Name: Reinigung und Rückfaltung an Amyloidfibrillen von (His) 6 -markierte Recombinant Protein Shadoo als Einschlusskörper in Ausgedrückt E. coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung und Rückfaltung von rekombinantem Shadoo-Protein aus E. coli-Einschlusskörpern in Amyloidfibrillen. Diese zweistufige chromatographische Methode ermöglicht schnelle, kostengünstige Proteinreinigung für die Forschung zu Proteinfehlfaltungskrankheiten.

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Die Autoren danken Natalie Doude und David Westerway (University of Alberta) für die Bereitstellung von Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) für die Plasmidkonstruktion, Michel Brémont (INRA) für die Bereitstellung von BL21Sol-Bakterien; Christine Longin (INRA) für die TEM-Unterstützung und Edith Pajot-Augy (INRA) für Kommentare und Korrekturlesen.

1. Erzeugung von Plasmid und Expression Shadoo Hinweis: Das Gen, das murine Shadoo Protein (Shadoo 25-122), wurde in den Expressionsvektor pET-28 11 subkloniert. Dieser Klon wurde in den E. transformierten coli SoluBL21 Bakterienstamm, um Shadoo Protein mit einem N-terminalen Hexahistidin-Tag, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG) zum Ausdruck bringen, wie zuvor 11 erläutert. Das Plasmid kann von den Autoren angefragt werden. Das Molekulargewicht des Shadoo aus seiner Aminosäuresequenz berechneten 12,243.2 Da. Hinweis: Führen Sie alle Manipulationen mit Bakterien unter dem laminal Flow-Haube oder in der Nähe Bunsenflamme. <ol><li> Transformieren kompetenter SoluBL21 Bakterien mit dem pET-28-His 6 -Shadoo Plasmid, mit einem Standard-Hitzeschockprotokoll. Für diese Mischung 1 bis 5 &amp; mgr; l der Plasmid (typischerweise 10 bis 100 pgng) in 50 &amp; mgr; l der Bakterien in einem Rohr. Führen Sie den Hitzeschock bei 42 ° C für 45 sec. </li><li> Kultur transformierter Bakterien bei 37 ° C, bis ein 600 0,5-0,7 in Luria-Bertani-Medium mit 40 mg / ml Kanamycin (1B) ergänzt. </li><li> Induzieren Shadoo Expression O / N durch Zugabe von 240 &amp; mgr; g / ml Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, ITPG, zu der Kultur. Kultur des Bakteriums unter Schütteln bei 150 Upm bei 37 ° C. Anmerkung: In der Regel reicht von 3 A 600 O / N-Bakterienkultur. Anmerkung: Die transformierten Bakterien können bei -80 ° C für zukünftige Proteinproduktion gespeichert werden. Dazu fügen Sie 10% -50% (v / v) steriles Glycerin in Bakterienkultur Aliquots und frieren Sie sie bei -80 ° C. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schema der Shadoo Expressionskonstrukt, Bakterien Transformation und Induktion von Shadoo Ausdruck (wie in Schritt 1 beschrieben). </strong&gt; (A) Das Expressionskonstrukt für Shadoo codiert ein Hexahistidin-Tag an den N-Terminus des Proteins, Nt fusioniert. Das Schema zeigt, dass Shadoo Protein enthält grundlegende Arginin / Glycin-Repeats (grünen Zylinder), eine hydrophobe Domäne (HD) und eine einzige N-Glykosylierungsstelle (CHO), gefolgt von einem C-Terminus (Ct). (B) pET-28-His 6 -Shadoo Plasmid in SoluBL21 Bakterien durch Hitzeschock für 45 Sekunden bei 42 ° C umgesetzt. Transformierten Bakterien werden auf selektivem Agar, der 40 ug / ml Kanamycin ausplattiert. Eine einzelne Kolonie von der Platte verwendet, um eine Kultur in einem 1000-3000 ml-Schüttelkolben zu inokulieren. Die Expression des rekombinanten Proteins ist mit 1 mM IPTG induziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Reinigung von