Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Ort und die Struktur des Verkalkungsereignisses durch eine Kombination von optischen und elektronenmikroskopischen Methoden zu bestimmen. Dies wird durch die Überwachung des lebenden Röhrenlartwurms während der Metamorphose erreicht, dem Lebensstadium, das für die Verkalkung verantwortlich ist und mit Fluoreszenzindikatoren nachgewiesen werden kann, die für intrazelluläre pH- und Kalziumsignale empfindlich sind. Die intrazelluläre pH-Bildgebung ermöglicht es uns, die Konzentration von Protonen in und aus dem Zytoplasma während des Verkalkungsprozesses zu untersuchen.

Zu Beginn der intrazellulären pH-Bildgebung in den Larven der marinen Röhrenwürmer werden die kompetenten schwimmenden Larven mit dem intrazellulären pH-Indikatorfarbstoff SNARF-1 AM gefärbt. Die Larven werden dann in eine Schale mit IBMX mit Meerwasser mit einem dünnen Glasfenster gebracht und auf ein Fluoreszenzmikroskop gelegt, wo sie mit Licht mit einer Wellenlänge von 488 Nanometern getroffen werden, das vom Farbstoff absorbiert wird. Dabei werden 580 Nanometer und 640 Nanometer große Emissionen aus dem Farbstoff gesammelt. Aus den Verhältnissen dieser Werte können die Werte des intrazellulären pH-Werts berechnet werden.

Die optische Mikroskopie ermöglicht es uns, die Zeit und den Gewebebereich zu identifizieren, der mit einem höheren pH-Wert verbunden ist. Dies ist der erste Schritt, um die Zeitpunkte zu bestimmen, die für die weitere Analyse von Interesse sind. Im zweiten Schritt konservieren Sie den Röhrenwurm mit Fixiermitteln zu den für die Elektronenmikroskopie relevanten Zeitpunkten.

Ein neu mineralisierendes Lebensstadium wird mit Hilfe von REM-EDS-Kartierungen für das Kalziumsignal identifiziert. Dann werden die Regionen mit einem hohen Kalziumsignal mittels REM/EBSD gescreent, um das Vorhandensein von kristallinem Mineral zu identifizieren. Schließlich wird das Mineral mit einem fokussierten Ionenstrahl herausgeschnitten und ein Dünnschliff für die TEM-Beobachtung vorbereitet.

Dieser Schnitt wird verwendet, um ein selektives Flächenbeugungsmuster zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik oder einer herkömmlichen Testmethode wie der Röntgenbeugungsspektroskopie besteht darin, dass sie die direkte Beobachtung spezifischer Strukturen ermöglicht, die mit optischen und elektronenmikroskopischen Methoden beobachtet wurden, so dass diskrete Kalzifizierungsereignisse sowohl auf zeitlicher als auch auf räumlicher Ebene direkt untersucht werden können. Wenn die Verkalkung mit Kalzium- und intrazellulären pH-Indikatoren untersucht wird, können wir die Zeitskala dieser relevanten physiologischen Ereignisse identifizieren.

Die Konservierung der Probe zum richtigen Zeitpunkt ist entscheidend für eine erfolgreiche REM-Analyse. Bei der Suche nach dem ersten Ereignis der biologischen Verkalkung kann SEM/EDX verwendet werden, um die Elementverteilung von Kalzium zu untersuchen. Eine Stelle, an der mehr Kalzium vorhanden ist, kann auf das Vorhandensein von Kalziumkarbonat hinweisen, jedoch kann nur das Vorhandensein eines Röntgenbeugungsmusters bestätigen, dass eine kristalline Struktur vorhanden ist.

Solche Informationen können mit Hilfe von EBSD und TEM abgerufen werden. Die Elektronenrückstreubeugung ist eine kristallographische Charakterisierungstechnik zur Identifizierung von kristallinem oder polykristallinem Material, solange die Mikrostruktur und der REM-Winkel des Elektrons die Bragg-Beugungsbedingung erfüllen. Typischerweise werden rückgestreute Elektronen in einem Winkel von 70 Grad auf einer polierten Probe mit Korn- oder Kristallorientierungskarten gesammelt.

