Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Chemorezeptor-Liganden-Bindungsdomäne aus Einschlusskörpern zu falten und sie für die Verwendung in strukturellen und funktionellen Studien zu reinigen. Um festzustellen, welche Signale ein bakterieller Chemorezeptor sendet und wie, kann man die isolierten Ligandenbindungsdomänen verwenden, um gegen kleine Molekülbibliotheken zu screenen oder die Struktur mit und ohne Liganden zu bestimmen. Die Unterdrückung der extrazellulären Ligandenbindungsdomäne in E.coli führt häufig zur Ablagerung in Einschlusskörpern.

Hier zeigen wir, wie eine Milligrammmenge an funktionellem Protein aus den Einschlusskörpern zurückgewonnen werden kann. Zu Beginn inokulieren Sie 150 ml sterile LB-Bouillon mit 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin mit BL21-CodonPlus RIPL-Zellen, die mit dem pET151 D-TOPO-Vektor für die Expression von Hexahistidin TIp3-LBD transformiert wurden. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 200 U/min und 37 Grad Celsius.

Bereiten Sie sechs 2-Liter-Erlenmeyerkolben vor, die 800 ml sterile LB-Bouillon und 50 Mikrogramm Ampicillin pro ml enthalten. Beimpfen Sie jeden Kolben mit 20 ml der Nachtkultur. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius unter ständigem Schütteln bei 200 U/min, bis der OD600 0,6 erreicht.

Zu diesem Zeitpunkt wird die Proteinexpression induziert, indem jedem Kolben 1 millimolares IPTG zugesetzt wird. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius in einem Shaker bei 200 U/min für weitere vier Stunden. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 5000 xg und vier Grad Celsius für 15 Minuten.

Entsorgen Sie dann den Überstand. Übertragen Sie alle Zellpellets in ein 250-ml-Becherglas und fügen Sie 100 ml Puffer A hinzu. Wenn sie gefroren sind, lassen Sie die Zellen vollständig auftauen und resuspendieren Sie das Pellet. Bewahren Sie die Probe auf Eis auf, sofern nicht anders angegeben.

Führen Sie anschließend die resuspendierten Zellen dreimal durch einen Hochdruck-Homogenisator, um die Zellen zu lysieren und eine vollständige Scherung der genomischen DNA sicherzustellen. Zentrifugieren Sie dann das Lysat bei 10.000 xg und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Entnehmen Sie eine Probe von einem ml des Überstands und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für die anschließende SDS-PAGE-Analyse.

Entsorgen Sie dann den restlichen Überstand und legen Sie das Pellet auf Eis. Als nächstes resuspendieren Sie das Einschlusskörper-Pellet gründlich in 20 ml eiskaltem Puffer B. Dies erleichtert die Solubilisierung der Membran und der Membranproteine. Wirbeln Sie die Probe ein bis zwei Minuten lang vor, um die Resuspension zu unterstützen.

Nach dem Zentrifugieren der Probe wird das Pellet erneut gründlich in 20 mL eiskaltem Puffer B resuspendiert, indem das Röhrchen zunächst ein bis zwei Minuten lang vorgeschoben wird. Achten Sie darauf, dass das Pellet in kleine Stücke gebrochen wird. Pipettieren Sie dann die Probe auf und ab, um sie wieder zu suspendieren.

Die Probe wird wie zuvor zentrifugiert und der Überstand verworfen. Wenn der Überstand trüb oder gefärbt ist, zentrifugieren Sie die Probe erneut und verwenden Sie zusätzlichen eiskalten Puffer B, um sie wieder zu suspendieren. Wiederholen Sie das Zentrifugieren und die Resuspension, bis der Überstand klar und farblos ist, bevor Sie erneut pelletieren.