Shadoo Protein durch Niederdruck-Flüssigchromatographie (LPLC) <ol><li> Zell-Lyse und Inschluss Gremien Vorbereitung <ol><li> Sammeln Sie die Bakteriensuspension und übertragen sie in Zentrifugenröhrchen (Abbildung 2). </li><li> Schleudern bei 2.500 xg für 20 min bei 4 ° C. Überstand durch Dekantieren zu entfernen und resuspendieren Pellets in 15 ml Puffer (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 mit Anti-Protease-Cocktail) für jeden Pellets aus 500 ml Zellkultur abgeleitet ist. Anmerkung: Die resuspendierten Pellets können eingefroren und bei -20 ° C für mehrere Tage gelagert werden. Freezing erleichtert Bakterienzellen-Lyse. </li><li> Überprüfen Sie die Überexpression des rekombinanten Proteins mit rohen Bakterien Pellets durch SDS-PAGE-Analyse und Coomassie-Färbung. <ol><li> Hierzu Zentrifugen 1 ml Bakterienkultur pelleZellen. 100 ul Laemmli Denaturierungslösung (277,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4,4% SDS, 44,4% w / v Glycerol, 0,02% Bromphenolblau) pelletiert und Wärme bei 100 ° C für 5 min. </li><li> Last 10 ul der Probe auf einem 12% Acrylamidgel laufen SDS-PAGE und visualize getrennten Proteine ​​durch Coomassie-Färbung. </li></ol></li><li> Hinzufügen Triton X-100 auf 0,5% Endkonzentration in die vollständig resuspendierten Pellets 2.1.2). </li><li> Inkubieren der Suspension in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Beschallen der Suspension für 5 min bei 6-12 &amp; mgr; m Spitze-zu-Spitze-Amplitude in eiskaltem Wasser, um bakterielle Zellen zu lysieren. </li><li> Transfer beschallte Suspension in sauberen 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand entfernen durch Dekantieren und 5 ml des Bindungspuffers (20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff, 5 mM Imidazol) pro Röhrchen. </li><li> Die Röhrchen auf dem sich drehenden Rad O / N komplett resuspendieren Proteine ​​aus Einschlusskörpern. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schema der Reinigung von EinschlussKörpern (wie in Schritt 2.1 beschrieben). Die transformierten Bakterien exprimiert Shadoo werden durch Zentrifugation geerntet und in Lysepuffer resuspendiert. Die Suspension wird bei 37 ° C für 30 min inkubiert und dann beschallt, um Bakterienzellen mechanisch zu brechen. Beschallung auf Eis durchgeführt, um Probenerwärmung zu verhindern. Gebrochenen Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und in einem Puffer, der 8 M Harnstoff, um Proteine ​​aus Einschlusskörper solubilisiert resuspendiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </li><li> Ni 2+ -Affinitätschromatographie Anmerkung: Die Chromatographie an FPLC-System unter Verwendung einer Ni 2+ -charged, 5 ml Sepharose chelatbildende Säule (3A) durchgeführt. Alle Lösungen werden auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min geladen. <ol><li> Injizieren von 10 ml 0,2 M NiSO 4 Wasserlösung in die Säule Sepharose, um sie aufzuladenmit Ni 2+ -Ionen. </li><li> Äquilibrieren der Säule mit Ni 2+ -Ionen geladenen durch Injektion von 30-50 ml des Bindungspuffers, der eine niedrige Konzentration an Imidazol (20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff, 5 mM Imidazol). </li><li> Laden Sie die Harnstoff solubilisiert Proteine ​​mit einer 50 ml Injektionsschleife. </li><li> Wiederherstellung der Durchflussfraktion durch gründliches Waschen der Säule mit 10 ml niedrig Imidazol Bindungspuffer (20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff, 5 mM Imidazol), um