Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

Eine schnelle und effiziente Methode, um Fremd-DNA von Interesse in vorgefertigte Akzeptor Stämme, sogenannte Landing-Pad-Stämme, die Integration beschrieben wird. Das Verfahren erlaubt eine ortsspezifische Integration eines DNA-Kassette in die gentechnisch Landeplatz Ort einer gegebenen Dehnung, durch Konjugation und Expression des ΦC31 Integrase.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein gewünschtes DNA-Konstrukt an einem vorher festgelegten Ort in das bakterielle Chromosom zu integrieren. Dies wird durch ein Paarungsprotokoll erreicht, an dem vier manipulierte Bakterienstämme beteiligt sind. Der Empfängerstamm hat eine Landeplatzsequenz, die aus einem spec Mycin-Resistenzgen und dem e coli beta Glucuronidase-Gen besteht, flankiert von ATP-Stellen, die in sein Chromosom integriert sind.

Der P JH one 10 Donorstamm trägt ein Plasmid, das an den B-Stellen, flankierend ein Stuffer, ein rot fluoreszierendes Proteingen und ein Antibiotikaresistenzgen enthält. Der PJC-Zwei-Donor-Stamm trägt unter der Kontrolle des LAC-Promotors ein Plasmid, das die ortsspezifische Integrase aus dem Streptomyces-Phagen C 31 enthält. Der vierte Stamm MT 616 liefert die Transfergene, die für die Konjugation erforderlich sind: Der Transfer von Plasmiden von Zelle zu Zelle führt zur Bildung von trans durch die Empfängerstämme.

Erfassung der beiden Plasmide, die für den Integrase-vermittelten Kassettenaustausch benötigt werden. Der Austausch der Spenderkassette aus dem PJ H 10 Plasmid mit den Markern der Landeplatzkassette auf dem Chromosom führt zum Verlust der Landeplatzmarker, SPR und UIDA und zur Aufrechterhaltung der Spenderkassette RFP und GMR bei dem resultierenden Trans-Immigranten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie der homologen Rekombination ist die Einfachheit und Effizienz des Protokolls.

Es ist auch auf eine Vielzahl von Bakterien übertragbar. Der in diesem Video verwendete Akzeptorstamm ist ein S-Milli-Latte-Stamm zwei Tage vor dem Paarungsverfahren zur Herstellung von Trans-Integrinen, inokulieren Sie aus einer einzigen Kolonie in fünf Milliliter TY-Medien mit Spect-Mycin, inkubieren Sie den S-Milli-Stamm zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie ihn am Tag vor dem Paarungsvorgang. Impfen Sie jeden der folgenden E-Coli-Stämme in fünf Milliliter LB-Flüssigmedium, ergänzt mit dem entsprechenden Antibiotikum DH five alpha, das die Integrase enthält, Expressionsplasmid in Medien mit Tetracyclin MT 616, dem Mobilisierer intermedia mit Chloramphenicol und DH fünf alpha, das die Donorkassette enthält, Plasmid in Medium mit Gentamycin, inkubieren die drei e Coli-Stämme über Nacht bei 37 Grad Celsius unter ständigem Schütteln, um die Zellen für den Paarungsvorgang vorzubereiten. Übertragen Sie 1,5 Milliliter jeder der vier Kulturen in ein Röhrchen und zentrifugieren Sie es 30 Sekunden lang bei 17.000 Mal G, um das Zellpellet zu sammeln, verwerfen Sie das Medium und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in einem Milliliter sterilem 0,85 %iger Natriumchlorid. zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut, nachdem Sie den Überstand verworfen haben. Resus: Suspendieren Sie jedes Pellet in 100 Mikrolitern sterilem 0,85 %igen Natriumchlorid mit einer Pipette. Spotten Sie jeweils 10 Mikroliter gewaschener Kultur. Auf eine glatte TY-Agarplatte abseihen.

Diese Spots sind Kontrollspots. Als nächstes fügen Sie 40 Mikroliter jedes Stammes hinzu, mit Ausnahme des E-coli DH fünf alpha, das Pjc zwei enthält, in ein steriles Röhrchen und mischen Sie es, indem Sie 120 Mikroliter dieser Mischung auf der einfachen TY-Agarplatte auf und ab pipettieren. Dieser Punkt ist die Negativkontrolle ohne Integrase.