Geben Sie 20 mL eiskalten Puffer C in das Pellet und resuspendieren Sie es, indem Sie das Röhrchen ein bis zwei Minuten lang vortexen. Fügen Sie dann, nachdem Sie die Probe gedreht haben, 25 ml eiskalten, denaturierenden Puffer D hinzu. Resuspendieren Sie das Einschlusskörperpellet gründlich, indem Sie das Röhrchen ein bis zwei Minuten lang vortexen oder bis das Pellet in kleine Stücke zerbrochen ist. Mischen Sie die Suspension durch axiale Drehung bei 30 U/min und 4 Grad Celsius für 30 bis 120 Minuten.

Die denaturierte Proteinlösung wird durch Zentrifugation bei 30.000 xg und vier Grad Celsius für 30 Minuten geklärt. Legen Sie dann den Überstand auf Eis und entsorgen Sie das Pellet. Unter Rühren von 250 ml Puffer E bei 500 U/min werden 60 Milligramm denaturierte Proteinmischung mit Hexahistadin TIp3-LBD hinzugefügt.

Inkubieren Sie die Faltmischung bei vier Grad Celsius unter ständigem Rühren bei 500 U/min für 24 bis 48 Stunden. Die endgültige Proteinkonzentration beträgt 0,2 mg pro ml. Nachdem Sie sieben Liter vorgekühlten Puffer A und Dialyseschlauch gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, klemmen Sie mit dem Verschluss des Dialyseschlauchs ein Ende der Dialysemembran ein und übertragen Sie das Dialysegemisch in den Schlauch.

Klemmen Sie dann das offene Ende fest und stellen Sie sicher, dass keine Undichtigkeiten vorhanden sind. Legen Sie den Dialyseschlauch in einen Dialyseeimer mit dem vorgekühlten Puffer A. Fügen Sie dann einen magnetischen Rührstab hinzu, der darauf achtet, dass er den Dialyseschlauch beim Rühren nicht berührt. Dialysieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius unter kontinuierlichem Rühren bei 500 U/min und wechseln Sie den Puffer mindestens viermal über einen Zeitraum von 12 Stunden.

Nach dem letzten Pufferwechsel lassen Sie die Probe über Nacht dialysieren. Nehmen Sie am nächsten Morgen den Dialyseschlauch aus dem Eimer und geben Sie den Inhalt in ein 500-ml-Becherglas. Bewahren Sie die Proteinlösung auf Eis auf, sofern nicht anders angegeben.

Filtrieren Sie die Proteinlösung durch eine porengroße Membran von 0,43 Mikrometern in eine 500-ml-Glasflasche, um das gefällte Protein zu entfernen. Nach dem Waschen, Laden und Äquilibrieren einer Chelatsäule gemäß dem Textprotokoll passen Sie die erhaltene gefaltete Proteinprobe an die Zusammensetzung von Puffer F an, indem Sie 25 ml 5 M Natriumchlorid, 2,5 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 und 2,5 ml 2 M Imidazol-Stammlösungen hinzufügen. Laden Sie die Probe mit einer Geschwindigkeit von 5 ml pro Minute oder weniger auf die Säule und verwerfen Sie den Durchfluss, der die ungebundenen Proteine enthält.

Waschen Sie dann die Säule mit 50 bis 100 ml Puffer F, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen, und verwerfen Sie den Durchfluss. Eluieren Sie das Hexahistadin TIp3-LBD mit 25 mL Puffer G. Poolen Sie dann die Durchflussfraktionen, die das Protein enthalten. Nach der Vorbereitung von Puffer H und Dialyseschläuchen gemäß dem Textprotokoll fügen Sie dem Hexahistadin-markierten Protein im Schlauch eine Hexahistadin-markierte TEV-Protease hinzu.

Fügen Sie ein endgültiges molares Verhältnis von einem TEV zu acht Protein hinzu. Legen Sie den eingespannten Dialyseschlauch in die vorgekühlten vier Liter Puffer H und inkubieren Sie ihn bei vier Grad Celsius unter ständigem Rühren zwei Stunden lang. Wechseln Sie dann den Puffer und setzen Sie die Dialyse über Nacht fort, damit die TEV-vermittelte Spaltungsreaktion abgeschlossen werden kann.