ein Maximum von ungebundenen Proteine ​​zu entfernen von der Säule. </li><li> Mit 50-100 ml des Waschpuffers (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff, 80 mM Imidazol), Proteine ​​unspezifisch an die Säule gebunden eluieren Die Säule wird. </li><li> Anwenden eines 15 min Gradienten von 80-800 linearen mM Imidazol in Puffer, der 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff. Sammeln Sie 1-ml-Fraktionen während der Gradienten-Anwendung. Hinweis: His-Tag-Proteine ​​eluiert witha Gradienten von Imidazol enthaltenden Puffer (als Konkurrent verwendet). </li><li> Werfen Sie einen 8-ul-Aliquot jeder Fraktion und fügen Sie 4 ul 4x Laemmli Denaturierungslösung (siehe 2.1.3.1). Hitzelösungen bei 100 ° C für 5 min. </li><li> Last 10 ul Proteingrößenmarker und 10 ul jeder Probe auf den 12% igen Acrylamidgel laufen SDS-PAGE und sichtbar getrennten Proteine ​​durch Coomassie-Färbung. Hinweis: Das Molekulargewicht Shadoo berechnet bilden seine Aminosäuresequenz ist 12,243.2 Da. </li><li> Pool alle Fraktionen, die Shadoo. </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig3.jpg" /> Abbildung 3. Reinigungsverfahren (wie in den Schritten 2.2-2.4 beschrieben). (A) Ni 2+ -Ionen durch Histidinreste, die die selektive Reinigung von Polyhistidin-markierte Proteine ​​können koordiniert werden. Imidazol wird verwendet, um das Protein zu eluieren, durchseine Fähigkeit, mit der Ni 2+ -Ionen koordinieren und verdrängen das gebundene Protein. (B) Proteine ​​mit unterschiedlichen hydrodynamischen Radius, der auf der Ni 2+ -Säule auf einer Größenausschluss-Säule zurückgehalten wurden. Proteine ​​werden von der größten bis zur kleinsten, eluiert. (C) Vor dem Gebrauch enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und Shadoo entsalzt Harnstoff, Imidazol und Salze zu entfernen. Qualitätskontrolle Tests umfassen SDS-PAGE / Coomassie-Färbung, Western-Blot. Gereinigtes Shadoo kann gefriergetrocknet werden. Lyophilisierte Shadoo ist über Monate stabil, wenn sie bei -20 ° C gelagert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </li><li> Größenausschlusschromatographie Hinweis: Eine zweite Reinigungsschritt besteht in der Größenausschluß-Chromatographie, die Shadoo Proteins von anderen Proteinen in der ersten Reinigungsstufe coeluierte trennt(3B). <ol><li> Äquilibrieren Superdex-Säule von 120 ml gesamten Bettvolumens durch die Injektion 250 ml 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml / min. </li><li> Last vereinigten Fraktionen, Shadoo von 2.2.9 auf die äquilibrierte Säule. Sammeln 1 ml-Fraktionen nach der Säule-Hohlraumvolumen von 40 ml auf die konstante Strömung des obigen Puffers. </li><li> Nehmen Sie ein 10 ul-Aliquot jeder Fraktion und führen Sie eine SDS-PAGE-Analyse und Coomassie-Färbung wie oben beschrieben, um herauszufinden, welche Fraktionen enthalten Shadoo. </li><li> Pool Fraktionen, Shadoo. </li></ol></li><li> Entsalzung Anmerkung: Entsalzungsverfahren entfernt Salze, Imidazol und Harnstoff rekombinante Shadoo Protein in einer für die weitere biophysikalische und biochemische Untersuchungen (3C) Puffer erhalten. Das gleiche Ergebnis kann durch Dialysieren Proben gegen den Puffer erhalten werden. <ol><li> Äquilibrieren eine Entsalzungssäule von 53 ml mit 150 mlvon 10 mM Ammoniumacetat-Puffer, pH 5, mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml / min. </li><li> Last gepoolt Shadoo Fraktionen auf die Säule. Bei Injektion des Ammoniumacetatpuffer sammeln manuell