Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Endosomen im dreidimensionalen Raum über die Zeit oder in vier Dimensionen genau abzubilden. Dazu werden zunächst die Schlangenmuskeln präpariert und das Gewebe in der Bildgebungsschale angeordnet. Der zweite Schritt besteht darin, das Gewebe mit vitalen Farbstoffen zu färben, um die Endosomenbildung anzuregen.

Als nächstes wird das Präparat in vier Dimensionen für eine oder mehrere neuromuskuläre Verbindungen abgebildet. Der letzte Schritt ist eine sorgfältige Datenanalyse, um das Verhalten von Makroendosomen zu charakterisieren. Letztendlich kann das Vorhandensein und die Bewegung von Endosomen im Laufe der Zeit innerhalb des präsynaptischen Raums durch vierdimensionale Fluoreszenzbildgebung nachgewiesen werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Bauchmuskel der Schlange nur eine einzige Faser dick ist, was die Erstellung qualitativ hochwertiger Bilder mit der Standard-Epi-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht. In diesem Protokoll werden Gewebepräparate von der Strumpfbandnatter verwendet. Reptiliengewebe sollte bei niedrigen Temperaturen aufbewahrt werden, damit es länger physiologisch bleibt und weniger bakteriell kontaminiert ist. Für die Färbung von lysosomalen Vitalfarbstoffen wird der Farbstoff von 1 bis 5.000 in kalter Reptilienringerlösung gelöst.

Um eine Endkonzentration von 0,2 Mikromolaren zu erhalten, geben Sie den Farbstoff zum Gewebe und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Waschen Sie das Tuch nach 15 Minuten mehrmals mit kalten Klingeltönen für alle FM 1 43-Färbungen. Montieren Sie die Probe vor dem Färben mit magnetischen Stiften in eine Bildgebungsschale.

Für die Zwecke dieses Videos wird nur die Färbung von FM 1 43 mittels Kaliumchlorid-Stimulation demonstriert. Der Farbstoff, der um eins bis 500 in Ringern mit hohem Kaliumchloridgehalt verdünnt wird, um eine Endkonzentration von sieben Mikromolaren zu erhalten, wird dem Gewebe zugesetzt, und dann wird das Gewebe bei vier Grad Celsius für maximal 30 bis 60 Sekunden inkubiert. Anschließend dreimal schnell mit kalten Klingeltönen für etwa eine Minute pro Spülgang waschen.

Alle Gewebe sollten so schnell wie möglich nach dem Färben abgebildet und mit kalter Ringerlösung gewaschen werden. Wenn ein inverses Mikroskop verwendet wird, verwenden Sie eine Bildgebungskammer, deren Boden ein dünnes rundes Deckglas enthält. Typischerweise sollte die Bildgebungskammer einen dünnen Edelstahlboden mit einem Durchmesser von 25 Millimetern haben.

Glasdeckglas mit der Dicke Nummer eins in der Mitte, um die Vorbereitung für die Bildgebung zu konfigurieren. Richten Sie ihn mit Magnetstiften so aus, dass der Muskel so gut wie möglich in der Bildgebungsschale zentriert und so flach wie möglich liegt. Bedecken Sie das Präparat mit einer kleinen Menge Ringerlösung.

Montieren Sie die Schüssel und platzieren Sie sie so nah wie möglich an der Mitte der Bühne. Wählen Sie ein geeignetes Objektiv, um die höchstmögliche 3D-Auflösung zu erhalten. Für alle Experimente in dieser Demonstration wird ein 63-fach-Wasserobjektiv verwendet.

Um mit diesem Vorgang zu beginnen, öffnen Sie das Imaging-Fenster in der Diasammlung 5.0. Mehrere Menüs sind hier in Registerkarten enthalten. Wählen Sie das 63 x Wasserobjektiv mit der zweiten Registerkarte Z.Stellen Sie das Z-Stapelintervall ein.

