven Metallionen, wie Calcium, um schließlich Niederschläge von Calciumcarbonat (Calcit) bilden; daher die Bezeichnung MICP 5-9. Der Prozess des MICP ist seit mehreren Jahrzehnten bekannt und 10,11 sucht. In den letzten Jahren hat sich MICP für ein breites Spektrum an technischen und umwelttechnische Anwendungen einschließlich Bottom-up - grün Bau 12, Verstärkung der Großstrukturen 13,14 und Kohlenstoffbindung und -speicherung 15,16 sucht worden. B. et 17 Cunnigham. al entwickelt, um eine hohe Druck moderate Strömung Reaktortemperatur einen Berea-Sandsteinkern enthält. Der Reaktor wurde mit den Bakterien inokuliert S. fridgidimarina und unter Bedingungen von Hochdruck - superkritischem Kohlendioxid Injektion einer massiven Ansammlung von Biomasse in der Pore volUME wurde beobachtet, die in der Permeabilität zu mehr als 95% Reduktion geführt. 18 Jonkers und Schlangen untersuchten die Wirkung von bestimmten speziellen Bakterienstämme auf die Selbstheilungsprozess in Beton. Externe Wasser transportiert in das Porennetzwerk durch die Oberflächenporen eintritt, wird erwartet, dass die ruhenden Bakterien zu aktivieren, die wiederum strukturelle Festigkeit über MICP helfen. Tobler 19 et al. die ureolytischen Aktivität von S. haben im Vergleich pasteurii mit einem einheimischen Grundwasser ureolytischen Mikrokosmos unter Bedingungen groß angelegte MCIP Begünstigung und fand heraus , dass S. pasteurii hat eine konsistente Fähigkeit Calcitausfällung zu verbessern , selbst wenn die indigenen Gemeinschaften vor Urease - Aktivität fehlte. Mortensen 20 et.al haben die Auswirkungen von externen Faktoren wie Bodentyp, Konzentration an Ammoniumchlorid, Salzgehalt, Sauerstoffkonzentration und die Lyse von Zellen auf MICP sucht. Ihre Demonstration, dass die biologische Behandlungsverfahren ist sehr robust bzw.ect zu einer großen Variation im Parameterraum belegt die Eignung dieses Verfahrens für verschiedene Sanierungs Anwendungen in großem Maßstab eine richtige Anreicherungsprozess bereitgestellt, um die Bakterien zu verstärken vorgenommen. Phillips 21 et. al ausgelegt Experimente die Änderungen der Durchlässigkeit und Festigkeit einer Sandsäule und ein Sandsteinkern zu studieren , nachdem sie mit S. injiziert wird pasteurii Kulturen. Sie fanden heraus, dass, während die Durchlässigkeit verringert 2-4 mal während die Bruchfestigkeit dreimal erhöht. S. pasteurii und seine Rolle in MICP sind Themen der aktiven Forschung und mehrere Probleme auf den Mechanismus der chemischen Fällung beziehen , sind noch nicht vollständig verstanden. Vor diesem Hintergrund ist es sehr wichtig , eine Reihe konsistenter standardisierte Protokolle zu haben , um genau Kultur ein entsprechend angereichert Lager von S. pasteurii MICP zu erreichen. Hier beschreiben wir ein strenges Protokoll, das die Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit gewährleistet. Diese manuscript beschreibt die detaillierten Protokolle für S. Kultivierung pasteurii und in geeigneter Weise die Kulturmedium bereichern Fällung zu induzieren. Das Verfahren wird durch die verschiedenen mikroskopischen Techniken wie optische und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) untersucht. Der Schwerpunkt des Manuskripts ist auf den Prozess der MICP. Verfahren wie SEM und SIMS, gut etablierte Standardprotokolle sind, werden nicht gesondert beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Petrischalen werden als Agarplatte verwendet</td></tr><tr><td>Pyrex Kolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63268</td><td>Corning Erlenmeyer</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Promega</td><td>H5133</td><td>wird zur Herstellung von Tris-Buffer</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>verwendet Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td>1,0 N, Bioreagenz, geeignet für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Agar Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>Mikrobiologie getestet, Pflanzenzellkultur getestet, Zellkultur getestet, Pulver</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td>für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Hefeextraktpulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>Messzylinder</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP08559GC</td><td>Cole-Parmer Klasse A Messzylinder mit Cal Cert,TC; 1.000 ml,1/Pk</td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>OHAUS</td><td>AX124E</td><td>zur Messung des Gewichts von Reagenzien</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Brinkmann</td><td>58619000</td><td></td></tr><tr><td>Autoklavenband</td><td>VWR</td><td>52428864</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z185140</td><td>zur Versiegelung des Kolbens vor dem Einfüllen in den Autoklaven</td></tr><tr><td>Bakterienschaft</td><td>Cedarlan</td><td>11859</td><td>-80 Grad C-Bestand an S. pasteurii, ATCC-Nr. wird gegen Kat. Nein.</td></tr><tr><td>Mline Einkanal-Mechanikpipetten mit variablem Volumen</td><td>Biohit</td><td>725010</td><td>Vermarktet von VWR unter der Katalognummer 14005976</td></tr><tr><td>Mikropipettenspitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>212772B</td><td>Wird zum Kratzen von Agarplatten</td></tr><tr><td>verwendet Inkubator Binder</td><td></td><td>80079098</td><td>Mikrobiologie-Inkubator, Schüttelinkubator der BF-Serie</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>14004300</td><td>VWR Signature Tischschütteln Inkubatoren</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Express Pipettierhilfe Pipettiergerät</td><td>BD Biosciences</td><td>357590</td><td>Vermarktet von VWR unter der Katalognummer</td></tr><tr><td>53106220 Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>Zur Versiegelung von Agarplatten</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1250</td><td>Anreicherung für Nährmedium</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td>Anreicherung für Nährmedium</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Anreicherung für Nährmedium</td></tr></tbody></table>