Fraktionen, die eine Erhöhung des Signals bei 280 nm am Ausgang des UV-Detektors zeigen. </li><li> Gefrierzutrocknen der entsalzten Shadoo und speichern Sie sie bei -20 ° C. </li><li> Aufzulösen lyophilisierten Shadoo in ausreichender Puffer, wie 10 mM Natriumacetatpuffer, pH 5, vor der Verwendung. Hinweis: Die Polyhistidin-Tag kann mit Enterokinase entfernt werden. </li></ol></li></ol> 3. In-vitro-Montage von Shadoo in Amyloidfibrillen bei physiologischen pH- Hinweis: Die Shadoo Proteinaggregate und Fibrillen bildet spontan bei pH ≥ 7 11. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig4.jpg" /> Abbildung 4. Schema der Shadoo Rückfaltung an Amyloidfibrillen (wie beschrieBett im Schritt 3). Gereinigtes Shadoo wandelt spontan an Amyloidfibrillen als in Puffer pH ≥ 7, gelöst in einer sauren Lösung, wandelt Shadoo an Amyloidfibrillen bei Inkubation mit 1 M Gdn-HCl unter Schütteln. Qualitätskontrolle Tests umfassen Elektronenmikroskopie und THT-Färbung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Verdünnter Shadoo bis zu einer Endkonzentration von 2 &amp; mgr; M in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4. Messen der Konzentration durch Messen der optischen Dichte der Lösung bei 280 nm und unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von Shadoo Aminosäurezusammensetzung von 20.970 abgeleitet. </li><li> Inkubieren 500 ul der Lösung in einem konischen Kunststoffröhrchen bei 4 ° C für ein paar Wochen, um eine spontane Umwandlung Protein Amyloid-Strukturen (Figur 4) zu ermöglichen. </li><li> Hinzufügen frisch Thioflavin T (THT) bis zu einer endgültigen conce vorbereitetntration von 10 um bis 100 &amp; mgr; l Aliquot der Lösung Shadoo. Inkubieren der Lösung für 5 Minuten bei RT. Messung der Fluoreszenzemission von 460 bis 520 nm unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 435 nm, um das Vorhandensein von Amyloid-Strukturen 17 zu verifizieren. </li></ol> 4. In-vitro-Montage von Shadoo an Amyloidfibrillen bei sauren pH-Werten <ol><li> Verdünnter Shadoo in 1 M GdnHCl, 20 mM Na-Acetatpuffer, pH 5 zu einer Endkonzentration von 2 uM. </li><li> Inkubieren 500 ul dieser Lösung in einem konischen Röhrchen unter ständigem Schütteln bei 37 ° C für 3-7 Tage. </li><li> Prüfen Sie das Vorhandensein von Amyloidfibrillen durch Zugabe ThT zu einem aliquoten Teil der Lösung nach 3.3. </li><li> Dialyse erhaltene Suspension gegen 10 mM Na-Acetat-Puffer, pH 5,0, zu Shadoo Amyloidfibrillen zu reinigen. </li><li> Bewahren Sie gereinigte Fibrillen bei +4 ° C. </li></ol><img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig5.jpg"/&gt; Figur 5. Repräsentative Ergebnisse. Proteinfraktionen aus Ni 2+ eluiert -charged chelatbildende Säule (A) und Größenausschluss-Säule (B) wurden unter Verwendung von SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert. Bezeichnung des gereinigten Shadoo wurde mit SPRN Anti Shadoo Antikörper (C) bewertet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Ein einfaches und effizientes Protokoll sowohl für die Expression und Reinigung einer großen Menge an rekombinantem Maus Shadoo Protein präsentiert. Das beschriebene Verfahren ermöglicht erfolgreiche Solubilisierung und Reinigung von (His 6) -markierte rekombinanten Shadoo Protein. Es ist wichtig, wie in dem Dokument darauf hingewiesen, dass, wenn in einem prokaryontischen Bakteriums E. ausgedrückt coli Shadoo sammelt sich in Einschlusskörpern. Vor Shadoo Reinigung haben Bakterien, durch Bes...