In diesem Beispiel wird ein Z-Schritt von 1,5 Mikrometern für die Live-Bildgebung verwendet. Wählen Sie die Bildrate im Zeitraffer aus. Eine optimale Rate ist eine Rate, die gerade ausreichend ist, um Änderungen im Laufe der Zeit, wie z. B. Bewegungsinteraktionen oder Fusionsereignisse, reibungslos zu beheben.

Beispiel: 10 Zeitpunkte im 32. Intervall für ein Zeitintervall von insgesamt fünf Minuten. Wählen Sie als Nächstes die gesamte Schärfentiefe aus, während das Terminal live manuell auf den oberen Rand des interessierenden Fokus fokussiert ist, und gehen Sie dann ein wenig darüber. Wählen Sie Set Top aus.

Fokussieren Sie langsam durch die Probe, bis alles unscharf ist. Auch hier geben die Anzahl der angezeigten Ebenen und Gesamtreisewerte die im Aufnahmefenster ausgewählte Schärfentiefe an. Wählen Sie das Optionsfeld Verwendete obere und untere Position, um die soeben ausgewählten Parameter für die Bildaufnahme zu übertragen. Starten Sie die Bildaufnahme.

Führen Sie alle Live-Bildgebungen für eine bestimmte Vorbereitung durch. Bewahren Sie alle Rohdatendateien auf, während die digitale Speicherung in der Regel kein Problem darstellt. Die Bearbeitungszeit ist auch bei schnellen PCs oder Workstations erheblich.

Aus diesem Grund stellen Sie beim Zuschneiden von Bildern in einen Interessenbereich sicher, dass sich der gesamte Interessenbereich während der gesamten Zeit im zugeschnittenen Fenster befindet. Kurs D kann Bildstapel mit geeigneter Software und der richtigen Punktspreizungsfunktion einbeziehen, bestätigen, dass die Auflösung verbessert wurde und dass kein Artefakt durch den Dekonvolutionsalgorithmus erzeugt wurde. Verwenden Sie einen Interpolationsalgorithmus, um die Z-Achse zu erweitern.

Als scheinbare Auflösung wird eine sechsfache Erweiterung von einem tatsächlichen Abstand von 1,5 Mikrometern in der Bildebene zu einem scheinbaren Abstand von 0,25 Mikrometern vorgeschlagen. Führen Sie Kontrasthelligkeit, Rauschfilterung, Fotobleiche und andere typische Bildverarbeitungsanpassungen durch. Falls gewünscht.

Die Standards für die Bildmanipulation schreiben vor, dass es für die meisten wissenschaftlichen Arbeiten angemessen ist, die gleichen Korrekturen auf alle Bilder sowohl innerhalb eines Stapels als auch zu unterschiedlichen Zeitpunkten anzuwenden. Die Folgen einer bestimmten Anpassung sollten bei allen Bildern bewertet werden. Experimentieren Sie mit verschiedenen Filter- und Bildverbesserungstechniken.

Zum Beispiel ist lelos und Filterung nützlich, um den Kontrast von kleinen Strukturen über dem Hintergrund zu erhöhen. Die Helligkeit von Pixeln in der Mitte eines laufenden Fensters wird erhöht, während die Helligkeit der umgebenden Bereiche reduziert wird. Beachten Sie, dass einige Filtermethoden in Kombination nicht gut funktionieren.

Wenden Sie die Driftkorrektur an, wenn sich das Präparat im Laufe der Zeit stark bewegt. Eine solche Bewegung ist bei lebenden Muskeln üblich, selbst wenn Medikamente zur Unterdrückung von Aktionspotentialen und synaptischen Potentialen hinzugefügt werden. Ein Pixelregistrierungsalgorithmus richtet die Zeitrafferbilder aus und kann solche Bewegungen reduzieren, aber in der Regel nicht vollständig eliminieren.

