Charakterisieren Multiskalige Mechanische Eigenschaften von Gehirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Schlag Einrückungen und Rheometrie

Das übergeordnete Ziel dieser mechanischen Charakterisierungstechniken besteht darin, die viskoelastischen Eigenschaften biologischen Gewebes auf unterschiedlichen Längenskalen und bei verschiedenen Belastungsraten zu messen. Mithilfe dieser Methoden lassen sich zentrale Fragen der biologischen Ingenieurwissenschaft beantworten. Beispielsweise, wie sich das Gehirn unter sehr hohen Belastungsraten verformt, oder wie Krankheiten wie Multiple Sklerose oder Autismus die mechanischen Eigenschaften des Gehirngewebes beeinflussen.

Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt bei Materialien mit sehr geringer Steifigkeit und sehr hoher Hydratation, wie biologischem Gewebe, darin, dass sie über einen weiten Bereich von Belastungsbedingungen getestet werden können, und außerdem über einen weiten Bereich von Materialvolumina, von der Ebene einer einzelnen Zelle bis hin zur Ebene eines gesamten Gehirns. Die Bedeutung dieser Techniken erstreckt sich auf die Modellierung der Reaktion des Gehirns bei Verletzungen, was für die Entwicklung schützender Strategien wichtig ist. Obwohl diese Methode Einblicke in die mechanischen Eigenschaften des Gehirns ermöglicht, kann sie auch auf andere weiche biologische Gewebe, wie Herz und Leber, angewendet werden.

Bei der mechanischen Charakterisierung weicher Gewebe ist die Herstellung eines geeigneten Kontakts zwischen der Messsonde und dem Gewebe entscheidend. Laden Sie vorsichtig eine AFM-Sonde mit einer nominalen Federkonstante von 0,03 Newton pro Meter und einer Borosilikat-Kugel mit einem Durchmesser von 20 Mikrometern in den Sondenhalter ein. Platzieren Sie eine im Petrischale montierte Gehirnschnittprobe auf einer am AFM-Stage befestigten Heizung, die zuvor auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde.

Danach etwa zwei Milliliter vorgewärmtes Medium hinzufügen. Als Nächstes vorsichtig einen Tropfen Medium auf die AFM-Sonde geben, um sie vor dem Brechen durch Oberflächenspannung zu schützen, wenn sie in das Medium um den Gehirnschnitt abgesenkt wird. Danach den AFM-Kopf wieder auf den Objekttisch setzen und langsam absenken, bis er im Medium eingetaucht ist.

Verwenden Sie das optische Mikroskop, um den Probentisch so zu bewegen, dass sich der interessierende Bereich unterhalb der kalibrierten AFM-Sonde befindet, und senken Sie anschließend die AFM-Sonde ab, bis sie Kontakt mit der Gewebeoberfläche herstellt. Um Kriechverformungsversuche durchzuführen, erstellen Sie im Funktionseditor der Software eine angelegte Kraftfunktion. Die Funktion besteht aus einer 0,1 Sekunden dauernden Rampe auf einen Sollwert von 5 Nanonewton, der 20 Sekunden lang gehalten wird, gefolgt von einer einsekündigen Rampe zurück auf null Nanonewton.

Die Software zeichnet Daten über die Eindringtiefe der AFM-Sonde in das Gewebe während der angelegten Kraftfunktion auf. Führen Sie nach Durchführung des Kriechverformungsversuchs Spannungsrelaxationsversuche durch, indem Sie im Softwareprogramm eine angelegte Eindringfunktion erstellen. Führen Sie diese Funktion aus, während die Software Daten über die Kraft erfasst, die auf die AFM-Sonde wirkt, während sie in das Gewebe eindringt.

Um die Eindruckversuche zu beginnen, bringen Sie eine kugelförmige Sonde mithilfe einer Pinzette am Pendel an. Befestigen Sie anschließend den geschmolzenen Quarz-Probenhalter auf der Platte und schrauben Sie die Platte in die Translationsstufe ein. Um dynamische Stoßversuche an hydratisiertem Hirngewebe durchführen zu können, führen Sie zunächst die Kalibrierung der Flüssigzelle durch.