Prion neurodegenerativen Erkrankungen, die bovine spongiforme Enzephalopathie bei Rindern, Scrapie bei Schafen und Creutzfeldt-Jakob-Krankheit beim Menschen, sind tödlich und unheilbar. Prion-Krankheiten durch Konformationsänderungen des zellulären Prionproteins im Wesentlichen aus α-Helices in die Quer β-Faltblatt gekennzeichnet angereichert Amyloid Konformer 1,2. Cross-β-Strukturen enthalten dicht gepackt und hochgeordnete kristalline artigen β-sheets stabilisiert mit 3,4-Wasserstoffbrücken. Prion Amyloide sich selbst replizieren aufgrund der β-Stränge an die wachsende Kante, die eine Vorlage für die Rekrutierung geben und Umwandeln eines monomeren Proteineinheit. Nach Angaben der &quot;Nur-Protein-Hypothese&quot;, die Amyloid-Konformer des Prionprotein der einzige Infektionserreger. Jedoch einige andere Biomoleküle wurden vorgeschlagen wesentlich, Prion-Erkrankungen sein. Zum Beispiel werden die Zellmembranen gedacht, ein Ort, wo conversi seinauf erfolgt und einige negativ geladene Lipide sind gezeigt worden, um die Konvertierung zu 5,6 zu erhöhen. Darüber hinaus können einige Proteine ​​auch im Prion-Erkrankungen beteiligt. Insbesondere gibt es zwei weitere Mitglieder des Prionproteinfamilie: Doppel und Shadoo 7,8. Doppel weist eine relativ steife Struktur mit Di-Sulfidbrücken stabilisiert zu werden, keine spontan polymerisieren und Aggregat an Amyloidfibrillen 9. Im Gegensatz dazu, ähnlich wie bei Prion-Protein, Shadoo eine β-Faltblatt-angereicherten Struktur und Selbstassoziation in Amyloidfibrillen Strukturen erlassen. Es konnte gezeigt werden, dass Shadoo kann unter nativen Bedingungen oder bei der Bindung negativ geladenen Membranen 10,11 fibrillieren. Umwandlung von Shadoo in amyloidartigen Fasern können mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Tatsächlich sind die Mechanismen, durch die Amyloid-ähnliche Strukturen Krankheiten verursachen kaum verstanden. Shadoo trägt eine hydrophobe Domäne (HD) und eine Reihe von Tandem Arg / Gly wiederholt ähnliche to den N-terminalen Teil des Prion-Proteins (1A). Als die N-terminalen Teil des Prionproteins wird Shadoo stark positiv und scheint eine nativ unstrukturierte Protein 11,12 sein. Shadoo scheint funktionell auf Prionen-Erkrankungen sein, da es direkt binden Prionprotein. Zusätzlich ist seine Expression unten während Prion Pathologie 13,14 geregelt. Jedoch ist die Rolle von Shadoo Prionenerkrankungen noch nicht etabliert. Wir entwickelten ein Plasmid, das die codierende Sequenz der Maus Shadoo Gens. Das Plasmid wurde verwendet, um E.-Transformation coli zur Herstellung von N-terminalen His-6-Fusionsprotein Shadoo. Dieses Expressionssystem ist in unserem Labor etabliert und wird häufig in unserer laufenden Projekte 6,15,16 verwendet. Ein wichtiges Thema für die Expression von Shadoo ist die Wahl des E. coli-Stamm. Während kompetente BL21 Bakterienstamm wird häufig für die Expression von rekombinanten Pro verwendetProteine ​​Shadoo wurde erfolgreich exprimiert und nur aus der transformierten SoluBL21 Bakterienstamm gereinigt. SoluBL21 kompetente E. coli ist eine verbesserte Mutante BL21 Wirtsstamm für die Produktion von Proteinen, deren Expression in der Mutter BL21 gab keinen nachweisbaren löslichen Produkt entwickelt. High-Level-Expression Shadoo in SoluBL21 E. coli führt zu einer Akkumulation des Proteins in Einschlusskörpern. Als eine allgemeine Funktion, wenn ein nicht-native Protein ist stark in E. ausgedrückt coli neigt dieses Protein in unlöslicher Einschlußkörper akkumulieren. Shadoo Aggregate vermutlich durch nicht-kovalente oder ionische Wechselwirkungen hydrophobe (oder einer Kombination von beiden), um hoch angereichertes dynamischen Strukturen durch das Protein in unterschiedlichem Maße gefaltet ist. Folglich umfasst die Reinigung wenigstens zwei Schritte: (i) eine selektive Trennung des Proteins von anderen Biomolekülen in einer Denaturierung Medium und (ii) eine Renaturierung des gereinigten Proteins mit in vitro FaltungsTechniken. Die selektive Abtrennung von Shadoo wurde in einer Pufferlösung, enthaltend 8 M Harnstoff (oder alternativ 6 M Guanidin-HCl) gelöst. (I) die Renaturierung in einem sauren pH-Lösung eine unstrukturierte monomeren Shadoo Protein oder (ii) die Renaturierung in einer Lösung mit pH ≥ 7 bis Shadoo polymerisierten erhalten: Die Harnstoffentfernung und die Renaturierung des Proteins kann durch Anwendung verschiedener Protokolle durchgeführt werden in stabile Amyloidfasern mit charakteristischen Quer β-Blatt-Motive.

