Reinigung und Rückfaltung an Amyloidfibrillen von (His) ₆ -markierte Recombinant Protein Shadoo als Einschlusskörper in Ausgedrückt E. coli

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein rekombinantes Shadu-Protein, das in Esia coli als Einschlusskörper exprimiert wird, zu reinigen und in die Amyloidfibrillen zurückzufalten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der molekularen Mechanismen von Proteinkonformationsstörungen, wie sie bei Vorerkrankungen auftreten, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Vorhersage einer großen Menge an Proteinen in einer schnellen und kostengünstigen Weise ermöglicht. Um kompetente Solu BBL 21 Bakterien mit dem PET 28 zu transformieren, werden sechs SHADU Plasmide 10 bis 100 Pikogramm Plasmid oder ein bis fünf Mikroliter in 50 Mikroliter Bakterien in einem Röhrchen

Erhitzen Sie die Zellen bei 42 Grad Celsius für 45 Sekunden. Fügen Sie lb Medium hinzu, das mit 40 Milligramm pro Milliliter Mycin und Bakterien ergänzt ist, und kultivieren Sie. Die transformierten Bakterien bei 37 Grad Celsius, bis sie bei 600 Nanometern eine Absorption von 0,5 bis 0,7 erreichen, induzieren eine Schattenexpression, indem sie 240 Mikrogramm pro Milliliter IPTG und Kultur hinzufügen.

Die Bakterien bei 37 Grad Celsius und 150 U/min über Nacht. Um das Protein zu reinigen, geben Sie die Bakteriensuspension in Zentrifugenröhrchen und schleudern Sie sie 20 Minuten lang um das 2.500-fache G und vier Grad Celsius. Verwenden Sie 15 Milliliter 50 Millimolar Triss, 10 Millimolar, EDTA pH 8 und Protease-Cocktail zur Resuspendierung.

Jedes Pellet stammt aus 500 Millilitern Zellkultur. Nach Prüfung auf Überexpression gemäß dem Textprotokoll Triton X 100 zu den resuspendierten Pellets in einer Endkonzentration von 0,5 % hinzufügenAnschließend die Suspension in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren. Als nächstes beschallen Sie die Suspension in eiskaltem Wasser bei sechs bis 12 Mikrometern.

Maximale Tope-Amplitude für fünf Minuten, um die Bakterienzellen zu durchschneiden. Übertragen Sie dann die beschallte Suspension in saubere 50-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 15.000 g und vier Grad Celsius für 15 Minuten.

Dekantieren, um den S-Überstand zu entfernen, und fünf Milliliter Bindungspuffer pro Röhrchen hinzufügen. Legen Sie die Röhrchen über Nacht auf das rotierende Rad, um Proteine vollständig von den Einschlusskörpern zu resuspendieren. Zur Durchführung der Nickelchromatographie

Injizieren Sie 10 Milliliter 0,2 molare Nickelsulfat-Wasserlösung in die Spherossäule, um sie mit Nickelionen aufzuladen. Äquilibrieren Sie die Säule, indem Sie 30 bis 50 Milliliter des Bindungspuffers mit niedrigem Ole injizieren. Verwenden Sie dann eine Injektionsschlaufe, um die harnstoffsolubilisierten Proteine zu laden.

Waschen Sie anschließend die Säule mit 10 Millilitern Puffer mit niedrigem Ole-Bindungsgehalt gründlich, um ungebundene Proteine zu entfernen. Verwenden Sie dann 50 bis 100 Milliliter Waschpuffer, um die Säule zu waschen und die unspezifisch gebundenen Proteine zu eluieren. Zur Eluierung des hist-markierten Proteins.

Wenden Sie einen linearen Gradienten von 15 Millilitern von 80 bis 800 Millimolar in Bindungspuffer bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute an. Sammeln Sie einen Milliliter Fraktionen, aliquotieren Sie acht Mikroliter von jeder Fraktion in separate Röhrchen und fügen Sie vier Mikroliter vier X lahme Denaturierungslösung hinzu. Halten Sie die Röhrchen dann fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius.

Führen Sie die STS-Seite durch, indem Sie jeweils 10 Mikroliter Marker und Proben auf ein 12%iges Polyacrylamid-Gel auftragen und mit Kumasi-Blau färben. Das berechnete Molekulargewicht des Schattens beträgt 12243.2 Daltons Pool. Alle schattenhaltigen Fraktionen für die Größenausschlusschromatographie äquilibrieren eine SUEx-Säule mit einem Gesamtbettvolumen von 120 Millilitern durch Injektion von 250 Millilitern 20 Millimolar Tris, HCL-Puffer pH 7,4 0,5 molar Natriumchlorid und acht molaren Harnstoff bei einer Flussrate von 1,5 Millilitern pro Minute.