mikrobiologisch induzierte calcitausfällung vermittelt durch<em&gt; sporosarcina pasteurii</em

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Die besondere Bakterium untersuchten hier (S. pasteurii) ist einzigartig in seiner Fähigkeit, unter den richtigen Bedingungen, die Hydrolyse von Harnstoff (Ureolyse) zu induzieren in natürlich Umgebungen durch Sekretion eines Enzyms Urease auftritt. Dieser Prozess der Ureolyse, durch eine Kette von chemischen Reaktionen, führt zur Bildung von Calciumcarbonat ausfällt. Dies wird als Mikrobiologisch Induzierte Calcitausfällung (MICP) bekannt. Die richtigen Kulturprotokolle für MICP werden hier detailliert beschrieben. Schließlich wurden Experimente Visualisierung unter verschiedenen Modi Mikroskopie verschiedene Aspekte des Fällungsverfahren zu verstehen. Techniken wie optische Mikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) wurden die Endprodukt chemisch zu charakterisieren, verwendet. die Fähigkeit dieser Präzipitate weiter auf Poren in einem natürlichen porösen Medium verstopfen wurde, in dem Schwamm durch ein Experiment zeigte, qualitativeStäbe wurden mit einem Porennetzwerk mit einer Reihe von Längenskalen zu imitieren verwendet. Ein Schwamm bar eingetaucht in das Kulturmedium die Bakterienzellen enthält, härtet aufgrund der Verstopfung seiner Poren aus dem kontinuierlichen Verfahren der chemischen Fällung führt. Diese gehärteten Schwamm bar eine überlegene Festigkeit, wenn sie mit einem Steuer sponge bar verglichen, die unter der Wirkung eines aufgebrachten externen Last zusammengedrückt wird und komprimiert, während die ausgehärtete bar in der Lage, das gleiche Gewicht mit wenig Verformung zu unterstützen.

S. pasteurii ein alkali 24 sein kann relativ harten Bedingungen überleben. Wenn das oben erwähnte Kulturprotokoll folgt, und S. pasteurii ist innerhalb einer Kammer gezüchtet, die Bakterien führt zur Ausfällung von Calciumcarbonat über die Zeit (2A), Fig . 2 (b) zeigt eine Phasenkontrastlichtmikroskopische Aufnahme der bakteriellen Zellpopulation innerhalb des Kulturmediums. Einzelne Zellen können klar unters...

Protokolle für die mikrobiologisch induzierte Calcitfällung (MICP) mit dem Bakterium Sporosarcina pasteurii werden hier vorgestellt. Das gefällte Calciumcarbonat wurde mittels optischer Mikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie (REM) charakterisiert. Es wird auch gezeigt, dass die Exposition gegenüber MICP die Druckfestigkeit des Schwamms erhöht.

