Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen gewünschten DNA-Konstrukt an einer vorbestimmten Stelle in das bakterielle Chromosom einzubauen. Dies wird durch ein Kopulationsprotokoll erreicht, das vier genetisch veränderte Bakterienstämme umfasst. Der Empfängerstamm weist eine Landeplattform-Sequenz auf, die aus einem Spektinomycin-Resistenzgen und dem e coli Beta-Glucuronidase-Gen besteht, das von ATP-Seiten, die in das Chromosom integriert sind, flankiert wird.

Der P JH one 10-Donorstamm trägt ein Plasmid, das an B-Stellen ein flankierendes Stuffer-Gen für ein rotes fluoreszierendes Protein sowie ein Antibiotikaresistenzgen enthält. Der PJC two-Donorstamm trägt ein Plasmid, das die sequenzspezifische Integrationsenzyme des Streptomyces-Phagen C 31 unter Kontrolle des LAC-Promotors enthält. Der vierte Stamm MT 616 stellt die für die Konjugation erforderlichen Transfergene bereit, die den Plasmidtransfer von Zelle zu Zelle ermöglichen und zur Bildung von Transkonjuganten in den Rezipientenstämmen führen.

Erwerb der beiden Plasmide, die für den integrasenvermittelten Kassettenaustausch erforderlich sind. Der Austausch der Donorkassette aus dem PJ H one 10-Plasmid gegen die Marker der Landeplatzkassette auf dem Chromosom führt zum Verlust der Landeplatzmarker SPR und UIDA sowie zur Beibehaltung der Donorkassette RFP und GMR im resultierenden transimmigranten Organismus. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie der homologen Rekombination liegt in der Einfachheit und Effizienz des Protokolls.

Es ist außerdem auf eine breite Palette von Bakterien übertragbar. Der Akzeptorstamm, der in diesem Video verwendet wird, ist ein S. milli-Lattestamm, der zwei Tage vor dem Konjugationsverfahren zur Erzeugung von Transintegranten aus einer Einzelkolonie in fünf Milliliter TY-Medium mit Spektinomycin inoculiert wurde. Inkubieren Sie den S. milli-Stamm am Tag vor dem Konjugationsverfahren 48 Stunden bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Inokulieren Sie jeden der folgenden E. coli-Stämme in je fünf Milliliter flüssiges LB-Medium, ergänzt mit dem jeweils geeigneten Antibiotikum: DH5α, der das Integrations-Expressionsplasmid enthält, in Medium mit Tetracyclin; MT616, der Mobilisatorstamm, in Medium mit Chloramphenicol; und DH5α, der das Donorkassettenplasmid enthält, in Medium mit Gentamycin. Inkubieren Sie die drei E. coli-Stämme über Nacht bei 37 Grad Celsius mit kontinuierlichem Schütteln, um die Zellen für das Konjugationsverfahren vorzubereiten. Übertragen Sie 1,5 Milliliter jeder der vier Kulturen in ein Reagenzrohr und zentrifugieren Sie bei 17.000 × g für 30 Sekunden, um das Zellpellet zu gewinnen. Entsorgen Sie das Medium und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in einem Milliliter steriler 0,85 %iger Natriumchloridlösung. Zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut, nachdem Sie den Überstand verworfen haben. Resuspendieren Sie jedes Pellet in 100 Mikroliter steriler 0,85 %iger Natriumchloridlösung unter Verwendung einer Pipette. Geben Sie jeweils 10 Mikroliter der gewaschenen Kultur jedes Stammes als Tropfen auf eine reine TY-Agarplatte.

Diese Stellen sind Kontrollstellen. Geben Sie anschließend 40 Mikroliter jeder Stammkultur mit Ausnahme von E. coli DH5α, das Pjc2 enthält, in ein steriles Röhrchen und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Tragen Sie 120 Mikroliter dieser Mischung auf die reine TY-Agarplatte auf. Diese Stelle ist die negative Kontrolle ohne Integrationsenzym.

Fügen Sie abschließend 40 µL von jeder der vier Stämme in ein steriles Gefäß hinzu, mischen Sie gründlich und pipettieren Sie 160 µL dieser Mischung auf dieselbe TDY-Agarplatte. Dieser Fleck ist der Fleck für den integrationsvermittelten Kassettenaustausch.