<table><tbody><tr><td>AKTA FPLC&nbsp;</td><td>GE, Amersham</td><td># 1363</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap IMAC</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0920-05</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep26/10 Entsalzungssäule</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>SoluBL21 Kompetente E. coli</td><td>Genlantis</td><td>C700200</td><td></td></tr><tr><td>pET-28b+</td><td>Novogen</td><td>69865-3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Bouillon Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Biophotometar</td><td></td><td>Eppendorf 550507804</td><td></td></tr><tr><td>Trito X-100</td><td>Life Technologies</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>NiSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>656895</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktail Tabletten</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Gdn-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Proteingrößenmarker&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr></tbody></table>

reinigung und rückfaltung an amyloidfibrillen von (his)<sub&gt; 6</sub&gt; -markierte recombinant protein shadoo als einschlusskörper in ausgedrückt<em&gt; e. coli</em

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Der Escherichia-coli-Expressionssystem ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Herstellung von rekombinanten eukaryotischen Proteinen. Wir verwenden es, um Shadoo, ein Protein, an das Prion-Familie gehören, zu erzeugen. Ein chromatographisches Verfahren zur Reinigung von (His) 6 -markierten rekombinanten Shadoo ausgedrückt als Einschlußkörper beschrieben. Die Einschlusskörper in 8 M Harnstoff solubilisiert und auf eine Ni 2+ -charged Säule gebunden zu Ionen-Affinitätschromatographie durchzuführen. Gebundenen Proteine ​​werden mit einem Gradienten von Imidazol eluiert. Fraktionen Shadoo Protein enthalten, werden Größenausschlußchromatographie unterzogen wird, eine hoch gereinigte Protein zu erhalten. Im letzten Schritt gereinigt Shadoo entsalzt, um Salze, Harnstoff und Imidazol zu entfernen. Rekombinante Shadoo Protein ist ein wichtiges Reagenz zur biophysikalischen und biochemischen Studien der Proteinkonformation Störungen bei Prionenerkrankungen auftreten. Viele Berichte gezeigt, dass neurodegenerative Erkrankungen Prion stammen aus der Ablagerung von Stichle, bestellt Amyloidfibrillen. Musterprotokolle beschreiben, wie Shadoo in Amyloidfibrillen bei sauren und neutralen fibrillieren / basischen pH-Werten dargestellt. Die Methoden, wie man produzieren und fibrillieren Shadoo kann Forschung in Labors arbeiten an Prionenerkrankungen zu erleichtern, da es für die Produktion von großen Mengen an Protein in eine schnelle und kostengünstige Weise.

Etwa 5-10 mg gereinigtes Shadoo Protein pro Liter Bakterienkultur erhalten. Ein Zwei-Schritt-Reinigung ist notwendig, um rekombinante Shadoo hoher Reinheit zu erhalten. Der erste Schritt ist durch Affinitätschromatographie mit einem Ni 2+ -charged Spalte, die His-Tag-Proteine ​​behält geführt. Eluierten Fraktionen werden der SDS-PAGE unterworfen und mit Coomassie Brilliant Blue (5A) angefärbt. Fraktionen Shadoo Protein enthalten, werden vereinigt und weiter durch Grßenausschlußchromatographie...

Es wird ein zweistufiges chromatographisches Verfahren zur Aufreinigung von rekombinanten Shadoo-Proteinen beschrieben, die als Einschlusskörper in Escherichia coli exprimiert werden, sowie ein Protokoll zur Fibrillation von gereinigtem Shadoo in Amyloidstrukturen.

