Name: Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Ligandenbindedomäne des Chemorezeptors Tlp3 aus Einschlusskörpern effizient umfalten und reinigen. Diese Methode liefert milligrammreine funktionelle Proteine für strukturbiologische Studien.

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Wir danken Yu C. Liu für seine frühen Arbeiten auf der Tlp3-LBD-Produktion. Mayra A. Machuca ist verpflichtet, Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS für ein Promotionsstipendium.

1. Ausdruck seiner6-Tlp3-LBD in E. Coli
<ol><li>150 mL sterile Luria-Bertani (LB) Brühe enthält 50 µg mL-1 Ampicillin mit BL21-Codon-Plus (DE3) zu impfen - RIPL Zellen umgewandelt mit der pET151/D-TOPO-Vektor für Ausdruck seiner6- Tlp3-LBD (Aminosäurereste 42-291), und inkubieren sie bei 37 ° C in einem Shaker (Umlaufbahn Durchmesser, 25 mm) mit 200 u/min über Nacht.</li>
	<li>Bereiten Sie sechs 2 L Erlenmeyerkolben mit 800 mL sterile LB Brühe und 50 µg mL-1 Ampicillin. Jede Flasche mit 20 mL der gewonnenen Schritt 1.1 über Nacht Kultur zu impfen. Inkubieren sie bei 37 ° C mit kontinuierlichen Schütteln bei 200 u/min bis die Extinktion bei 600 nm erreicht 0,6.</li>
	<li>Nehmen Sie 1 mL aliquoten aus einem Fläschchen (uninduced Kontrollprobe), Pellet mit einem Benchtop-Zentrifuge (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) und verwerfen Sie den überstand. Speichern Sie die bakterielle Pellet bei-20 ° C für die spätere SDS-PAGE-Analyse.</li>
	<li>Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-β-D-Thiogalactoside (IPTG) zu jedem Kolben mit Kultur zu induzieren. Fahren Sie fort, die Fläschchen bei 37 ° C in einem Shaker bei 200 u/min für weitere 4 h Inkubation.</li>
	<li>Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 15 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Hinweis: an dieser Stelle kann die Prozedur angehalten werden, indem man die Zelle Pellet in einem-80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung.</li>
</ol>(2) Isolation und Denaturierung der Inclusion Bodies
<ol><li>Übertragen Sie die Zelle Pellets erwarb Schritt 1.5, ein 250-mL-Becherglas geben und 100 mL Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). Ermöglichen die Zellen zu tauen komplett (wenn gefroren) und Aufschwemmen der Pellets. Halten Sie die Probe auf dem Eis, sofern nicht anders angegeben.</li>
	<li>Übergeben der resuspendierte Zellen durch einen Hochdruck-Homogenisator dreimal lyse der Zellen und komplette Abscheren der genomic DNA zu gewährleisten.</li>
	<li>Zentrifugieren der lysate bei 10.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Sammeln Sie eine 1 mL Probe des Überstands (löslichen Fraktion) und bewahren sie bei-20 ° C für die spätere SDS-PAGE-Analyse. Verwerfen Sie den Rest des Überstands und das Pellet auf Eis. Hinweis: Dieser Pellet wird in der Farbe weiß (leicht unterscheidbar von ungebrochener Zellen, die den Farbton des Brauns sind in Farbe) und enthält Einschlusskörperchen.</li>
	<li>Aufschwemmen Einschlusskörperchen Pellet gründlich in 20 mL eiskaltes Puffer B (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM Phenylmethanesulfonyl Fluorid (PMSF), 1 % Triton x-100). Dies erleichtert die Aluminiumionen der Membran und Membranproteine. Vortex für 1-2 min Wiederfreisetzung unterstützen.</li>
	<li>Probe bei 10.000 x g für 15 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entsorgen.</li>
	<li>Aufschwemmen der Pellet gründlich in 20 mL eiskaltes Puffer B durch aufschütteln der Röhre für 1-2 min. Stellen Sie sicher, dass das Pellet in kleine Stücke gebrochen ist. Pipettieren Probe rauf und runter zu Pellet Wiederfreisetzung zu unterstützen. Hinweis: Es ist wichtig, das Pellet Einschlusskörperchen frei von Verunreinigungen gründlich zu Aufschwemmen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.5. Der Überstand trüb oder farbig, wiederholen Sie die Schritte 2,6 bis 2,5 (in dieser Reihenfolge) bis der Überstand ist klar und farblos.</li>