Für eine unpolierte Probe ist es schwierig, ein solches Map aus diesen unebenen Oberflächen zu erstellen, da nicht alle Serviceserien die EBSD-Winkelanforderungen erfüllen. In Form des Punktes IG kann jedoch immer noch ein Cacucci-Beugungsmuster von diesen unebenen Oberflächen erfasst werden, solange die EBSD-Winkelanforderung erfüllt ist. Das Cacucci-Beugungsmuster ist eine eindeutige Bestätigung dafür, dass das kristalline Mineral vorhanden ist.

Unsere Methode ist direkt und schnell und kann auf andere mineralisierende Gewebe übertragen werden. Hier wird ein fokussierter Ionenstrahl verwendet, um eine Mikroprobe herzustellen, was auch eine sehr direkte Methode zur Herstellung eines TEM-Schnitts ist. Um den Metamorphoseprozess zu untersuchen, wurden Röhrenwürmer etwa fünf Tage lang im Labor kultiviert.

Die kompetenten Larven schwimmen in Vorwärtsrichtung statt in einer kreisförmigen Bewegung. Das bedeutet, dass sie bereit für die Metamorphose sind. Inkubieren Sie kompetente Larven in der fluoreszierenden Lösung in Meerwasser, decken Sie die Behälter mit Folie ab, um Photobleiche zu verhindern, und brüten Sie die Tiere über Nacht aus.

Die Larven der Röhrenwürmer werden gegen das Nylonnetz gewaschen, das die Larven zurückhält, aber die Lösung durchlässt. Waschen Sie die Larven zweimal mit gefiltertem Meerwasser, um überschüssige Farbstofflösung zu entfernen. Drücken Sie das Sieb an die Petrischale, um eine dichte Versiegelung zu erzeugen, bevor Sie das Siegel lösen, um die Waschlösung zu verwerfen.

Achten Sie darauf, dass die Larven nicht austrocknen. Legen Sie dann jede der 10 bis 20 Larven in eine dünne Schale mit Glasboden mit IBMX und decken Sie die Schale bis zur Bildgebung ab. Setzen Sie anschließend die passenden Filterwürfel mit den entsprechenden dichroitischen Spiegeln ein, um die Fluoreszenzsignale zu detektieren.

Optimieren Sie die Verschlusszeit, um Bilder für einen lebenden Organismus aufzunehmen. Wählen Sie als Nächstes die Parameter für den optischen Schnitt in der Option Z-Stack aus und bewegen Sie den mikroskopischen Tisch nach oben und unten, um die Start- und Stoppposition der Bildaufnahme zu definieren. Legen Sie einen Abstand von einem Mikrometer zwischen den Schichten fest.

Exportieren Sie nach dem Imaging alle Daten als Graustufen-TIF-Dateien. Dies kann durch Auswahl von Datei, Exportieren erfolgen. Vergewissern Sie sich, dass die Dateitypen als TIF-Bilder angezeigt werden, und klicken Sie dann auf Start.

Das Graustufenbild in jedem Kanal, in jeder Ebene des Z-Stacks befindet sich im selben Bildordner und steht für die Bildanalyse bereit. Generieren Sie abschließend mit ImageJ ein Kompositbild für jeden der Fluoreszenzkanäle. Die folgenden JoVE-Videos zeigen, wie Kalibrierungen und Messungen des intrazellulären pH-Werts durchgeführt werden.

Konservieren Sie die Röhrenwürmer, die sich in der Metamorphose befinden, mit einem vernetzenden Fixiermittel unter Verwendung einer Lösung von 4%igem Paraformaldehyd in Meerwasser. Mischen Sie einfach einen Teil 16%iges Paraformaldehyd in drei Teile Meerwasser und lassen Sie die Fixierung über Nacht erfolgen. Entsorgen Sie das primäre Fixiermittel und fixieren Sie die Probe 30 Minuten lang in einer wässrigen Lösung von 1%Osmiumtetraoxid, um die Gewebestrukturen weiter zu stabilisieren.

Achten Sie darauf, in einem Abzug zu arbeiten und separate Abfallflaschen zu haben, die deutlich gekennzeichnet sind, bereiten Sie Formaldehyde und Osmiumtetraoxid vor. Als nächstes dehydrieren Sie die Proben mit einer abgestuften Ethanolreihe, wobei zwischen den Änderungen fünf Minuten liegen. Der nächste Schritt besteht darin, die Proben mit einer 1:1-Lösung aus Ethanol und HMDS zu dehydrieren, gerade genug, um die Probe zu bedecken.