Reinigung und Rückfaltung an Amyloidfibrillen von (His)<sub&gt; 6</sub&gt; -markierte Recombinant Protein Shadoo als Einschlusskörper in Ausgedrückt<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein rekombinantes Shadu-Protein, das als Einschlusskörperchen in Esia coli exprimiert wird, zu reinigen und in amyloide Fibrillen neu zu falten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der molekularen Mechanismen von Protein-Fehlfaltungserkrankungen zu beantworten, wie sie beispielsweise bei prä-erkrankungen auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Herstellung großer Mengen des Proteins schnell und kostengünstig ermöglicht. Um kompetente Soll-BBL-21-Bakterien mit dem PET-28-His-sechs-SHADU-Plasmid zu transformieren, mischen Sie 10 bis 100 Pikogramm Plasmid oder ein bis fünf Mikroliter in 50 Mikroliter Bakterien in einem Reaktionsgefäß.Hitzebehandeln Sie die Zellen bei 42 Grad Celsius für 45 Sekunden. Geben Sie LB-Medium, das mit 40 Milligramm pro Milliliter Kanamycin ergänzt wurde, hinzu und kultivieren Sie die Bakterien. Kultivieren Sie die transformierten Bakterien bei 37 Grad Celsius, bis sie eine Extinktion von 0,5 bis 0,7 bei 600 Nanometern erreichen, induzieren Sie dann die Proteinexpression durch Zugabe von 240 Mikrogramm pro Milliliter IPTG und kultivieren Sie weiter.Die Bakterien bei 37 Grad Celsius und 150 U/min über Nacht. Um das Protein zu reinigen, die bakterielle Suspension in Zentrifugenröhrchen überführen und 2.500 × g bei vier Grad Celsius 20 Minuten lang zentrifugieren. Zum Resuspendieren 15 Milliliter einer 50 Millimolar Tris-, 10 Millimolar EDTA-Pufferlösung mit pH 8 und Protease-Cocktail verwenden.Jedes Pellet stammt aus 500 Milliliter Zellkultur. Nach Überprüfung der Überexpression gemäß dem Textprotokoll Triton X-100 zu den resuspendierten Pellets in einer Endkonzentration von 0,5 % hinzufügen. Anschließend die Suspension in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach die Suspension in eiskaltem Wasser bei sechs bis zwölf Mikron beschallen.Spitzenleistung für fünf Minuten, um die Bakterienzellen zu zerschneiden. Anschließend die beschallte Suspension in saubere 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Die Röhrchen bei 15.000 × g und 4 °C 15 Minuten lang zentrifugieren.Abgießen, um das S-Überstand zu entfernen, und fünf Milliliter Bindungspuffer pro Röhrchen hinzufügen. Die Röhrchen über Nacht auf das Rotationsrad stellen, um die Proteine vollständig aus den Einschlusskörperchen zu resuspendieren. Um die Nickela chromatographie durchzuführen.Injizieren Sie 10 Milliliter einer 0,2-molaren wässrigen Nickel(II)-sulfatlösung in die Spheros-Säule, um diese mit Nickelionen zu beladen. Puffern Sie die Säule aus, indem Sie 30 bis 50 Milliliter des Bindungspuffers mit niedrigem Ole-Gehalt injizieren. Laden Sie anschließend die Harnstoff-lysierten Proteine mithilfe einer Injektionsschleife auf. Als Nächstes die Säule gründlich mit 10 Milliliter Low-Ole-Bindungspuffer waschen, um ungebundene Proteine zu entfernen. Anschließend die Säule mit 50 bis 100 Milliliter Waschpuffer waschen und die unspezifisch gebundenen Proteine eluieren. Um das His-markierte Protein zu eluieren.Tragen Sie einen 15-Milliliter-Gradienten von 80 bis 800 Millimolar Ole in Bindungspuffer mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute auf. Sammeln Sie Fraktionen zu je einem Milliliter, entnehmen Sie aus jeder Fraktion acht Mikroliter und pipettieren Sie diese in separate Röhrchen, und geben Sie vier Mikroliter einer 4×-Lämmli-Denaturierungslösung hinzu. Anschließend lagern Sie die Röhrchen bei 100 Grad Celsius für fünf Minuten.Führen Sie die STS-Gelelektrophorese durch, indem Sie jeweils 10 Mikroliter Marker und Proben auf einem 12 %igen Polyacrylamidgel laufen lassen und mit Kumasisierblau färben. Das berechnete molekulare Gewicht von Shadow beträgt 12243,2 Dalton. Puffern Sie alle shadowhaltigen Fraktionen für die Größenausschlusschromatographie an, indem Sie eine SUEx-Säule mit einem Gesamtvolumen von 120 Milliliter durch Injektion von 250 Milliliter 20 Millimolar Tris, HCl-Puffer pH 7,4, 0,5 Molar Natriumchlorid und acht Molar Harnstoff bei einer Flussrate