Zum Schluss geben Sie 40 Mikroliter von jedem der vier Stämme in eine sterile Röhrchenmischung und geben Sie 160 Mikroliter dieser Mischung auf dieselbe TDY-Agarplatte. Dieser Spot ist der Integrase-vermittelte Kassettenaustausch-Paarungspunkt.

Legen Sie die Platte in eine Laminar-Flow-Haube und lassen Sie die Flecken danach ca. 20 Minuten trocknen. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 30 Grad Celsius am Tag nach dem Streifen des Paarungsprotokolls. Die beiden Kontrollspots und der IMCE-Paarungsspot auf TY-Agarplatten, ergänzt mit Streptomycin und Gentamycin.

Der S-Milli-Akzeptorstamm trägt eine Mutation, die eine hohe Resistenz gegen Streptomycin verleiht. Für die Berechnung der IMCE-Effizienz wird etwa ein Viertel des IMCE-Paarungspunktes in 500 Mikrolitern sterilem 0,85%-Natriumchlorid suspendiert. Gentamycin und XGL zur Auswahl für Trans-Immigranten. Plattenverdünnungen tendieren zu minus drei bis 10 bis minus sieben auf TY-Agarplatten, ergänzt mit Streptomycin und xgl, um sowohl für Trans-Einwanderer als auch für potenzielle Empfänger zu selektieren. IE Gesamtempfänger inkubieren die Platten drei Tage lang bei 30 Grad Celsius.

RFP trans unter grünem Licht und durch einen roten Filter anzeigen Berechnen Sie die prozentuale IMCE-Effizienz als KBE von Trans-Einwanderern im Vergleich zur KBE aller Empfänger, etwa die Hälfte der Trans wird einen echten Austausch durchlaufen haben, der sie weiß und unempfindlich macht, nach drei Tagen Inkubation auf Ty, ergänzt mit Streptomycin und Gentamycin, sollte es kein Wachstum in den folgenden Kontrollstämmen geben, keine Integrase-Kontrolle: s: milli latte UW 2, 27 Kontrolle, e coli, MT 616, Kontrolle, e coli, DH, fünf alpha, enthaltend, P, JH, eine 10 Kontrolle, und e coli, DH, fünf alpha, enthaltend PJC, zwei Kontrolle. Im Gegensatz dazu sollte der IMCE-Streifen vom Paarungsplatz aus ein konfluentes Wachstum auf dem Kopfstreifen und viele Völker auf dem zweiten Streifen aufweisen. Die nächsten beiden Bilder zeigen Reanimationssuspensionen einer Verdünnung von 10 bis minus zwei des Paarungsflecks auf TY Streptomycin xgl Agar und auf TY Streptomycin Gentamycin xgl Agar auf dem TY Streptomycin Gentamycin xgl Agar.

Bei den blauen Kolonien handelt es sich um einfache Rekombinanten. Während es sich bei den weißen Kolonien um trans-Integrine handelt, die bei Betrachtung unter grünem Licht und durch einen roten Filter einen echten Kassettenaustausch durchlaufen haben, fehlt es bei der tendenziell negativen Verdünnung der Paarungspunkt-Reanimationssuspension auf TY strept cin xgl Agar an Fluoreszenz. Im Gegensatz dazu zeigt die Verdünnung der Paarungspunkt-Wiederbelebungssuspension von 10 bis minus zwei auf Ty Streptomycin Gentamycin Xgl Agar zwei Fluoreszenzstufen.

Die helleren Kolonien entsprechen den blauen Kolonien und haben eine höhere RFP-Expression, vermutlich aufgrund eines Durchlesens des LAC-Promotors im Vektor. Die weniger hellen Kolonien entsprechen weißen Kolonien, die einem echten Kassettentausch unterzogen wurden und RFP nur mit seinem unmittelbaren Promotor und ohne Durchlesen durch den LAC-Promotor enthalten. Diese Trends Einwanderer sollten auch Flecken Mycin empfindlich sein.

Die Effizienz der Trans-Integration, ausgedrückt als prozentualer Anteil von Trans-Einwanderern an den Gesamtempfängern, sollte im Bereich von 0,5 % liegen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die bakterielle Konjugation mit unseren gentechnisch veränderten Stämmen nutzen können, um DNA-Konstrukte in das bakterielle Chromosom einzufügen.