Laden Sie die gepoolten Shadu-Fraktionen auf die Säule und nach dem Ausweichen aus einer Säule ein Hohlraumvolumen von 40 Millilitern. Sammeln Sie einen Milliliter Fraktionen des Proteins. Nachdem Sie die Fraktionen, die Shadu enthalten, überprüft haben, poolen Sie das Protein wie zuvor, um die Probe zu entsalzen.

Verwenden Sie 150 Milliliter 10 Millimolar Ammoniumacetat pH fünf, um eine 53-Milliliter-Entsalzungssäule bei einer Durchflussrate von fünf Millilitern pro Minute auszugleichen. Laden Sie das Becken mit einem UV-Detektor bei 280 Nanometern auf die Entsalzungskolonne. Beginnen Sie mit dem Sammeln von Fraktionen, die eine Zunahme des Signals vom UV-Detektor zeigen, um Schatten zu Amyloidfis zusammenzusetzen.

Bei physiologischem pH-Wert. Verwenden Sie 20 mikromolare Triss pH 7,4, um den Schatten mit einem Spektralphotometer bei 280 Nanometern zu verdünnen, und der Extinktionskoeffizient wird aus der Aminosäurezusammensetzung von 20.970 abgeleitet. Berechnen Sie die Konzentration, geben Sie 500 Mikroliter der Lösung in einen konischen Kunststoff und inkubieren Sie ihn einige Wochen lang bei vier Grad Celsius, um eine spontane Proteinumwandlung in Amyloidstrukturen zu ermöglichen.

Nach der Inkubation frisch zubereiteten Thio-Flavin-Tee oder THT zu 100 Mikrolitern Shadu-Lösung hinzufügen. Dann die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Messen Sie die Fluoreszenzemission von 460 bis 520 Nanometern mit einer Anregungswellenlänge von 435 Nanometern, um das Vorhandensein von Amyloidstrukturen zu überprüfen, die Shadu bei sauren pH-Werten zu Amyloidfibrillen zusammensetzen.

Shadu wird in einem molaren Guineahydrochlorid von 20 Millimolaren Natriumacetat pH fünf auf eine Endkonzentration von zwei Mikromolaren verdünnt, 500 Mikroliter in ein konisches Röhrchen überführt und unter kontinuierlichem Schütteln bei 37 Grad Celsius drei bis sieben Tage lang inkubiert. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Amyloidfibrillen, indem Sie der Probe THT zusetzen und die Fluoreszenz messen, wie gerade gezeigt. Schließlich dialysieren Sie die Suspension gegen 10 Millimolare Natriumacetatpuffer pH 5,0, um die Amyloidfibrillen zu reinigen, die hier gezeigt sind, sind Fraktionen, die sein sechstägiges Schattenprotein enthalten, das durch Affinitätschromatographie gesammelt und der SDS-Seite unterzogen wurde.

In dieser Abbildung wurden die Shadu-haltigen Fraktionen gepoolt und durch Größenausschlusschromatographie gereinigt. Das Molekulargewicht von Shadu beträgt 12 Kilodalton. Das Vorhandensein von Shadu wurde auch durch Western Blot unter Verwendung eines spezifischen Anti-Shadu-Antikörpers, SPRN, verifiziert, der an ein empfindliches Epitop zwischen 76 und 105 Aminosäuren aus der Protein-C-terminalen Region bindet.

In dieser Grafik wird die Rückfaltung von Shadu zu Amyloidfibrillen durch THT-Färbung verifiziert. Diese Intensität nimmt als Reaktion auf die Umwandlung von Shadu in Amyloid-Strukturen zu. Die Elektronenmikroskopie mit negativer Färbung verifiziert auch die Rückfaltung von Shadu zu Amyloid-Fis. Nach diesem Verfahren wird nachgeforscht.

Andere Verfahren, wie z.B. auf Basis von Nickel-Magnetkügelchen, können durchgeführt werden, um die Nickel-Affinitätssäule nach ihrer Entwicklung zu ersetzen. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Proteinbiophysik und -biochemie den Weg, in vitro verschiedene Proteine zu erforschen, die an verschiedenen ProPath-Proteinen beteiligt sind.