Nach dem Wechsel zu Puffer I, dem Filtrieren der Proteinlösung und der erneuten Anpassung der Probe wird die Probe auf eine vorbereitete fünf ml HiTrap chelatbildende HP-Säule geladen. Sammeln Sie bei einer Flussrate von fünf ml pro Minute den Durchfluss, der das nicht markierte TIp3-LBD enthält. Auf gespaltenem Protein werden das gespaltene Hexahistadin-Tag und das Hexahistadin-TEV von der Säule zurückgehalten.

Verwenden Sie fünf ml Puffer F, um die Säule zu waschen, damit das nicht markierte Protein durchfließen und das Eluat sammeln kann. Nach dem Äquilibrieren einer Größenausschlusssäule und dem Konzentrieren und Klären der Proteinprobe gemäß dem Textprotokoll wird die Probe auf die voräquilibrierte 26/60-Gelfiltrationssäule geladen. Tragen Sie Puffer A mit einer Flussrate von vier ml pro Minute auf und überwachen Sie die UV-Spur auf Proteinelution.

TIp3-LBD eluiert bei einem Retentionsvolumen von 210 bis 220 ml. Nach der Chromatographie werden die Fraktionen gepoolt, dann die Proteinkonzentration gemessen und die SDS-PAGE durchgeführt. Das in diesem Video gezeigte Proteinisolierungsverfahren ergab 10 bis 20 mg reines unmarkiertes TIp3-LBD pro einem Liter Bakterienkultur.

Wie hier zu sehen ist, hat das aus der Gelfiltrationssäule eluierte Protein einen einzigen, symmetrischen Peak, der einem Retentionsvolumen von 220 mL mit einem berechneten Molekulargewicht von 29 kDa entspricht. Wie hier von SDS-PAGE gezeigt, enthielten die Einschlusskörper überwiegend Hexahistadin TIp3-LBD mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 28 kDa, was nahe an dem Wert liegt, der aus der Aminosäuresequenz von 31,8 kDa berechnet wurde. Die Schritte zur Entfernung von Hexahistadin-Markierungen, zur Affinitätschromatographie und zur Gelfiltration ergaben hochreines Protein.

Die CD-Spektroskopie mit CDSSTR zeigte, dass die Sekundärstruktur von Hexahistidin TIp3-LBD aus 31 % Alpha-Helix- und 23 % Beta-Faltblatt-Gehalt besteht. Diese lagen auch nahe an den vorhergesagten Werten von 37 % bzw. 26 % aus der Sequenzanalyse mit dem JPred 3-Server. Dieses Protokoll erfordert mindestens fünf Tage von Anfang bis Ende und kann bei Bedarf in drei verschiedenen Phasen pausiert werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine gründliche und vollständige Resuspension der Einschlusskörper im denaturierenden Puffer durch Vortexen oder Auf- und Abpipettieren für diese gesamte Realisierung entscheidend ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Ligandenbindungsdomäne des Chemorezeptors TIp3 wieder falten und reinigen können. Das gereinigte Protein kann zur Bindung von Säuren verwendet werden, um die Spezifität des Liganden für diesen Rezeptor zu untersuchen.

Darüber hinaus haben wir bereits gezeigt, dass das durch dieses Verfahren erhaltene Protein zur Herstellung hochgeordneter Kristalle verwendet werden kann, was den Weg für die Untersuchung der strukturellen Grundlagen für seine Ligandenspezifität ebnete. Dieses Verfahren könnte im Allgemeinen nützlich sein für die Produktion von mg-Mengen von Chemorezeptoren aus anderen Bakterien in kristallisierbarer und löslicher Form. Wir haben dieses Protokoll in seiner ursprünglichen oder leicht modifizierten Form verwendet, um die Ligandenbindungsdomäne anderer Chemorezeptoren dieses Typs für kristallographische Studien neu zu falten und zu reinigen.

Bitte denken Sie daran, dass in jedem einzelnen Fall eine Optimierung des Protokolls erforderlich sein wird, z. B. die Zusammensetzung der Denaturierungs- und Rückfaltungspuffer und die Inkubationszeiten.