Mikrobiologisch Induzierte Calcitausfällung Vermittelt durch<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Ausfällung von Calcit in einer ruhenden Kultur von Sporosarcina pasteurii zu induzieren. Diese Methode kann uns helfen, zentrale biophysikalische Fragen zur von Sporosarcina pasteurii vermittelten Calcitausfällung zu beantworten, beispielsweise bezüglich der relevanten Längen- und Zeitskalen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die komplexen Schritte zur geeigneten Kultivierung und Anreicherung von Sporosarcina pasteurii standardisiert und somit eine zuverlässige Calcitausfällung gewährleistet.Als Erstes Petrischalen, Kolben, Tris-Basis, HCl, Agar, Millipore-Wasser und ein pH-Meter zusammenstellen. Alle Behälter vor der Verwendung durch Autoklavieren bei 121 Grad Celsius sterilisieren. Einen Liter einer 0,13-molaren wässrigen Lösung von Tris-Puffer herstellen, indem 15,75 Gramm Tris-Basis mit einem Liter Millipore-Wasser vermischt werden. Fügen Sie etwa 2,8 Milliliter 50 %iger HCl hinzu, um den Puffer auf einen pH-Wert von neun einzustellen. Sobald die Kultur bereit ist, muss sie angemessen mit dem richtigen Puffer angereichert werden. Dieser Schritt ist entscheidend für den Erfolg des Experiments, da das Versäumnis, das geeignete chemische Milieu bereitzustellen, zu sehr langen Zeitskalen der Ausfällung oder sogar zu einer vollständigen Ausbleibung führen kann.Als Nächstes teilen Sie den einen Liter Puffer wie folgt in zwei Teile auf. In einer 400-Milliliter-Aliquotportion lösen Sie acht Gramm Ammoniumsulfat auf. In einer zweiten 400-Milliliter-Aliquotportion lösen Sie 16 Gramm Hefeextrakt auf.Mischen Sie in 100 Milliliter Puffer zwei Gramm Ammoniumsulfat und geben Sie in die letzten 100 Milliliter Puffer vier Gramm Hefeextrakt und vier Gramm Agar hinzu. Nachdem die Kolben in Aluminiumfolie eingewickelt wurden, autoklavieren Sie die vier Lösungen. Unmittelbar nach dem Autoklavieren stellen Sie die beiden 400-Milliliter-Lösungen beiseite.Vereinigen Sie die beiden 100-Milliliter-Lösungen, mischen Sie sie gründlich und verteilen Sie sie auf 10 bis 12 Petrischalen. Zum Kultivieren bakterieller Proben entnehmen Sie die Bakterienstammlösung aus dem minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank und lassen Sie sie vollständig auftauen. Anschließend bringen Sie sie zusammen mit einer Agarplatte in die Sicherheitswerkbank.Wählen Sie eine Mikropipette mit dem niedrigstmöglichen Volumen und tauchen Sie eine Mikropipettenspitze in den Sporosarcina pasteurii-Stamm, bevor Sie mit der Spitze eine Agarplatte beimpfen. Inkubieren Sie die Platte bei 31 Grad Celsius für 48 Stunden und untersuchen Sie sie anschließend visuell auf das Vorhandensein einzelner Kolonien. Falls keine vorhanden sind, inkubieren Sie weitere 24 Stunden.Wiederholen Sie die Überprüfung und Inkubationen, bis Einzelkolonien nachgewiesen werden. Zum Herstellen der endgültigen Bakterienkulturen mischen Sie die beiden zuvor sterilisierten 400-Milliliter-Lösungen in einem sterilisierten Becher und überführen 125 Milliliter in einen Kolben. Führen Sie eine visuelle Untersuchung der Agarplatte durch, um Bereiche mit hohen Konzentrationen einzelner Kolonien zu identifizieren.Mit einer Mikropipettenspitze vorsichtig eine der Kolonien anstoßen und aufbrechen. Anschließend dieselbe Spitze in den 125-Milliliter-Kolben eintauchen und gründlich umrühren, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anzahl von Zellen übertragen wird. Den Kolben in einen schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius und 150 U/min für zwei bis drei Tage stellen.Um eine endgültige Zellanzahl zu bestimmen, zeichnen Sie sieben parallele, gleichmäßig verteilte, fett gedruckte Linien auf die Unterseite einer der Agarplatten, sodass sie von oben sichtbar sind. Geben Sie drei kleine Tropfen von jeweils etwa zehn Mikrolitern unverdünnter Kultur in ein Segment. Geben Sie ein Milliliter unverdünnter Kultur zu neun Millilitern sterilisierter PBS, um eine Verdünnung im Verhältnis 1:10 zu erhalten.Danach drei kleine Tropfen der Verdünnung auf ein zweites Segment der Platte geben. Die verdünnte Kultur in einen neuen Kolben überführen und mit PBS zusätzlich zehnmal auf zehn hoch minus zwei verdünnen. Den Ausstrich- und Verdünnungsvorgang wiederholen, bis eine Verdünnung von mindestens zehn hoch minus sieben erreicht ist, um sicherzustellen, dass Einzelkolonien erhalten werden.Die Platte einen bis zwei Tage bei 31 Grad Celsius inkubieren, bevor die Kolonien in jedem Abschnitt der Platte gezählt werden. Neun Milliliter der hergestellten Flüssigkultur in mehrere sterilisierte Zentrifugenröhrchen mit zehn Milliliter überführen. 