Gehen Sie im Softwaremenü zur Kalibrierung, wählen Sie Flüssigzelle aus und folgen Sie den Anweisungen der Software, um Kontakt mit der Schmelzquarzprobe herzustellen. Wählen Sie anschließend „Normal“ für den Eindringertyp und verwenden Sie den voreingestellten Wert von 0,05 Millinewton für die Eindringerkraft. Klicken Sie dann auf „Weiter“, um die Kalibrierung für die normale Eindringerkonfiguration durchzuführen.

Bewegen Sie nun den Probenhalter um mindestens fünf Millimeter zurück und montieren Sie den Hebelarm. Wiederholen Sie die Kalibrierung der Flüssigzelle in der neuen Konfiguration, indem Sie Flüssigzelle als Eindringkörpertyp auswählen. Klicken Sie auf Weiter, um den Kalibrierfaktor für die Flüssigzelle zu erhalten.

Als Nächstes erhöhen Sie den Abstand zwischen den Kondensatorplatten. Die Erhöhung des Abstands zwischen den Kondensatorplatten vergrößert die maximal messbare Tiefe, was notwendig ist, wenn hochelastische Materialien getestet werden. Drehen Sie mit einem Schraubenschlüssel die drei Muttern, die den Abstand zwischen den Kondensatorplatten steuern, in kleinen Schritten im Uhrzeigersinn.

Nach jeder vollständigen Drehung im Uhrzeigersinn wählen Sie unter dem Menü „Wartung“ die Option „Brückenbox-Anpassung“ aus und führen einen geeigneten Pendeltest durch. Passen Sie die Muttern weiterhin langsam an, bis die Kalibrierung der ungefähren Tiefe einen Wert von 70.000 Nanometern pro Volt oder höher anzeigt.

Danach einen neuen Anschlag am unteren Ende des Pendels positionieren, der über eine Stromversorgung ein- und ausgeschaltet werden kann. Den ursprünglichen Anschlag hinter dem Pendel zurückfahren, um eine mögliche Behinderung der Pendelbewegung zu vermeiden und höhere Aufprallgeschwindigkeiten sowie größere Eindringtiefen in deformierbare Proben zu ermöglichen. Die Stromversorgung für das Magnetventil einschalten und auf 10 Volt einstellen.

Nun wechseln Sie zum Menü „Experiment“ und wählen Sie „Impact and Adjust Impulse Displacement“. Befolgen Sie die Softwareanweisungen, um den Schwenkweg des Pendels zu kalibrieren. Sobald die Einrichtung der Impulseindrückung vollständig abgeschlossen ist, saugen Sie das Medium ab und trocknen den Gehirnschnitt.

Verwenden Sie dann eine dünne Schicht aus Cyanoacrylat-Klebstoff, um das geschnittene Gehirn an der Aluminium-Probenhalterung zu befestigen. Schieben Sie anschließend die Flüssigzelle über den zweiten O-Ring an der Probenhalterung und füllen Sie die Flüssigzelle mit fünf Millilitern kohlendioxidunabhängigem Medium, um das Gewebe vollständig zu umgeben. Bewegen Sie das Bad in negativer X-Richtung, bis die Spitze am Hebelarm korrekt über dem Bad positioniert ist.

Bewegen Sie sich anschließend in positive Z-Richtung, bis die Spitze vollständig in das Bad eingetaucht ist und sich vor der Probe befindet. Stellen Sie mithilfe des Fensters „Sample Stage Control“ vorsichtig Kontakt her und ziehen Sie den Stößel dann um etwa 30 Mikrometer von der Probenoberfläche zurück. Wählen Sie im Menü „Experiment“ die Option „Impact“ und richten Sie ein Stoßexperiment ein.

Wählen Sie eine bestimmte Impulsbelastung, die direkt mit der sich ergebenden Aufprallgeschwindigkeit aufgrund der Schwenkweg-Kalibrierung verknüpft ist. Führen Sie dann den geplanten Versuch durch. Wenn das Pendel zurückpendelt und die Probenoberfläche weiter in die Messposition bewegt wird, schalten Sie den unteren Grenzschalter aus.