	<li>Das Pellet in 20 mL eiskaltes Puffer C (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM PMSF) durch aufschütteln der Röhre für 1-2 min aufzuwirbeln.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.5.</li>
	<li>Fügen Sie 25 mL eiskaltes denaturierenden Puffer D (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 M Harnstoff, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 0,2 mM PMSF) um die Einschlusskörperchen Pellet aufzulösen. Aufschwemmen Sie gründlich durch Vortexen für 1-2 Minuten, oder bis das Pellet in kleine Stücke gebrochen ist.</li>
	<li>Mischen Sie die Suspension durch axiale Rotation mit einer Rotationsrate von 30 u/min für 30-120 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Klären Sie die denaturierten Proteinlösung durch Zentrifugation bei 30.000 x g, 4 ° C für 30 min, legen Sie überstand auf Eis und verwerfen Sie das Pellet zu.</li>
	<li>Die Konzentration des Proteins mit der Bradford-Test zu messen. 24 nehmen Sie ein Aliquot für SDS-Gel Analyse zu und legen Sie sie bei-20 ° C. Hinweis: an dieser Stelle das Verfahren kann durch die regelmÄÑig Probe Snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff angehalten werden und halten Sie es bei-80 ° C für die Lagerung.</li>
</ol>(3) Protein Umfaltung
<ol><li>Bereiten Sie 250 mL Puffer E (3 M Harnstoff, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,4 M L-Arginin Monohydrochloride 20 mM reduzierte L-Glutathion, 2 mM oxidierte L-Glutathion) in einen 500-mL-Becherglas und kühlen Sie den Puffer bis auf 4 ° C.</li>
	<li>Hinzufügen von 60 mg von denaturiertem Protein-Mix mit seinem6-Tlp3-LBD in Schritt 2.13 bis 250 mL Puffer E, rühren die Puffer bei 500 u/min erhalten. Inkubieren Sie den refolding Mix unter ständigen Rühren bei 500 u/min für 24-48 h bei 4 ° C. Die endgültige Proteinkonzentration in diesem Schritt ist 0,2 mg mL-1.</li>
	<li>7 L Puffer A in einem 8-10 L Eimer vorbereiten und kühlt es auf 4 ° C in Vorbereitung für den nächsten Schritt (Schritt 3.4), die in 24-48 h stattfinden wird (siehe Flussdiagramm in Abbildung 1).</li>
	<li>Tauchen Sie eine ~ 50 cm Stück Dialyse Schläuche mit überhöhten 28 mm Durchmesser, mit Molekulargewicht Cut-off bei 12-14 kDa in 200 mL 10 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure Binatrium Salz (EDTA-Na2) und Erhitzen über einer Gasflamme zum Kochen bringen. Spülen Sie die Dialysemembran mit 200 mL DdH2O.</li>
	<li>Klemmen Sie ein Ende des Dialysemembran mit einem Dialyse-Schlauch-Verschluss und übertragen Sie die 250 mL Umfaltung in Schritt 3.2 in das Rohr Dialyse erhaltene Mischung zu. Schließen Sie das offene Ende mit einem anderen Klemme. Überprüfen Sie die Integrität der Membran, um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind.</li>
	<li>Legen Sie die Dialyse-Röhre in ein Dialyse-Eimer mit vorgekühlten 7 L Puffer A im Schritt 3.3 hergestellt. Legen Sie eine magnetische rühren bar, um sicherzustellen, dass es nicht den Dialyse-Schlauch unter Rühren berühren.</li>
	<li>Dialyse die Probe bei 4 ° C mit 500 u/min weiter rühren und ändern Sie den Puffer mindestens vier Mal über einen Zeitraum von 12 h. Lassen Sie nach der letzten Änderung der Puffer die Probe um über Nacht dialyse. Hinweis: Während der Dialyse, ist das Übermaß an Harnstoff (~ 3 M) allmählich aus der denaturierten Proteinlösung entfernt ermöglicht das Protein zu entfalten. Am Ende der Dialyse kann schwere Proteinfällung beobachtet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Dialyse-Röhre aus dem Eimer und übertragen Sie seinen Inhalt in einen 500-mL-Becherglas zu. Halten Sie die Proteinlösung auf Eis, sofern nicht anders angegeben.</li>
	<li>Filtern Sie die Proteinlösung durch eine 0,43 µm Pore Größe Membran in eine 500 mL Flasche, ausgefälltes Eiweiß zu entfernen.</li>
</ol>4. Reinigung von seiner6-tagged Proteins mit immobilisierten Metallion Affinitätschromatographie
<ol><li>
Kostenlos und equilibrate eine 5 mL abgepackte chelatieren Spalte.