100 Milliliter der externen Anreicherungs-Stammlösung herstellen, indem man mit einer Analysenwaage sorgfältig zwei Gramm pro Liter Harnstoff, ein Gramm pro Liter Ammoniumchlorid, 212 Milligramm pro Liter Natriumbicarbonat und 280 Milligramm pro Liter Calciumchlorid abwiegt.In einen Becher mit frischem Medium geben Sie alle Zutaten bis auf Harnstoff und autoklavieren Sie diese. Nach dem Autoklavieren mischen Sie den Harnstoff mit einem Milliliter frischem Medium und filtrieren die Lösung durch eine Spritze, die mit einem 0,2-Mikrometer-Filter ausgestattet ist, bevor Sie sie dem Anreicherungsmedium hinzufügen. Geben Sie einen Milliliter des Anreicherungsmediums mit Zusätzen in die sterilisierten Zentrifugenröhrchen, die neun Milliliter des hergestellten Kulturmediums enthalten.Vortexen Sie jedes Reagenzglas und inkubieren Sie es in einem nicht schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius. Überwachen Sie alle Einheiten regelmäßig auf Einleitung der Fällung. Sobald die Fällung mit bloßem Auge erkannt wird, überführen Sie ein kleines Flüssigkeitsvolumen in ein Kammerobjektträger-System mit hoher Vergrößerung für die Mikroskopie.Zunächst bei 4facher Vergr&ouml;&szlig;erung betrachten, um einen gro&szlig;en Bereich zu &uuml;berblicken, bevor die Vergr&ouml;&szlig;erung schrittweise erh&ouml;ht wird. F&uuml;hren Sie die F&auml;rbung und die REM-Experimente gem&auml;&szlig; dem schriftlichen Protokoll durch. Wenn S. pasteurii gem&auml;&szlig; dem in diesem Video dargestellten Protokoll kultiviert wird, f&uuml;hren die Bakterien zur Ausf&auml;llung von Calciumcarbonat, das sich im Laufe der Zeit am Boden des R&ouml;hrchens absetzt.Diese Abbildung zeigt Phasenkontrastaufnahmen einer deutlich abgegrenzten, stabförmigen Bakterienpopulation im Medium. Hier sind die scharf ausgeprägten Spaltflächen, ein Kennzeichen von Kristallinität, zu erkennen. Dieses Röntgenphotoelektronenspektroskopie-Diagramm derselben Probe enthält Peaks, die Carbonatgruppen entsprechen und auf das Vorhandensein von Calciumcarbonat hinweisen.Im diesem Panel gezeigtes ist ein unbehandelter Schwamm, der sich leicht komprimiert, wenn ein ein Kilogramm schweres Gewicht darauf ausgeübt wird. Wenn ein Schwamm sieben Tage lang in einer Calcitfällungslösung mit S. pasteurii getaucht und anschließend getrocknet wird, verhärtet er sich und zeigt eine verbesserte Druckfestigkeit aufgrund der Porenverstopfung durch Calcitfällung. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb weniger Stunden abgeschlossen werden, wenn alle Schritte ordnungsgemäß durchgeführt werden.Jedoch dauern die einzelnen Schritte zwar jeweils nur wenige Minuten, es gibt jedoch längere Wartezeiten dazwischen, in denen die Probe stunden- oder sogar tagelang inkubiert werden muss. Nach diesem Verfahren können mehrere andere Techniken wie zusätzliche Charakterisierungen durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise zur statistischen Verteilung polymorpher Formen in Calciumcarbonat. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein fundiertes und klares Verständnis dafür haben, wie man Sporosarcina pasteurii geeignet kultiviert, um eine ordnungsgemäße Anreicherung sicherzustellen, die die Calcitfällung gewährleistet, und wie man den Prozess mithilfe der Multimoden-Mikroskopie beobachten kann.Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Hochdruckautoklaven äußerst gefährlich sein kann, und daher müssen alle Vorsichtsmaßnahmen wie das vollständige Entlüften der Kammer und das Tragen von PSA gewährleistet sein, bevor dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Quelle: Bhaduri, S., et al., Mikrobiologisch induzierte Calcitfällung vermittelt durch Sporosarcina pasteurii. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Methode der Anreicherung von Sporosarcina pasteurii mit Harnstoff und Calciumchlorid, um die Ureaseaktivität auszulösen, was zur Bildung von sichtbaren Calcitkristallen durch mikrobiologisch induzierte Calcitfällung (MICP) führt.