Warten Sie, bis die Probe trocken im Abzug verdunstet ist, und wiederholen Sie dann den Vorgang mit reinem HMDS. Um einen kontrollierten Bruch der Probe zu erzeugen, führen Sie die Diamanttrennscheibe gegen die Schale und umschließen Sie einige Individuen, um einen dreieckigen Schnitt zu machen. Wenn die Petrischale abgedeckt ist, stellen Sie die Kulturschale gegen einen Aluminiumstummel und drücken Sie sie vorsichtig an, um einen kontrollierten Bruch zu erzielen.

Beobachte mit einem Präpariermikroskop und nimm vorsichtig ein Frakturstück auf, das ein paar intakte Röhrenwürmer enthält. Mit silberner Farbe die Probe auf den REM-Probenhalter kleben, die Ränder mit silberner Farbe bemalen, um die Aufladung zu reduzieren. Die Probe ist nun bereit, für die REM-EDS-Analyse abgebildet zu werden.

Setzen Sie die Probe in der Halterung in das Mikroskop ein. Richten Sie die Probe aus und platzieren Sie die Probe unter der Elektronensäule. Analysieren Sie die Probe im VP SEM-Modus.

Optimieren Sie den Fokus und den Astigmatismus nach Bedarf. Wählen Sie die Vergrößerung so, dass ein einzelner Organismus das gesamte Sichtfeld ausfüllt. Analysieren Sie die elementare Verteilung von Kalzium auf der Probe, indem Sie eine Karte des gesamten Sichtfelds erstellen, die Karte 15 Minuten oder länger laufen lassen oder bis die Daten eine deutliche Lokalisierung von Kalzium im Organismus zeigen.

Um eine Punktquantifizierung für einen Interessenbereich zu erhalten, wählen Sie die Option Punkt-ID mit dem Werkzeug Einzelner Punkt aus. Klicken Sie auf den gewünschten Bereich, um einen Scan durchzuführen. Zeichnen Sie den Standort sorgfältig auf, indem Sie eine Reihe von Bildern mit abnehmender Vergrößerung aufnehmen.

Um die Proben für EBSD vorzubereiten, nehmen Sie die Probe aus dem flachen REM-Halter und kleben Sie sie mit silberner Farbe auf einen um 45 Grad vorgeneigten Stummel. Anhand der Referenz-REM-Bilder lokalisieren Sie das Tier von Interesse und die genaue Region des zu untersuchenden Tieres. Kippen Sie den Tisch um 25 Grad, so dass die Probenoberfläche nun etwa 70 Grad zum Elektronenstrahl beträgt.

Heben Sie die Bühne an. Wählen Sie den EBSD-Modus in der AZtec-Software aus. Wählen Sie Aragonit als die interessierenden Phasen.

Setzen Sie die EBSD-Kamera ein, stellen Sie die Kamerabedingungen so ein, dass ein Signal von ca. 90 % erreicht wird. Erfassen Sie mit einem schnellen Strahlraster einen Hintergrund und nehmen Sie dann ein Bild in Aztec auf. Klicken Sie mit dem Spot-Analyse-Werkzeug auf die Stelle der Probe, die ein höheres Kalziumsignal gezeigt hat. Scannen Sie, um festzustellen, ob Cacucci-Muster erkannt werden.

Wenn Muster vorhanden sind und mit einer der ausgewählten Phasen in der Datenbank übereinstimmen, werden sie automatisch indiziert. Schützen Sie die vorbereitete REM-Probe mit einer Platinschicht durch Sputterbeschichtung, bevor Sie mit der Vorbereitung der Mikroprobe mit fokussiertem Ionenstrahl fortfahren. Setzen Sie die Probe in die FIB-REM-Kammer ein, positionieren Sie die Probe und nehmen Sie ein live, ioneninduziertes Sekundärelektronenbild auf.

Lokalisieren Sie den Interessenbereich aus den referenzierten Bildern, wie er zuvor durch EDS-Mapping in EBSD bestimmt wurde. Drehen Sie den Tisch nach Bedarf, um die interessierenden Merkmale mit dem Rahmen des Fensters in Einklang zu bringen, passen Sie die Vergrößerung an, um den Bereich anzuzeigen, um die gewünschten Merkmale aufzunehmen, und definieren Sie dann einen Kasten zum Ablegen von Kohlenstoff und Wolfram. Nehmen Sie einen FIB-Schnappschuss auf und zeichnen Sie dann ein Muster aus vier Kästchen um die Wolframkappe, um die Position der Mikroprobenahme zu definieren.