	<ol>
<li>Schließen Sie die Spalte an eine peristaltische Pumpe, um sicherzustellen, dass keine eingeschlossen in den verbindenden Rohrleitungen Luft.</li>
		<li>Waschen Sie die Spalte von 25-50 mL DdH2O. auf der Durchreise</li>
		<li>Laden Sie die Spalte, indem 3 mL 0,1 M NiCl2 laden und dann durch 25 mL DdH2O.</li>
		<li>Equilibrate der Spalte mit 25 mL Puffer F (Beladung Puffer, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passen Sie die schnittsicheren Protein Probe im Schritt 3,9 auf die Zusammensetzung der Puffer F durch Zugabe von 2,5 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL 5 M NaCl und 2,5 mL der Stammlösungen 2 M Imidazol.</li>
	<li>Laden Sie die Probe auf die Säule bei einer Rate von 5 mL/min oder weniger und verwerfen die Durchströmung (ungebundene Proteine).</li>
	<li>Waschen Sie die Spalte mit 50-100 mL Puffer F, unspezifisch gebundene Proteine entfernen und entsorgen der durchströmten.</li>
	<li>Eluieren seiner6-Tlp3-LBD mit 25 mL Puffer G (Elution Buffer, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol) und bündeln die durchströmten Brüche, enthält das Protein (wie mit dem Bradford-Reagenz bestimmt).</li>
	<li>Die Konzentration des Proteins in der gepoolten Probe mit der Bradford-Test zu messen. Nehmen Sie eine kleine aliquoten für SDS-PAGE-Analyse und Platz bei-20 ° C.</li>
</ol>5. seine6-tag-Entfernung mit TEV Protease (Optional)
<ol><li>Bereiten Sie vor, und kühlen Sie bis zu 4 ° C, 4 L Puffer H (TEV Spaltung Puffer, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 % (V/V) Glycerin, 2 mM DVB-t).</li>
	<li>Schneiden Sie ca. 5-7 cm Dialyse Schlauch (Durchmesser ca. 2-3 cm) und Tauchen sie in 200 mL DdH2O.</li>
	<li>Fügen Sie seine6-getaggt TEV Protease, die seine6-Tag Protein im Schritt 4.5 zu einem endgültigen Molverhältnis 1 TEV vorbereitet: 8 Protein.</li>
	<li>Klemmen Sie ein Ende des Schlauches mit einem Dialyse-Schlauch-Verschluss und füllen Sie ihn mit dem Protein/TEV Protease-Gemisch. Schließen Sie das andere Ende und sicherzustellen Sie, dass keine Lecks vorhanden sind.</li>
	<li>Ort die Dialyse Tubus in die vorgekühlte 4 L Puffer H (aus Schritt 5.1) und inkubieren Sie es bei 4 ° C mit kontinuierlichen rühren für 2 h. Änderung der Puffer und weiterhin Dialyse über Nacht die TEV-vermittelte Spaltung Reaktion abgeschlossen.</li>
	<li>In der Zwischenzeit bereiten und kühl (4 ° C) 4 L Puffer ich (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 % (V/V) Glycerin) in Vorbereitung für den nächsten Tag.</li>
	<li>Nach der Übernachtung Dialyse austauschen des Puffers, Puffer, die ich im Schritt 5.6 vorbereitet und dialyse für weitere 1-2 h bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie den Schlauch aus der Dialyse-Eimer, ausclipsen Sie ein Ende des Rohres und übertragen Sie die Proteinlösung auf eine 50 mL Falcon-Röhrchen. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,43 µm Pore Größe Spritze Filter und halten sie auf dem Eis, sofern nicht anders angegeben.</li>
	<li>Messen Sie das Volumen der Probe und passen Sie die Tris, NaCl und Imidazol Konzentration auf die Zusammensetzung der Puffer F (z. B. für 25 mL Proteinlösung im Puffer J 0,25 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL 5 M NaCl und 0,25 mL 2 M Imidazol hinzufügen).</li>
	<li>Bereiten Sie eine 5 mL HiTrap chelatisierenden HP Spalte, wie unter Punkt 4.1 beschrieben.</li>
	<li>Laden Sie die Probe auf die Säule (Durchfluss: 5 mL/min) und sammeln Sie die Flow-through enthält der unmarkierten Tlp3-LBD (Rückstände 42-291). Uncleaved Protein, die gespalten sein6-Tag und seine6- TEV bleiben nach der Spalte.</li>
	<li>Waschen Sie die Spalte mit 5 mL Puffer F (Beladung Puffer) um alle unmarkierten Protein zu durchfließen und sammeln das Eluat zu ermöglichen.</li>
	<li>Pool das Eluat in Schritten 5.11 und 5.12 erhalten und die Proteinkonzentration zu messen. Nehmen Sie eine kleine aliquoten und bei-20 ° C für die SDS-PAGE-Analyse zu speichern.</li>
</ol>6. Größe-Ausschluss Chromatographie (Gel Filtration) des Tlp3-LBD
<ol><li>Bereiten Sie 1 L Puffer A (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) und Filtern Sie es mit einem 0,43 µm-Membran.</li>
	<li>Eine 26/60-Größe-Ausschluss-Spalte mit Puffer A bei einer Durchflussmenge von 4 mL/min Equilibrate.</li>
	<li>Die Protein-Probe im Schritt 5.13 auf ein Volumen von 3 – 4 mL 15 mL zentrifugale Konzentrator mit einer 10 kDa Cutoff (4 ° C, 4.000 x g) zu konzentrieren.</li>
	<li>Klären Sie die Proteinlösung durch Zentrifugation bei 4 ° C für 30 min ausgefälltes Eiweiß entfernen 13.000 x g.</li>
