Whisker-signalisierte Eyeblink Klassische Konditionierung in Head-Fest Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, genetische Fortschritte bei Mäusen und unser Verständnis des Schnurrhaarsystems zu nutzen, um die neurobiologischen Grundlagen der Augenblinzelkonditionierung zu untersuchen, ein übersetzbares Paradigma für die Untersuchung von Lernen und Gedächtnis. Diese Methode kann helfen, mechanistische Fragen des Lernens und des Gedächtnisses zu beantworten, indem Kalziumbildgebung und Elektrophysiologie bei genetisch manipulierten Mäusen verwendet werden, während bestimmte Schnurrhaare während der Konditionierung stimuliert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, die Köpfe von Mäusen zu sichern und gleichzeitig den Stress zu minimieren, indem die Mäuse in ihrem eigenen Tempo auf einem zylindrischen Laufband spazieren gehen können.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf mögliche Behandlungen von Gedächtnisstörungen, einschließlich solcher, die mit normalem Altern und der Alzheimer-Krankheit verbunden sind. Die Vorbereitung des Zylinders und des Whisker-Stimulationssystems sind jeweils im Textprotokoll enthalten. Dieser Abschnitt befasst sich mit der Vorbereitung des Kopfstücks.

Der Kopfstückstreifen ist ein 3D-gedruckter Sieben-Loch-Streifen, der dem Nylonstreifen der Amphenol 221-Serie nachempfunden ist und nicht mehr kommerziell hergestellt wird. Klopfen Sie vom 3D-gedruckten Stück aus das erste Loch in den Streifen für 0-80 mal einen Zoll Maschinenschraube und lassen Sie ein Loch nach dem ersten Loch leer. Stecken Sie dann mit einem Schraubstock fünf vergoldete Stifte in die restlichen fünf Löcher.

Schiebe die Stifte durch die schmaleren Löcher im Kunststoff. Entfernen Sie anschließend mit einem thermischen Abbeizmittel einen halben Zentimeter Polyimid-Beschichtung. Löten Sie dann das abisolierte Ende an einen der Stifte, wo der Stift eine Öffnung hat.

Schneiden Sie den gelöteten Draht auf sechs bis sieben Millimeter ab und isolieren Sie etwa zwei Millimeter des Drahtes ab. Wiederholen Sie nun diesen Vorgang, um insgesamt vier Drähte an die fünf Pins anzuschließen. Die ersten beiden Drähte zeichnen die EMG-Reaktionen der Augenlider auf, während die zweiten beiden eine elektrische Stimulation an die periorbitale Region abgeben.

Löten Sie einen nicht isolierten, fünf Zentimeter großen Edelstahldraht an den fünften Stift, der als elektrische Erdung dient. Nachdem Sie alle Verbindungen hergestellt haben, überprüfen Sie jeden von ihnen mit einem Multimeter, um ihre elektrische Kontinuität sicherzustellen. Beginnen Sie mit einem vollständig betäubten Tier, das durch ein Zehenkneifen bestätigt wird.

Injizieren Sie eine Dosis Buprenorphinhydrochlorid als Analgetikum. Tragen Sie dann eine kleine Menge Augensalbe auf die Hornhaut auf und rasieren Sie den Oberkopf des Tieres. Befestigen Sie anschließend den Kopf des Tieres an einem stereotaktischen Rahmen und desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei abwechselnden Peelings aus Povidon, Jod und Alkohol.

Machen Sie mit einer Skalpellklinge der Nummer 10 oder 15 einen Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut und legen Sie den Schädel von der Vorderseite der Augen bis hinter den interparietalen Knochen frei. Ziehen Sie die Hautlappen mit sechs Mikroclips zurück und legen Sie so viel wie möglich vom Schädel frei, einschließlich der Seiten und des Rückens. Als nächstes kratzen Sie mit dem Skalpell das Periostium vom Schädel ab.

Reinigen Sie dann die Oberseite des Schädels dreimal mit 3% Wasserstoffperoxid. Sobald der Schädel getrocknet ist, bohren Sie zwei Löcher mit einem umgekehrten Kegelbohrer der Größe 34 und achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu beschädigen. Platzieren Sie ein Loch vor dem Bregma und das andere Loch vor dem Lambda, links von der Mittellinie, wenn Sie das rechte Auge konditionieren, oder umgekehrt.

Diese Löcher sollten sorgfältig gebohrt werden, damit die Schrauben passen, und es sollten große Anstrengungen unternommen werden, um das Gehirn nicht zu beschädigen. In die Löcher stecken Sie Schrauben für die elektrischen Anschlüsse. Mit jeder vollen Umdrehung senkt sich die Schraube um 0,28 Millimeter, so dass zwei volle Umdrehungen ausreichen.

Erstellen Sie als Nächstes mehrere kleine Teilungen auf dem Schädel, um die Oberfläche für den Zement zu vergrößern. Wickeln Sie vom fertigen Kopfstück aus das Erdungskabel in einer Achterkonfiguration um die beiden Schrauben. Lassen Sie etwas Spiel im Erdungskabel, damit das Kopfstück richtig positioniert werden kann.

