تحسين 2D و 3D الجلد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تعزيز ترسب المصفوفة خارج الخلوية وتحسين نماذج الجلد الحالية ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام الازدحام الجزيئي الضخم. يعمل الازدحام على تحسين توليد المصفوفات المشتقة من الخلايا، والمستنبتات النسيجية الناضجة في إطار زمني مكثف. ويمكن لهذه الطريقة أن تجيب على أسئلة جوهرية في مجال هندسة الأنسجة لأنها توفر طرقاً محسنة لتوليد مصفوفات خارج خلوية مشتقة من الخلايا للهندسة الحيوية للجلد والأنسجة الأخرى.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية إنتاج المصفوفات المشتقة من الخلايا وبنى الجلد النمطية العضوية في إطار زمني مختصر بشكل كبير عند تطبيق الازدحام الجزيئي الضخم على هذه المزارع. وتتيح تقنية مجهر الانعكاس التداخلي تصور إجمالي ترسب المصفوفة خارج الخلوية دون الحاجة إلى صبغ الأجسام المضادة. وستمتد تطبيقات هذه التقنيات من دراسات ترسب المصفوفة خارج الخلوية بواسطة خلايا الجلد إلى تحسين علاجات الجروح، خاصة مع إنتاج بدائل جلدية أفضل ومزارع نسيجية لغرض التطعيم.

في البداية، يتم استزراع 50,000 من الخلايا الليفية الأولية، أو الخلايا الكيراتينية الأولية، أو مزرعة مشتركة منهما، في واحد مليلتر من الوسط لكل بئر، وذلك في آبار طبق استزراع مكون من 24 بئراً. تُترك الخلايا لتلتصق في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C و5% من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. بعد ذلك، يتم التخلص من الوسط القديم واستبداله بواحد مليلتر من وسط جديد يحتوي على مواد تكدس جزيئية كبيرة و100-micromolar من حمض الأسكوربيك.

قم بتحضين المزارع لمدة ستة أيام، مع تغيير الوسط كل يومين. أجرِ اختبار التألق المناعي وبصمة ويسترن وفقاً للبروتوكول المكتوب. ولتجهيز واستخدام مصفوفة مشتقة من الخلايا، بعد زراعة الخلايا لمدة ستة أيام مع المزدحمات الجزيئية وحمض الأسكوربيك كما تم توضيحه للتو، قم بإزالة الخلايا من الطبقات الخلوية للحصول على مصفوفة مشتقة من الخلايا، وذلك باستخدام 1X PBS لغسل الطبقات الخلوية مرتين أولاً.

اشفط محلول PBS، ثم أضف 250 µL من sodium deoxycholate بتركيز 0.5% واحضن المزيج على الثلج لمدة 10 دقائق. اشفط ناتج تحلل الخلايا، ثم أضف 250 µL إضافية من sodium deoxycholate بتركيز 0.5% وكرر عملية الحضن لمدة 10 دقائق والشفط مرتين أخريين. استخدم الماء المقطر لغسل المصفوفة المشتقة من الخلايا مرتين.

قم بسحب الماء، ثم أضف 1X PBS. تُخزن المصفوفة في درجة حرارة أربعة درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. ولتحضير معلق خلوي ثانوي، اسحب PBS من المصفوفة، ثم ازرع 50,000 من الخلايا الكيراتينية فوق F mat على سبيل المثال.

اترك الخلايا لتلتصق طوال الليل. لإجراء مجهرية الانعكاس التداخلي، أو RIM، على مصفوفة مشتقة من الخلايا، قم بعملية الحصول على الصور باستخدام مجهر بؤري وفقاً للبروتوكول النصي. لصب هلام كولاجين مع تغليف الخلايا الليفية في غرزة زراعة خلوية، ضع مقدار 10 milliliters من كولاجين ذيل الجرذ من النوع الأول في كؤوس زجاجية باردة.

أضف 1 mL من وسط DMEM البارد و0.5 mL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 M لمعادلة الكولاجين الحمضي. ثم أضف 0.5 mL من معلق الخلايا الليفية. وباستخدام ماصة باردة، وزع 12 mL من المحلول بالتساوي على أدراج زراعة الخلايا في طبق زراعة بست فتحات.

قم بتحضين الهلام عند 37 °C و5% carbon dioxide لمدة ساعة واحدة. وبمجرد أن يتصلب الهلام، اغمره في وسط الخلايا الليفية أو FM. ثم بعد تحضينه لمدة 24 ساعة، قم بشفط الـ FM. استخدم 4 mL من وسط جديد يحتوي على مواد تكدس جزيئية كبيرة (macromolecular crowders) لاستبدال الـ FM القديم، وذلك بإضافة 2 mL إلى الجزء الداخلي من قطعة إدراج المزرعة الخلوية و2 mL إلى الجزء الخارجي منها. وبعد تحضين لمدة 24 ساعة، استخدم عامل التحلل 0.125%trypsin لتحلل الخلايا الكيراتينية.