In dieser Studie wurde eine Vier-D-Live-Bildgebung von neuromuskulären Terminaldigungen von Schlangen verwendet, um zu bestimmen, ob sich Makroendosomen oder me in Richtung der Plasmamembran bewegen und schnell verschwinden, was darauf hindeutet, dass ihre Anzahl abnimmt, weil einige von ihnen Zugang zu Zyto haben. Die Daten werden als 3D-Volumenansichten zu sechs Zeitpunkten mit einem Frame-Intervall von 60 Sekunden angezeigt. Um die Z-Tiefe eines einzelnen Butons zu veranschaulichen, kann beobachtet werden, wie sich ein me von der Y-Achse entfernt, die durch die rote gestrichelte Linie über mehrere Frames angezeigt wird, bevor es zwischen den Zeitpunkten fünf und sechs verschwindet, dass die für das Verschwinden erforderliche Zeit kürzer war als das Frame-Intervall, was mit der Exozytose kurz vor dem Verschwinden übereinstimmt.

Das ME scheint sich an der Plasmamembran des Stabes zu befinden. Das gleiche Rohdataset wird als nächstes als Film mit geringerer Vergrößerung angezeigt. Die Sequenz wird zu Beginn von jeweils 24 3D-Rotationsschritten um die Y-Achse kurz pausiert, um auf das bald verschwindende Ich aufmerksam zu machen, das durch den roten Pfeil angedeutet wird.

Beachten Sie, dass das ME sichtbar ist, wenn es sich dem Rand des Butons nähert, verschwindet und nicht in allen Betrachtungsperspektiven zurückkehrt. Aufgrund der geringeren Auflösung der Z-Achse im Vergleich zur XY-Auflösung scheint sich die Form des ME je nach Betrachtungsperspektive zu verlängern und zu verkürzen. Elektronenmikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass Endosomen in motorischen Terminals nahe der Beugungsgrenze des Lichts klein sind.

Daher kann die Fusion dieser Endosomen nicht absolut von einer engen räumlichen Assoziation auf Lichtebene unterschieden werden. In dieser Studie wurden Mees mit FM 1 43 markiert, das in grün angezeigt war, und saure Endosomen oder AEs wurden mit einem lysosomalen markiert. Vitale Farbstoffe, die in roten Daten von einem Zeitpunkt eines Vier-D-Films angezeigt werden, werden als 3D-Volumenansichten in drei Ausrichtungen angezeigt.

Die oberen Felder eins bis drei zeigen die konventionelle Ansicht von oben auf der XY-Ebene. Die mittleren Felder vier bis sechs zeigen eine Ansicht senkrecht zur XY-Ebene und in Richtung des großen roten Pfeils. Die unteren Felder sieben bis neun zeigen eine Ansicht, die senkrecht zu den beiden Ansichten oben in Richtung des großen blauen Pfeils steht.

Ein me wird durch einen grünen Pfeil markiert und zwei AEs sind mit roten Pfeilen markiert. Strukturen, die in beiden Farben fluoreszierten und gelb erschienen, wurden gelegentlich in vier D-Bildaufzeichnungen vermerkt. In diesem Beispiel ist ein Endosom, das beide Farbstoffe enthält, durch einen gelben Pfeil in den Feldern drei, sechs und neun gekennzeichnet.

Die Überlappung von Rot und Grün ist in allen drei orthogonalen Projektionen gleichermaßen vollständig, was auf ein vermeintliches verschmolzenes em me ae hinweist. In diesem Film wird dasselbe Dataset gezeigt, das so konfiguriert ist, dass es sich mit einem Frame pro Sekunde auf der Y-Achse dreht. Das mutmaßliche fusionierte MEAE bleibt aus allen Perspektiven gelb.

Die digitale Dekonvolution ist ein nützliches Werkzeug, um die Auflösung von 3D- und Vier-D-Bildern zu verbessern. Hier wird ein Vergleich zwischen Rohdaten und dezentralen Daten gezeigt. Für eine typische Schlangennervenbeendigung, die während der Stimulation mit FM 1 43 Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 bis 60 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Kolokalisation von Makroendosomen mit präsynaptischen Markern zu beantworten.