Die Verschiebung der Sonde als Funktion der Zeit wird von der Software aufgezeichnet. Befestigen Sie Schleifpapier an der Messsonde mit 25 Millimeter Durchmesser. Befestigen Sie anschließend das thermische System und montieren Sie die Sonde.

Befestigen Sie abschließend ein weiteres Stück Schleifpapier an der unteren Platte, ausgerichtet mit der oberen Platte. Kalibrieren Sie das Rheometer gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nullen Sie zunächst die Kraft auf dem Messfühler.

Zweitens stellen Sie den Kontakt zwischen der Sonde und der unteren Platte her. Dann messen Sie die Trägheit der Sonde. Schließlich führen Sie eine Motoreinstellung durch.

Senken Sie dann die Messplatte langsam ab. Wenn sich die Platte einen Millimeter über dem Gewebe befindet, senken Sie sie in 0,1-Millimeter-Schritten ab, bis die Platte vollständig mit der Oberfläche des Gewebes in Kontakt steht und die gemessene Normalkraft den gewünschten Wert erreicht hat. Geben Sie eine kleine Menge Medium an den Rändern der Probe ab, um die Hydratation während des Verfahrens aufrechtzuerhalten.

Senken Sie die Wärmehaube ab. Klicken Sie anschließend auf Datei, Neu und wählen Sie unter dem Reiter Gel die Frequenzsweep-Funktion aus. Klicken Sie dann auf die Fenstermessung eines Frequenzsweeps und doppelklicken Sie auf das Oszillationsfeld.

Geben Sie den Frequenzbereich, die Dehnung und die Anzahl der Punkte ein. Wählen Sie abschließend OK aus und klicken Sie auf Start, um den Frequenzsweep zu starten. Hier sind repräsentative Eindrückungs- und Kraft-Zeit-Antworten sowohl für Kriechverformungs- als auch für Spannungsrelaxationsversuche dargestellt.

Mithilfe dieser Daten und der Geometrie des Systems können die Kriechflugfähigkeit und die Kraftrelaxationsmodule für verschiedene Bereiche des Gehirns berechnet werden. Die Impakt-Eindringprüfung misst die mechanischen Eigenschaften des Gewebes bei hohen Raten räumlich und zeitlich konzentrierter Belastung. Die resultierenden Parameter der Impaktantwort können bei verschiedenen Impaktgeschwindigkeiten quantifiziert werden, was eine Untersuchung der geschwindigkeitsabhängigen Eigenschaften des Gewebes ermöglicht.

Die Rheologie misst die frequenzabhängigen viskoelastischen Eigenschaften von Gewebe im Makroskop in Form des Speicher- und Verlustmoduls. Der Speichermodul ist bei niedrigen Frequenzen um nahezu eine Größenordnung größer als der Verlustmodul, was darauf hinweist, dass die elastischen Eigenschaften das Verhalten des Gehirngewebes dominieren. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, das Gewebe ausreichend hydratisiert zu halten oder in einer Flüssigkeit zu lagern, die dem Gewebe hilft, seine korrekte Struktur beizubehalten.

Die Entwicklung dieser demonstrierten Techniken hat Materialforschern den Weg geebnet, synthetische Gele zu entwerfen und zu optimieren, die die mechanische Antwort des Gehirns nachahmen können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die mit dem Rasterkraftmikroskop unterstützte Eindringprüfung, die Schlag-Eindringprüfung und die Rheologie verwendet werden, um die viskoelastischen mechanischen Eigenschaften von Gewebe zu charakterisieren. Wenn Sie die gesammelten Daten interpretieren, denken Sie daran, dass die zugrunde liegende Annahme gilt, dass das verformte Volumen des Gewebes strukturell homogen und elastisch isotrop ist.

Dies gilt nicht zwangsläufig für alle biologischen Gewebe. Wenn Ihre Fragen zur Mechanik biologischer Gewebe präziser werden, können Sie ein oder mehrere dieser mechanischen Experimente auswählen, um die Frage auf der jeweils geeigneten Längen- oder Zeitskala zu beantworten.