Mikrobiologisch induzierte Calcitfällung durch Sporosarcina pasteurii

Es wurde eine Methode entwickelt, um bakterielle Endosporen aus komplexen mikrobiellen Gemeinschaften herauszufiltern, um maßgeschneiderte Kultur- oder molekulare Studien dieser Bakteriengruppe durchzuführen.

Physische Isolierung von Endospores aus Umweltproben durch gezielte Lyse von vegetativen Zellen

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Zwei-Wege-Valorisierung von Hochofenschlacke: Synthese von gefälltes Calciumcarbonat und Zeolithmaterialien Heavy Metal Adsorbent

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Sandige Bodenverbesserung durch mikrobiell induzierte Calcit-Fällung (MICP) durch Eintauchen

Die hier beschriebene Nachweismethode ist anpassbar für die Überwachung der pedogenen anorganischen Kohlenstoffbindung in verschiedenen landwirtschaftlichen Böden, die mit Erdalkalimetallsilikat-haltigen Gesteinen wie Wollastonit, Basalt und Olivin ergänzt werden. Diese Art der Validierung ist für Emissionsgutschriftenprogramme unerlässlich, von denen Landwirte profitieren können, die Kohlenstoff auf ihren Feldern binden.

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Sporosarcina pasteurii ist ein ureolytisches Bakterium, das Harnstoff in Karbonat und Ammonium aufspaltet. Das Karbonat verbindet sich mit Kalzium zu Kalziumkarbonat, wodurch ein Kristallgitter entsteht, das die umgebenden Partikel miteinander verankert, um Biozement herzustellen. Dies ist ein praktisches Protokoll für die Verwendung von 3D-gedruckten Formen zur Herstellung von Biozementziegeln, die für die Druckprüfung geeignet sind.

Herstellung und Analyse von Sporosarcina pasteurii Biozementziegeln unter Verwendung von kundenspezifischen 3D-gedruckten Formen für uneingeschränkte Kompressionstests

Wir synthetisierten sternförmigen Gold nanostars mit einem silbernen Saat vermitteltes Wachstum Methode. Der Durchmesser der nanostars reicht von 200 bis 300 nm und die Anzahl der Spitzen variieren von 7 bis 10. Die Nanopartikel haben eine große Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Modus im nahen Infrarot zentriert.

Gold Nanostar Synthesis mit einem Silver Seed vermitteltes Wachstum Methode

Erfahren Sie die mikrobiologisch induzierte Calcitausfällung mit Sporosarcina pasteurii für Biomineralisation und Materialwissenschaften. Diese Methode standardisiert die Kultivierung und erhöht die Druckfestigkeit von Schwämmen durch Calcitpräzipitation.

Mikrobiologisch Induzierte Calcitausfällung Vermittelt durch

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