Stellen Sie die Platte in eine laminare Luftstromabschirmung und lassen Sie die Auftragestellen etwa 20 Minuten lang trocknen. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 30 Grad Celsius am Tag nach dem Befruchtungsprotokollstrich. Die beiden Kontrollstellen und die IMCE-Befruchtungsstelle auf TY-Agarplatten, die mit Streptomycin und Gentamycin ergänzt wurden.

Der S-milli-Akzeptorstamm trägt eine Mutation, die eine hohe Resistenz gegen Streptomycin vermittelt, zur Berechnung der IMCE-Effizienz. Resuspendieren Sie etwa ein Viertel des IMCE-Konjugationspunkts in 500 µL steriler 0,85 %iger Natriumchloridlösung. Erstellen Sie zehnfache serielle Verdünnungen bis 10⁻⁷. Impfen Sie Verdünnungen von 10⁻² bis 10⁻⁵ auf TY-Agarplatten, die mit Streptomycin, Gentamycin und Xgl supplementiert sind, um Transimigranten auszuwählen. Impfen Sie Verdünnungen von 10⁻³ bis 10⁻⁷ auf TY-Agarplatten, die mit Streptomycin und Xgl supplementiert sind, um sowohl Transimigranten als auch potenzielle Rezipienten auszuwählen. Inkubieren Sie die Platten zur Bestimmung der Gesamtanzahl an Rezipienten bei 30 °C für drei Tage.

Beobachten Sie die RFP-Trans-Strukturen unter grünem Licht und durch einen roten Filter; berechnen Sie die prozentuale IMCE-Effizienz als CFU der transimmigrierten Zellen im Vergleich zu den CFU der gesamten Empfängerzellen. Etwa die Hälfte der Trans-Strukturen sollte nach drei Tagen Inkubation auf mit Streptomycin und Gentamycin supplementiertem Ty einem echten Austausch unterzogen haben, wodurch sie weiß und resistent werden. Bei den folgenden Kontrollstämmen sollte kein Wachstum auftreten: Kontrolle ohne Integrise, s. millilatte UW 2 27, Kontrolle E. coli MT616, Kontrolle E. coli DH5α, das pJH110 enthält, sowie Kontrolle E. coli DH5α, das pJC2 enthält. Im Gegensatz dazu sollte der IMCE-Abstrich von der Konjugationsstelle konfluentes Wachstum auf dem ersten Abstrich und zahlreiche Kolonien auf dem zweiten Abstrich zeigen. Diese beiden nächsten Bilder zeigen ReSuspensionen einer 10 zur Potenz minus zwei verdünnten Probe der Konjugationsstelle auf TY-Streptomycin-Xgl-Agar sowie auf TY-Streptomycin-Gentamycin-Xgl-Agar, und zwar auf TY-Streptomycin-Gentamycin-Xgl-Agar.

Die blauen Kolonien sind einzelne Rekombinanten. Während die weißen Kolonien Trans-Integrine darstellen, die einen echten Kassettenaustausch durchlaufen haben, zeigen sie unter grünem Licht und durch einen roten Filter betrachtet eine Tendenz zur negativen zwei Verdünnung der Befruchtungsstelle-Resus-Suspension auf TY-Strept-Cin-Xgl-Agar keine Fluoreszenz. Im Gegensatz dazu zeigt die 10 zur minus zwei Verdünnung der Befruchtungsstelle-Resus-Suspension auf Ty-Streptomycin-Gentamycin-Xgl-Agar zwei Fluoreszenzniveaus.

Die helleren Kolonien entsprechen blauen Kolonien und weisen einen höheren RFP-Ausdruck auf, vermutlich aufgrund einer Leseleitung vom LAC-Promotor im Vektor. Die weniger hellen Kolonien entsprechen weißen Kolonien, bei denen ein echter Kassettenaustausch stattgefunden hat, sodass das RFP nur unter der Kontrolle seines unmittelbaren Promotors vorliegt, ohne Leseleitung vom LAC-Promotor. Diese Kolonien sollten außerdem empfindlich gegenüber Spektinomycin sein.

Die Effizienz der trans-Integration, ausgedrückt als Prozentsatz der trans-integrierten Empfänger an der Gesamtzahl der Empfänger, sollte im Bereich von 0,5 % liegen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die bakterielle Konjugation unter Verwendung unserer konstruierten Stämme anwendet, um DNA-Konstrukte in das bakterielle Chromosom einzufügen.