	<li>Laden Sie die Probe auf die vorab äquilibriert 26/60 Gel-Filtration-Säule. Durchzuführen Sie Chromatographie in Puffer A bei einer Durchflussrate von 4 mL/min Monitor die UV-Ablaufverfolgung. Tlp3-LBD elutes bei einem Retentionsvolumen von 210-220 mL. Die Peak-Fraktionen zu bündeln.</li>
	<li>Die Proteinkonzentration zu messen. Nehmen Sie eine kleine aliquoten für SDS-PAGE-Analyse.</li>
</ol>(7) SDS-PAGE-Analyse der Proben in verschiedenen Stadien der Proteinreinigung
<ol><li>Bereiten Sie 1 L von SDS-PAGE läuft Buffer (Puffer J), mit 25 mM Tris, 250 mM Glycin pH 8,3 und 0,1 % (w/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS).</li>
	<li>10 mL 5 x SDS-PAGE Loading Buffer (Puffer K) bereiten, mit 0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10 % (w/V) SDS, 50 % (V/V) Glycerin und 1 mM DTT 0,05 % Bromophenol blue.</li>
	<li>Die Aliquoten gesammelt während der verschiedenen Schritte der Reinigung zu ermöglichen (Schritte 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) Auftauen.</li>
	<li>Mischen Sie für jede Probe das Volumen entspricht 15 µg des Gesamt-Protein mit 2 µL 5 X SDS-PAGE laden zu puffern, und stellen Sie die Lautstärke auf 10 µL mit DdH2O.</li>
	<li>Die Proben bei 95 ° C für ca. 5-10 min erwärmen, mit 10.000 x g für 30 s und Transfer drehen die Proben in ein sauberes Röhrchen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine SDS-PAGE-Gel, mit 15 % Polyacrylamid-Gel zu trennen (für 5 mL: 2,5 mL 30 % (w/V) Bis-Acrylamid, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 1,2 mL DdH2O, 50 µL 10 % (w/V) SDS, 50 µL 20 % (w/V) Ammonium Bleichen (APS), 3 µL Tetramethylethylenediamine (TEMED) und 5 % Polyacrylamid-Gel stapeln (für 2 mL: 340 µL 30 % (w/V) Bis-Acrylamid, 250 µL 1 M Tris pH 6.8, 1,37 mL DdH2O, 20 µL 10 % (w/V) SDS, 20 µL 20 % (w/V) APS, 2 µL TEMED).</li>
	<li>Montieren Sie die Elektrophorese-Apparatur und füllen Sie ihn mit 1 x SDS-Page Puffer nach Empfehlung des Herstellers ausgeführt.</li>
	<li>Laden Sie ein Protein Molekulargewicht Marker und die Proben im Schritt 7,5 vorbereitet. Führen Sie die Elektrophorese bei einem konstanten Strom von 25 mA.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gel in einen Behälter und spülen Sie ihn mit DdH2O. hinzufügen 150 mL Färbelösung mit 25 % (V/V) Isopropanol, 10 % (V/V) Essigsäure und 0,03 % (w/V) Brilliant Blue R-250 Coomassie-Blau. Stellen Sie den Behälter auf eine horizontale Drehung Plattform für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Spülen Sie das Gel mit DdH2O und setzen Sie die destaining Lösung mit 5 % (V/V) Methanol und Essigsäure 7 % (V/V). Destain beim Mischen über eine horizontale Drehung-Plattform für 1 h.</li>
	<li>Bild das Gel und zu analysieren.</li>
</ol>8. Runde Dichroismus (CD) Spektroskopie Analyse der Sekundärstruktur des schnittsicheren reines Eiweiß
<ol><li>Übertragen Sie 0,5 - 1 mg schnittsicheren Protein in Schritt 6.6 in ein Dialyse-Rohr erhaltenen und legen Sie es in einem Dialyse-Eimer mit 5 L Puffer L (50 mM Natriumphosphat pH 7.4) vorgekühlt, 4 ° C. Dialyse die Probe bei 4 ° C unter ständigen rühren und mindestens 3-4 Puffer Änderungen ausführen über 2-4 h vor dem Verlassen der Probe um über Nacht dialyse.</li>
	<li>Die dialysed Proteinlösung auf 0,06 mg mL-1 mit einem 10 kDa Cutoff zentrifugale Konzentrator zu konzentrieren.</li>
	<li>Klären Sie die Lösung durch Zentrifugation bei 13.000 x g, 4 ° C für 30 Minuten.</li>
	<li>Notieren Sie das weit UV-CD-Spektrum der Probe bei 25 ° C in einem Wellenlängenbereich von 200-260 nm mit einer Spectropolarimeter mit einer Abtastrate von 20 nm min-1. Verwenden Sie den Dialyse-Puffer als ein leeres Steuerelement. Wiederholen Sie die Aufnahme in dreifacher Ausfertigung und erzeugen Sie das gemittelte Spektrum zu.</li>
	<li>Berechnen den Sekundärstruktur Inhalt von der CD deconvoluting Spektren mit dem CDSSTR-Programm von der DichroWeb trennen25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Ein einfaches Verfahren für Ausdruck und Umfaltung von Einschlusskörperchen der periplasmatischen LBD der bakteriellen Chemorezeptor Tlp3 wird vorgestellt. Vorbereitung des reinen Proteins beinhaltet Überexpression des Gens Haustier-Plasmid-encoded in E. Coli, Reinigung und Lutensol Einschlusskörperchen, Umfaltung des denaturierten Proteins und dessen Reinigung durch die aufeinander folgenden Affinität und Größe-Ausschluss Chromatographie Schritte. Die Harnstoff-erleichtert Denaturierung und Verdünnung/Dialyse-v...