Tragen Sie nun kalten Befestigungszement auf. Beschichten Sie den Schädel und die Schrauben großzügig und lassen Sie den Zement trocknen. Sobald der Zement getrocknet ist, positioniere das Kopfstück senkrecht, wobei die Stifte über dem Schädel stehen.

Befestigen Sie das Kopfstück mit einer Halterung, die an einem Arm vom Rahmen befestigt ist. Der Halter muss fünf vergoldete Buchsen haben, um die Stifte des Kopfstücks aufzunehmen. Positionieren Sie die beiden EMG-Drähte an den Muscularis orbicularis oculi oberhalb der Augenhöhle.

Positionieren Sie dann die beiden Stimulationsdrähte. Legen Sie die abgestreiften Enden zwei bis vier Millimeter direkt kaudal zum Auge unter die Haut. Lasst ihre Enden nicht aneinander berühren.

Wenn die Drähte so lang sind, dass sie das Auge des Tieres zerkratzen könnten, schneiden Sie sie zurück oder biegen Sie sie zurück. Ein Teil des blanken Drahtes muss freiliegen. Zement nun die Basis der Drähte mit etwas mehr Befestigungszement an den Schädel und lass sie trocknen.

Verwenden Sie etwa die Hälfte des zuvor verwendeten Volumens. Um fortzufahren, entfernen Sie die Mikroclips und positionieren Sie die Haut neu. Lassen Sie die Haut sich auf natürliche Weise absetzen, um Spannungen auf der Haut zu vermeiden, die das Augenlid verzerren, das Blinzeln hemmen und somit das Experiment ruinieren würden.

Sobald sich die Haut beruhigt hat, entfernen Sie den Kopfstückhalter und versiegeln Sie die freiliegende Stelle mit Zahnzement. Vermeiden Sie es, Zement auf die Augen oder die Stifte des Kopfstücks zu tropfen. Verwenden Sie dann ein mit Zahnzementlösungsmittel angefeuchtetes Wattestäbchen, um den teilweise ausgehärteten Zement nach Bedarf zu glätten und zu manipulieren.

Sobald der Zement vollständig getrocknet ist, nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und lassen Sie es auf einer warmen Oberfläche erholen, bevor Sie es in seinen Heimatkäfig zurückbringen. Beginnen Sie mit der Gewöhnung von Mäusen, nachdem sie mindestens fünf Tage Erholungszeit hatten. Um die Maus zu sichern, halten Sie sie kurz am Schwanz fest, um sie hinter den Schultern einzuklemmen.

Hebe dann die Maus unter Bauch und Rumpf hervor. Befestigen Sie als Nächstes einen Verbinder an der Kopfhalterung und drehen Sie die Feststellschraube. Platzieren Sie dann die Maus vorsichtig auf dem Zylinder und halten Sie sie ruhig, während Sie den Stecker mit zwei Schrauben an den Stangen über dem Zylinder befestigen.

Lassen Sie dann die Maus los. Lassen Sie die Maus in den ersten beiden Sitzungen genauso lange an den Zylinder gewöhnen wie bei einer Konditionierungssitzung. Erfassen Sie während der Gewöhnung die spontane Blinzelfrequenz.

Setzen Sie die Mäuse außerdem dem Whisker-Vibrationsstimulator aus, ohne elektrische Stimulation anzuwenden. Mit dem Piezo-System nahe an der konditionierten Seite schieben Sie die Zähne des Kamms über einzelne Whisker. Wählen Sie für jede Sitzung die gleichen Schnurrhaare aus.

Fahren Sie dann mit dem klassischen Konditionstraining fort, wie es im Text vorgestellt wird. Acht bis zehn Wochen alte männliche C57 Black 6J-Mäuse wurden mit Spuren von Augenblinzelkonditionierung auf dem kopffixierten zylindrischen Laufband trainiert. Von jedem Versuch wurden EMG-Aufzeichnungen gemacht.

Die EMGs wurden rektifiziert und mit einer Zeitkonstante von 10 Millisekunden integriert und dann über alle Studien gemittelt. Die Entwicklung der konditionierten Reaktionen über 10 Trainingssitzungen zeigt, dass die Amplitude der Reaktion allmählich zunahm und die Reaktionslatenz kürzer wurde. Diese Evolution ist in den Reaktionen der pseudokonditionierten Mäuse nicht zu sehen, da die Reize in zufälliger Reihenfolge präsentiert werden.

Die Entwicklung gut getimter und damit gut erlernter konditionierter Reaktionen kann auch in den Histogrammen der Zeit bis zum Höhepunkt der Reaktion nach dem CS-Beginn gesehen werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Kopfstück vorbereiten, das Kopfstück chirurgisch in eine Maus implantieren und die Maus auf das zylindrische Laufband legen, um den kopffixierten Augenblinzel zu konditionieren. Ihre Mäuse sollten eine gute Lernkurve über die Tage hinweg aufweisen, während sie die Konditionierung erlernen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, wachsam zu bleiben, wenn es darum geht, die Not der Tiere zu beobachten. Es sollten geeignete Maßnahmen ergriffen werden, um den Stress für die Tiere zu minimieren.