von 1,5 Milliliter pro Minute equilibrieren.Laden Sie die gepoolten Shadu-Fraktionen auf die Säule und nachdem ein Säulenvoidvolumen von 40 Milliliter durchlaufen ist, sammeln Sie 1-Milliliter-Fraktionen des Proteins. Nach Bestätigung der Shadu-haltigen Fraktionen werden die Proteine erneut gepoolt, um die Probe zu entsalzen.Verwenden Sie 150 Milliliter 10 Millimolar Ammoniumacetat pH 5, um eine 53-Milliliter-Desalzierungssäule mit einer Flussrate von 5 Milliliter pro Minute zu equilibrieren. Laden Sie den Pool auf die Desalzierungssäule unter Verwendung eines UV-Detektors bei 280 Nanometern auf. Beginnen Sie mit der Sammlung von Fraktionen, die eine Zunahme des Signals des UV-Detektors zeigen, um Shadow zu Amyloid fis zusammenzuführen.Bei physiologischem pH-Wert. Verwenden Sie 20 Mikromolar Triss pH 7,4, um den Schatten mit einem Spektrophotometer bei 280 Nanometern und dem aus der Aminosäurezusammensetzung abgeleiteten Extinktionskoeffizienten von 20.970 zu verdünnen. Berechnen Sie die Konzentration, überführen Sie 500 Mikroliter der Lösung in einen konischen Kunststoffbehälter und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für einige Wochen, um eine spontane Proteinkonversion in Amyloidstrukturen zu ermöglichen.Nach der Inkubation frisch zubereitetes Thioflavin T oder THT zu 100 Mikrolitern Shadu-Lösung hinzufügen. Anschließend die Lösung fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die fluoreszente Emission von 460 bis 520 Nanometern unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 435 Nanometern messen, um das Vorhandensein amyloider Strukturen zu überprüfen, die Shadu bei saurem pH zu amyloiden Fibrillen assemblieren.Verdünnen Sie Shadu in einem molaren Guanidinhydrochlorid und 20 Millimolar Natriumacetat, pH 5, auf eine Endkonzentration von zwei Mikromolar, geben Sie 500 Mikroliter in ein kegelförmiges Reagenzglas und inkubieren Sie unter kontinuierlichem Schütteln bei 37 Grad Celsius für drei bis sieben Tage. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Amyloidfibrillen, indem Sie THT zur Probe hinzufügen und die Fluoreszenz wie zuvor gezeigt messen. Dialysieren Sie schließlich die Suspension gegen 10 Millimolar Natriumacetatpuffer, pH 5,0, um die Amyloidfibrillen zu reinigen. Hier gezeigt sind Fraktionen, die das His-Sechs-Tag-Shadu-Protein enthalten, das durch Affinitätschromatographie gewonnen und einer SDS-Gelelektrophorese unterzogen wurde.In dieser Abbildung wurden die Fraktionen, die Shadu enthielten, gesammelt und mittels Größenausschlusschromatographie gereinigt. Das molekulare Gewicht von Shadu beträgt 12 Kilodalton. Das Vorhandensein von Shadu wurde außerdem mittels Western Blot unter Verwendung eines spezifischen anti-Shadu-Antikörpers, SPRN, bestätigt, der an ein empfindliches Epitop zwischen den Aminosäuren 76 und 105 aus dem C-terminalen Bereich des Proteins bindet.In diesem Diagramm wird die Umfaltung von Shadu zu Amyloid-Fibrillen durch THT-Färbung bestätigt. Diese nimmt an Intensität zu, wenn Shadu in Amyloid-Strukturen umgewandelt wird. Die negativ gefärbte Elektronenmikroskopie bestätigt ebenfalls die Umfaltung von Shadu zu Amyloid-Fibrillen nach diesem Verfahren.Andere Methoden, wie beispielsweise solche, die auf magnetischen Nickelkügelchen basieren, können durchgeführt werden, um die Nickel-Affinitätssäule nach ihrer Entwicklung zu ersetzen. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Protein-Biophysik und Biochemie den Weg, um in vitro verschiedene Proteine zu untersuchen, die in unterschiedlichen ProPath beteiligt sind.

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Biology

Biologie

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Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

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Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

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Reinigung und Rückfaltung an Amyloidfibrillen von (His) 6 -markierte Recombinant Protein Shadoo als Einschlusskörper in Ausgedrückt E. coli (Video) | JoVE Journal

Reinigung und Rückfaltung an Amyloidfibrillen von (His)

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