Chemotaxis und Motilität haben gezeigt, eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Campylobacter Jejuni spielen, durch die Förderung der bakteriellen Besiedelung und Invasion der Host1,2,3. Chemotaxis ermöglicht Bakterien ein optimales Umfeld für Wachstum, Richtung, wie durch chemische Signale geführt. Dieser Prozess beinhaltet die Anerkennung der intrazellulären und Umwelt chemische Signale durch eine Reihe von Proteinen bezeichnet Chemorezeptoren oder Wandler-ähnliche Proteine (Tlps). Die meisten Chemorezeptoren sind Membran eingebettet Proteine mit einer extracytoplasmic Liganden-bindende Domäne (LBD), eine transmembrane Domäne und einer zytoplasmatischen Signal Domäne, von denen die letztere mit der cytosolischen Signalisierungen Proteinen interagiert, die Übertragung des Signals die flagellar Motoren4,5,6,7.
Elf verschiedene Chemorezeptoren wurden in der C. Jejuni Genom4,8identifiziert. Bisher haben nur einige der diese Chemorezeptoren geprägt und Liganden Spezifität der Tlp19Tlp310,11, Tlp411, Tlp712und Tlp1113 ist bekannt. Identifizierung von natürlichen Liganden der verbleibenden Chemorezeptoren in dieser Spezies und zahlreiche Chemorezeptoren in andere Bakterien kann erheblich erleichtert werden, durch die Produktion von gefalteten und hochreinen rekombinante Chemorezeptor Weihnachtskleidern14, 15 , 16. jedoch Versuche, heterologously periplasmatischen Weihnachtskleidern der bakteriellen Chemorezeptoren in Escherichia coli oft ausdrücken führen ihre Ausrichtung in Einschlusskörperchen17,18,19 . Dennoch kann dieses Phänomen einfach Isolierung und Wiederherstellung des Proteins in der hand erleichtern. Hier ist eine Methode zur Proteingewinnung aus Einschlusskörperchen, die Umfaltung und Reinigung, mit der periplasmatischen LBD von C. Jejuni Chemorezeptor Tlp3 als Beispiel vorgestellt. In diesem Beispiel wurde gewählt, weil Tlp3-LBD dCACHE Familie20 Fernerkundung Domains gehört, die reichlich in Zweikomponenten-Histidin-Kinasen und Chemorezeptoren in Prokaryoten20,21, gefunden werden 22 , 23.
Bei diesem Ansatz der Ausdruck Konstrukt, basierend auf einem pET151/D-TOPO-Vektor wurde entwickelt, um eine N-terminale seiner6integrieren-Tag, gefolgt von einem Tabak Ätzen Virus (TEV) Protease Spaltstelle für nachfolgende Tag Entfernung19. Das Protokoll beschreibt Protein Überexpression in E. Coli, Isolation und Harnstoff-vermittelten Lutensol Einschlusskörperchen und Protein Umfaltung durch Harnstoff-Depletion. Anschluss an Umfaltung, die Probe wird durch Affinitätschromatographie mit optionales Tag Entfernung und Größe-Ausgrenzung Chromatographie gereinigt. Die gefaltete Zustand des gereinigten Proteins ist mit kreisförmigen Dichroismus Spektroskopie bestätigt. Dies ist eine modifizierte Version der Methode, die bisher entwickelt wurde, um zu erholen und Reinigen der LBD eine unterschiedliche Chemorezeptor, Helicobacter Pylori TlpC19. Dieses Verfahren, die in Abbildung 1zusammengefasst ergibt 10-20 mg rein, untagged Tlp3-LBD pro 1 L der bakteriellen Kultur mit einer Protein-Reinheit von > 90 % als geschätzt durch SDS-PAGE.