انقر على جوانب القارورة برفق لفصل الخلايا، ثم أضف وسطًا يحتوي على المصل لتحييد التربسين. بعد عد الخلايا، قم بتحضير معلق من الخلايا الكيراتينية. بعد ذلك، اسحب الوسط من إدراجات المزرعة الخلوية، وأضف الخلايا الكيراتينية فوق الهلام.

يُحضن الهلام لمدة ساعة واحدة. وبعدما تلتصق الخلايا الكيراتينية بسطح الهلام، يُستخدم 2 mL من KSFM، أو وسط CTN-57 الخالي من المصل، لغمر الخلايا داخل قطعة إدخال زراعة الخلايا في الهلام، ويُضاف 2 mL من FM إلى خارج قطعة إدخال زراعة الخلايا. وبعد تحضين لمدة 24 ساعة، يتم التخلص من الوسط القديم واستبداله بوسط جديد يحتوي على مواد تزاحم جزيئية كبيرة.

بعد سبعة أيام من الزرع المغمور، ولرفع المزرعة إلى واجهة الهواء والسائل، انقل قطعة إدراج المزرعة إلى طبق ذي آبار عميقة. أضف 10 milliliters من وسط التطبّق إلى الجانب الخارجي لقطعة إدراج المزرعة الخلوية، مع الحفاظ على جفاف الجزء الداخلي من قطعة الإدراج. وأخيراً، قم بتحضين المزارع وتغيير الوسط كل ثلاثة أيام لمدة 14 يوماً.

قم بحصادها ومعالجتها وفقاً للبروتوكول المكتوب. وكما هو موضح هنا، سمح الازدحام الجزيئي الضخم للخلايا الليفية بترسيب المزيد من المصفوفة خارج الخلوية أو ECM مقارنة بالمزارع الضابطة. وعند إجراء التلوين المناعي، تبين أن الخلايا الليفية كانت المودع الرئيسي للكولاجين واحد، والكولاجين أربعة، والفيبرونيكتين.

يوضح هذا الشكل أن الخلايا الليفية هي التي كانت المودع الرئيسي للكولاجين 7 وليس الخلايا الكيراتينية، وهذا هو التقرير الأول الذي يثبت نجاح ترسيب الكولاجين 7 في المختبر. وباستخدام تقنية RIM، تم رصد المدى الكامل للمصفوفة المشتقة من الخلايا. ويظهر تراكب صورة RIM مع صبغ الأجسام المضادة الكمية النسبية لمكون المصفوفة خارج الخلوية (ECM) مقارنة بالكمية الإجمالية للمصفوفة خارج الخلوية.

في نموذج جلدي ثلاثي الأبعاد خارج الجسم الحي، أدى الازدحام الجزيئي الضخم أو MMC إلى تقليل مدة الزرع من خمسة أسابيع إلى ثلاثة أسابيع، وذلك للحصول على مزرعة مشتركة لنسيج جلدي ناضج وشبيه بالعضو. وكما يظهر هنا، ومن خلال صبغ H and E، عند الأسبوع الثالث، تألفت المزرعة التي استخدم فيها MMC من بشرة متعددة الطبقات وأدمة ذات تضاريس سدوية. بالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن صبغ مناعي مكثف ومستمر للكولاجين سبعة عند الموصل البشري الأدمي في مزارع الخلايا المزدحمة، مقارنة بصبغ مناعي ضعيف ومتقطع للكولاجين سبعة في المزارع الضابطة.

كما أظهر المجهر الإلكتروني النافذ وجود لُييفات التثبيت في المزارع النسيجية التي تم إنتاجها باستخدام MMC، مما يشير إلى وجود كولاجين 7 وظيفي. ويمكن استخدام المصفوفات المشتقة من الخلايا لأغراض استزراع الخلايا الثانوي كدعامة بديلة، نظراً للحفاظ على تعقيد المصفوفة خارج الخلوية، وكون الخلايا نفسها هي التي تنتجها. ويمكن استخدام مزارع الجلد النسيجية، التي يتم إنتاجها تحت ظروف الازدحام الجزيئي الضخم، كنماذج جلدية ثلاثية الأبعاد محسنة لأنها تحتوي على أدمة ذات حواف سدوية، ووصلة أدمية بشرية رئيسية، وبشرة متعددة الطبقات.

يمكن أيضاً استخدام المزارع النسيجية العضوية، أو بدائل الجلد التي تم إنتاجها باستخدام مواد التزاحم الجزيئي الكبيرة، في عمليات تطعيم الجلد لأنها تمتلك اتصالاً ظهارياً أدمياً أكثر تطوراً، مما يرجح تحسين نجاح التطعيم. وبالإضافة إلى تعزيز ترسيب المصفوفة خارج الخلية، يمكن تطبيق التزاحم الجزيئي الكبير على أنظمة أخرى في المختبر لتعزيز التفاعلات التي يحدها معدل السرعة، دون الحاجة إلى زيادة كمية الكواشف؛ فعلى سبيل المثال، تفاعلات البوليميراز المتسلسلة.