Kippen Sie dann den Tisch um 58 Grad und schneiden Sie durch den Boden der Mikroprobe. Kippen Sie den Tisch wieder auf Null, setzen Sie die Wolfram-Mikroprobenahmesonde ein und senken Sie sie ab, bis sie die Probe berührt. Verbinden Sie die Wolframsonde mit der Probe, indem Sie Wolfram zwischen der Spitze der Sonde und der Wolframbeschichtung abscheiden, dann den endgültigen Schnitt vornehmen, die Mikroprobe vom Rest der Insel lösen und die Sonde mit der beigefügten Mikroprobe anheben.

Platzieren Sie ein TEM-Kupfer-Halbgitter in einem seitlichen Eingangshalter, senken Sie die Wolframsonde ab, bis die Mikroprobe das TEM-Gitter berührt. Die Mikroprobe wird weiter gemahlen, bis sie elektronentransparent wird. Füllen Sie vor der TEM-Analyse beide Dewars mit flüssigem Stickstoff und stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 300 Kilovolt ein.

Legen Sie das Halbgitter mit den daran befestigten Lamellen in den Standard-TEM-Halter. Zentrieren Sie den Strahl auf dem Phosphorschirm, ziehen Sie den Strahl zusammen und dehnen Sie ihn aus und stellen Sie sicher, dass alle Strahlbewegungen konzentrisch sind. Verwenden Sie die Drehregler für die Tischbewegung, um das Sample zu navigieren und zu lokalisieren, die Vergrößerung des Samples zu erhöhen und die Z-Höhe einzustellen, bis das Sample scharf ist.

Verwenden Sie bei Bedarf die optischen Okulare. Setzen Sie die Kamera ein und entfernen Sie den Phosphorschirm. Erweitern Sie den Strahl nach Bedarf, um eine Übersättigung der Kamera zu vermeiden.

Passen Sie den Fokus und die Kameraparameter an, um ein Bild aufzunehmen. Um ein Beugungsmuster zu erhalten, zentrieren Sie das gewünschte Merkmal, entfernen Sie die Objektivblende und setzen Sie die Beugungsblende ein. Wechseln Sie in den Beugungsobjektiv-Modus.

Setzen Sie den Blinder ein, um zu verhindern, dass die Mitte des Beugungsmusters die Kamera oder den Phosphorschirm verbrennt. Nehmen Sie ein Bild des Musters für die kristallographische Analyse auf. Im Folgenden finden Sie einige Beobachtungen des Verkalkungsprozesses während der Metamorphose des Röhrenwurms.

Die pH-Werte der Röhrenwürmer stiegen nach der IBMX-Stimulation der Metamorphose an und der intrazelluläre pH-Wert begann nach 31 Stunden über acht zu steigen. Das für die Verkalkung relevante Gewebe ist die Kragenregion. Eine Karte auf den REM-EDS-Signalen zeigt, dass der Röhrenwurm am ersten Tag eine homogene Verteilung von Kalzium aufwies, was darauf hindeutet, dass der Verkalkungsprozess noch nicht begonnen hatte.

Zwei Tage nach der Metamorphose-Stimulation hatten einige Röhrenwürmer bereits zu stark verkalkt und sind nicht mehr geeignet, neu verkalktes Material zu beobachten. In einer Röhrenwurmprobe, wie der in diesem Beispiel verwendeten, befindet sich die Verkalkung noch in einem frühen Stadium, so dass die Kalziumquantifizierung dazu beitrug, den Ort zu bestimmen, der für die Charakterisierung des Vorhandenseins von Mineralien von Interesse ist. Bei der Untersuchung mit REM-EBSD wies der lokalisierte Bereich mit dem starken Kalziumsignal auch eine kristalline Struktur aus Aragonit auf.

Mit Hilfe eines fokussierten Ionenstrahls wurde die Probe für die TEM präpariert und das Beugungsmuster des Aragonitminerals detaillierter kristallographisch analysiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Mineralisierungsereignis in einem mehrzelligen Organismus lokalisiert. Wenn optische und Elektronenmikroskopie zusammen eingesetzt werden, können wir ein hohes Maß an physiologischem und materiellem Verständnis über den Prozess der Verkalkung erlangen.