<table><tbody><tr><td>Trisbase</td><td>AMRESCO</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>MERK MILLIPORE</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>G-BIOSCIENCES</td><td>A051-B</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)</td><td>MERCK</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-thiogalactosid (IPTG)</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> AST0487 <tr><td>Harnstoff</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0568</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td>C-1029</td><td></td></tr><tr><td>L-Argininmonohydrochlorid</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>Reduziertes L-Glutathion</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Oxidiertes L-Glutathion</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat (NaH2PO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz-Dehydrat (EDTA)</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC20302.260</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> BIOGB0232 <tr><td>Nickelchlorid (NiCl2)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0167</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Ungefärbte Proteinleiter, breit Messbereich (10-250 kDa)</td><td>NEW ENGLAND BIOLABS</td><td>P7703</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultracel Zentrifugalkonzentrator (Millipore)</td><td>MERCK</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Schlauch</td><td>FALCON</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseschlauch</td><td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td><td>Dialyseschlauch</td><td></td></tr><tr><td>Schlangenhaut</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Vorverpackte HiTrap Chelat-HP-Säule</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>17-0408-01</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C5 Hochdruck-Homogenisator</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex&trade; - C5</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltikpumpe P-1</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>18-1110-91</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HiLoad 26/60 Größenausschlusssäule&nbsp;</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td></td><td></td></tr> 28989336 <tr><td>JASCO J-815 Spektropolarimeter</td><td>JASCO</td><td>J-815</td><td></td></tr></tbody></table>

methode für effiziente umfaltung und reinigung des chemorezeptor-liganden-bindende domäne

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identifizierung von natürlichen Liganden der Chemorezeptoren und strukturelle Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Grundlagen der Liganden Besonderheit kann durch die Produktion von Milligramm-Mengen rein, gefalteten Ligand verbindliche Domains erheblich erleichtert. Versuche heterologously periplasmatischen Ligand verbindliche Domänen der bakteriellen Chemorezeptoren in Escherichia coli (E. Coli) oft zum Ausdruck bringen, führen ihre Ausrichtung in Einschlusskörperchen. Hier ist eine Methode zur Proteingewinnung aus Einschlusskörperchen, die Umfaltung und Reinigung, mit den periplasmatischen dCACHE Liganden-bindende Domäne von Campylobacter Jejuni (C. Jejuni) Chemorezeptor Tlp3 als Beispiel vorgestellt. Der Ansatz beinhaltet Expression des Proteins des Interesses mit einem spaltbaren seiner6-Tag, Isolation und Harnstoff-vermittelten Lutensol von Einschlusskörperchen, Protein Umfaltung von Harnstoff Entleerung und Reinigung durch Affinitätschromatographie, gefolgt von Tag-Entfernung und Größe-Ausschluss-Chromatographie. Die kreisförmigen Dichroismus Spektroskopie wird verwendet, um die gefalteten Zustand des reinen Proteins zu bestätigen. Es hat sich gezeigt, dass dieses Protokoll in der Regel nützlich für die Produktion von Milligramm-Mengen dCACHE periplasmatischen Ligand verbindliche Domains von anderen bakteriellen Chemorezeptoren in eine lösliche und kristallisierbaren Form.

Rekombinante Expression von seinen6-Tlp3-LBD in E. Coli Protein Ablagerung in Einschlusskörperchen führte. Der Ausdruck Ertrag aus 1 L der Bakterienkultur in Schritt 2.13 berechnete war etwa 100 mg seine6-Tlp3-LBD in Einschlusskörperchen hinterlegt. Das Protein isoliert Verfahren, hier beschrieben und dargestellt in Abbildung 1, besteht aus Aluminiumionen Einschlusskörperchen, Protein Umfaltung und Reinigung durch Affinitätschro...

Eine Prozedur wird vorgestellt, für die Umfaltung der dCACHE periplasmatischen Liganden-bindende Domäne von Campylobacter Jejuni Chemorezeptor Tlp3 Einschlusskörperchen und die Reinigung zu Milligramm-Mengen des Proteins führen.

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Chemorezeptor-Liganden-Bindungsdomäne aus Einschlusskörpern zu falten und sie für die Verwendung in strukturellen und funktionellen Studien zu reinigen. Um festzustellen, welche Signale ein bakterieller Chemorezeptor sendet und wie, kann man die isolierten Ligandenbindungsdomänen verwenden, um gegen kleine Molekülbibliotheken zu screenen oder die Struktur mit und ohne Liganden zu bestimmen. Die Unterdrückung der extrazellulären Ligandenbindungsdomäne in E.coli führt häufig zur Ablagerung in Einschlusskörpern.Hier zeigen wir, wie eine Milligrammmenge an funktionellem Protein aus den Einschlusskörpern zurückgewonnen werden kann. Zu Beginn inokulieren Sie 150 ml sterile LB-Bouillon mit 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin mit BL21-CodonPlus RIPL-Zellen, die mit dem pET151 D-TOPO-Vektor für die Expression von Hexahistidin TIp3-LBD transformiert wurden. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 200 U/min und 37 Grad Celsius.Bereiten Sie sechs 2-Liter-Erlenmeyerkolben vor, die 800 ml sterile LB-Bouillon und 50 Mikrogramm Ampicillin pro ml enthalten. Beimpfen Sie jeden Kolben mit 20 ml der Nachtkultur. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius unter ständigem Schütteln bei 200 U/min, bis der OD600 0,6 erreicht.Zu diesem Zeitpunkt wird die Proteinexpression induziert, indem jedem Kolben 1 millimolares IPTG zugesetzt wird. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius in einem Shaker bei 200 U/min für weitere vier Stunden. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 5000 xg und vier Grad Celsius für 15 Minuten.Entsorgen Sie dann den Überstand. Übertragen Sie alle Zellpellets in ein 250-ml-Becherglas und fügen Sie 100 ml Puffer A hinzu. Wenn sie gefroren sind, lassen Sie die Zellen vollständig auftauen und resuspendieren Sie das Pellet. Bewahren Sie die Probe auf Eis auf, sofern nicht anders angegeben.Führen Sie anschließend die resuspendierten Zellen dreimal durch einen Hochdruck-Homogenisator, um die Zellen zu lysieren und eine vollständige Scherung der genomischen DNA sicherzustellen. Zentrifugieren Sie dann das Lysat bei 10.000 xg und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Entnehmen Sie eine Probe von einem ml des Überstands und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für die anschließende SDS-PAGE-Analyse.Entsorgen Sie dann den restlichen Überstand und legen Sie das Pellet auf Eis. Als nächstes resuspendieren Sie das Einschlusskörper-Pellet gründlich in 20 ml eiskaltem Puffer B. Dies erleichtert die Solubilisierung der Membran und der Membranproteine. Wirbeln Sie die Probe ein bis zwei Minuten lang vor, um die Resuspension zu unterstützen.Nach dem Zentrifugieren der Probe wird das Pellet erneut gründlich in 20 mL eiskaltem Puffer B resuspendiert, indem das Röhrchen zunächst ein bis zwei Minuten lang vorgeschoben wird. Achten Sie darauf, dass das Pellet in kleine Stücke gebrochen wird. Pipettieren Sie dann die Probe auf und ab, um sie wieder zu suspendieren.Die Probe wird wie zuvor zentrifugiert und der Überstand verworfen. Wenn der Überstand trüb oder gefärbt ist, zentrifugieren Sie die Probe erneut und verwenden Sie zusätzlichen eiskalten Puffer B, um sie wieder zu suspendieren. Wiederholen Sie das Zentrifugieren und die Resuspension, bis der Überstand klar und farblos ist, bevor Sie erneut pelletieren.Geben Sie 20 mL eiskalten Puffer C in das Pellet und resuspendieren Sie es, indem Sie das Röhrchen ein bis zwei Minuten lang vortexen. Fügen Sie dann, nachdem Sie die Probe gedreht haben, 25 ml eiskalten, denaturierenden Puffer D hinzu. Resuspendieren Sie das Einschlusskörperpellet gründlich, indem Sie das Röhrchen ein bis zwei Minuten lang vortexen oder bis das Pellet in kleine Stücke zerbrochen ist. Mischen Sie die Suspension durch axiale Drehung bei 30 U/min und 4 Grad Celsius für 30 bis 120 Minuten.Die denaturierte Proteinlösung wird durch Zentrifugation bei 30.000 xg und vier Grad Celsius für 30 Minuten geklärt. Legen Sie dann den Überstand auf Eis und entsorgen Sie das Pellet. Unter Rühren von 250 ml Puffer E bei 500 U/min werden 60 Milligramm denaturierte Proteinmischung mit Hexahistadin TIp3-LBD hinzugefügt.Inkubieren Sie die Faltmischung bei vier Grad Celsius unter ständigem Rühren bei 500 U/min für 24 bis 48 Stunden. Die endgültige Proteinkonzentration beträgt 0,2 mg pro ml. Nachdem Sie sieben Liter vorgekühlten Puffer A und Dialyseschlauch gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, klemmen Sie mit dem Verschluss des Dialyseschlauchs ein Ende der Dialysemembran ein und übertragen Sie das Dialysegemisch in den Schlauch.Klemmen Sie dann das offene Ende fest und stellen Sie sicher, dass keine Undichtigkeiten vorhanden sind. Legen Sie den Dialyseschlauch in einen Dialyseeimer mit dem vorgekühlten Puffer A. Fügen Sie dann einen magnetischen Rührstab hinzu, der darauf achtet, dass er den Dialyseschlauch beim Rühren nicht berührt. Dialysieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius unter kontinuierlichem Rühren bei 500 U/min und wechseln Sie den Puffer mindestens viermal über einen Zeitraum von 12 Stunden.Nach dem letzten Pufferwechsel lassen Sie die Probe über Nacht dialysieren. Nehmen Sie am nächsten Morgen den Dialyseschlauch aus dem Eimer und geben Sie den Inhalt in ein 500-ml-Becherglas. Bewahren Sie die Proteinlösung auf Eis auf, sofern nicht anders angegeben.Filtrieren Sie die Proteinlösung durch eine porengroße Membran von 0,43 Mikrometern in eine 500-ml-Glasflasche, um das gefällte Protein zu entfernen. Nach dem Waschen, Laden und Äquilibrieren einer Chelatsäule gemäß dem Textprotokoll passen Sie die erhaltene gefaltete Proteinprobe an die Zusammensetzung von Puffer F an, indem Sie 25 ml 5 M Natriumchlorid, 2,5 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 und 2,5 ml 2 M Imidazol-Stammlösungen hinzufügen. Laden Sie die Probe mit einer Geschwindigkeit von 5 ml pro Minute oder weniger auf die Säule und verwerfen Sie den Durchfluss, der die ungebundenen Proteine enthält.Waschen Sie dann die Säule mit 50 bis 100 ml Puffer F, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen, und verwerfen Sie den Durchfluss. Eluieren Sie das Hexahistadin TIp3-LBD mit 25 mL Puffer G. Poolen Sie dann die Durchflussfraktionen, die das Protein enthalten. Nach der Vorbereitung von Puffer H und Dialyseschläuchen gemäß dem Textprotokoll fügen Sie dem Hexahistadin-markierten Protein im Schlauch eine Hexahistadin-markierte TEV-Protease hinzu.Fügen Sie ein endgültiges molares Verhältnis von einem TEV zu acht Protein hinzu. Legen Sie den eingespannten Dialyseschlauch in die vorgekühlten vier Liter Puffer H und inkubieren Sie ihn bei vier Grad Celsius unter ständigem Rühren zwei Stunden lang. Wechseln Sie dann den Puffer und setzen Sie die Dialyse über Nacht fort, damit die TEV-vermittelte Spaltungsreaktion abgeschlossen werden kann.Nach dem Wechsel zu Puffer I, dem Filtrieren der Proteinlösung und der erneuten Anpassung der Probe wird die Probe auf eine vorbereitete fünf ml HiTrap chelatbildende HP-Säule geladen. Sammeln Sie bei einer Flussrate von fünf ml pro Minute den Durchfluss, der das nicht markierte TIp3-LBD enthält. Auf gespaltenem Protein werden das gespaltene Hexahistadin-Tag und das Hexahistadin-TEV von der Säule zurückgehalten.Verwenden Sie fünf ml Puffer F, um die Säule zu waschen, damit das nicht markierte Protein durchfließen und das Eluat sammeln kann. Nach dem Äquilibrieren einer Größenausschlusssäule und dem Konzentrieren und Klären der Proteinprobe gemäß dem Textprotokoll wird die Probe auf die voräquilibrierte 26/60-Gelfiltrationssäule geladen. Tragen Sie Puffer A mit einer Flussrate von vier ml pro Minute auf und überwachen Sie die UV-Spur auf Proteinelution.TIp3-LBD eluiert bei einem Retentionsvolumen von 210 bis 220 ml. Nach der Chromatographie werden die Fraktionen gepoolt, dann die Proteinkonzentration gemessen und die SDS-PAGE durchgeführt. Das in diesem Video gezeigte Proteinisolierungsverfahren ergab 10 bis 20 mg reines unmarkiertes TIp3-LBD pro einem Liter Bakterienkultur.Wie hier zu sehen ist, hat das aus der Gelfiltrationssäule eluierte Protein einen einzigen, symmetrischen Peak, der einem Retentionsvolumen von 220 mL mit einem berechneten Molekulargewicht von 29 kDa entspricht. Wie hier von SDS-PAGE gezeigt, enthielten die Einschlusskörper überwiegend Hexahistadin TIp3-LBD mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 28 kDa, was nahe an dem Wert liegt, der aus der Aminosäuresequenz von 31,8 kDa berechnet wurde. Die Schritte zur Entfernung von Hexahistadin-Markierungen, zur Affinitätschromatographie und zur Gelfiltration ergaben hochreines Protein.Die CD-Spektroskopie mit CDSSTR zeigte, dass die Sekundärstruktur von Hexahistidin TIp3-LBD aus 31 % Alpha-Helix- und 23 % Beta-Faltblatt-Gehalt besteht. Diese lagen auch nahe an den vorhergesagten Werten von 37 % bzw. 26 % aus der Sequenzanalyse mit dem JPred 3-Server. Dieses Protokoll erfordert mindestens fünf Tage von Anfang bis Ende und kann bei Bedarf in drei verschiedenen Phasen pausiert werden.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine gründliche und vollständige Resuspension der Einschlusskörper im denaturierenden Puffer durch Vortexen oder Auf- und Abpipettieren für diese gesamte Realisierung entscheidend ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Ligandenbindungsdomäne des Chemorezeptors TIp3 wieder falten und reinigen können. Das gereinigte Protein kann zur Bindung von Säuren verwendet werden, um die Spezifität des Liganden für diesen Rezeptor zu untersuchen.Darüber hinaus haben wir bereits gezeigt, dass das durch dieses Verfahren erhaltene Protein zur Herstellung hochgeordneter Kristalle verwendet werden kann, was den Weg für die Untersuchung der strukturellen Grundlagen für seine Ligandenspezifität ebnete. Dieses Verfahren könnte im Allgemeinen nützlich sein für die Produktion von mg-Mengen von Chemorezeptoren aus anderen Bakterien in kristallisierbarer und löslicher Form. Wir haben dieses Protokoll in seiner ursprünglichen oder leicht modifizierten Form verwendet, um die Ligandenbindungsdomäne anderer Chemorezeptoren dieses Typs für kristallographische Studien neu zu falten und zu reinigen.Bitte denken Sie daran, dass in jedem einzelnen Fall eine Optimierung des Protokolls erforderlich sein wird, z. B. die Zusammensetzung der Denaturierungs- und Rückfaltungspuffer und die Inkubationszeiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

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