Charakterisieren Multiskalige Mechanische Eigenschaften von Gehirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Schlag Einrückungen und Rheometrie

Das übergeordnete Ziel dieser mechanischen Charakterisierungstechniken ist es, die viskoelastischen Eigenschaften von biologischem Gewebe auf verschiedenen Längenskalen und Belastungsraten zu messen. Mit diesen Methoden lassen sich zentrale Fragen der Biotechnik beantworten. Zum Beispiel, wie sich das Gehirn bei sehr hohen Belastungen verformt oder wie Krankheiten wie Multiple Sklerose oder Autismus die mechanischen Eigenschaften des Hirngewebes beeinflussen.

Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass Sie bei Materialien mit sehr geringer Steifigkeit und sehr hoher Hydratation, wie z. B. biologischem Gewebe, über einen weiten Bereich von Belastungsbedingungen testen können, und Sie können auch über einen weiten Bereich von Materialvolumina testen, bis hinunter zur Ebene einer einzelnen Zelle und bis zur Ebene eines gesamten Gehirns. Die Implikationen dieser Techniken erstrecken sich auf die Modellierung der Reaktion des Gehirns während einer Verletzung, was für die Entwicklung von Schutzstrategien wichtig ist. Obwohl diese Methode Einblicke in die mechanischen Eigenschaften des Gehirns geben kann, kann sie auch auf andere nachgiebige biologische Gewebe wie Herz und Leber angewendet werden.

Bei der mechanischen Charakterisierung von nachgiebigen Geweben ist die Herstellung eines geeigneten Kontakts zwischen der Messsonde und dem Gewebe von entscheidender Bedeutung. Laden Sie vorsichtig eine AFM-Sonde mit einer nominalen Federkonstante von 0,03 Newton pro Meter und einer Borosilikatkugel mit einem Durchmesser von 20 Mikrometern in den Sondenhalter. Legen Sie eine in einer Petrischale montierte Gehirnscheibe auf eine auf 37 Grad Celsius vorgewärmte AFM-Bühne.

Füge dann etwa zwei Milliliter vorgewärmtes Medium hinzu. Geben Sie anschließend vorsichtig einen Tropfen Medium auf die AFM-Sonde, um sie vor Bruch durch Oberflächenspannung zu schützen, wenn sie in das Medium abgesenkt wird, das die Gehirnscheibe umgibt. Positionieren Sie dann den AFM-Kopf wieder auf dem Tisch und beginnen Sie, den Kopf abzusenken, bis er in das Medium eingetaucht ist.

Bewegen Sie den Tisch mit dem optischen Mikroskop so, dass sich der interessierende Bereich unter der kalibrierten AFM-Sonde befindet, und senken Sie dann die AFM-Sonde ab, um Kontakt mit der Oberfläche des Gewebes aufzunehmen. Um die Experimente zur Kriechnachgiebigkeit durchzuführen, konstruieren Sie eine Funktion der aufgebrachten Kraft im Funktionseditor der Software. Die Funktion besteht aus einer 0,1-Sekunden-Rampe auf einen Sollwert von 5 Nanonewton, die 20 Sekunden lang gehalten wird, gefolgt von einer Rampe von einer Sekunde auf null Nanonewton.

Die Software zeichnet Daten über den Einzug der AFM-Sonde in das Gewebe während der aufgewendeten Kraftfunktion auf. Führen Sie nach dem Ausführen des Kriechnachgiebigkeitsexperiments Kraftrelaxationsexperimente durch, indem Sie eine angewendete Eindringfunktion in der Software erstellen. Führen Sie diese Funktion aus, während die Software Daten über die Kraft sammelt, die die AFM-Sonde erfährt, wenn sie in das Gewebe eindringt.

Um mit Schlageindringversuchen zu beginnen, passen Sie eine kugelförmige Sonde an, indem Sie sie mit einer Pinzette auf das Pendel schieben. Befestigen Sie dann den Quarzglas-Probenpfosten auf der Platte und schrauben Sie die Platte in den Translationstisch. Um dynamische Aufprallexperimente an hydratisiertem Hirngewebe zu ermöglichen, führen Sie zunächst die Kalibrierung der Flüssigzellen durch.

Gehen Sie in der Software zum Menü Kalibrierung, wählen Sie Flüssigzelle und folgen Sie den Anweisungen der Software, um Kontakt mit der Quarzglasprobe aufzunehmen. Wählen Sie als Nächstes Normal für den Eindringkörpertyp aus, und verwenden Sie den Standardwert von 0,05 Millinewton für die Eindringkörperlast. Klicken Sie dann auf Weiter, um die Kalibrierung für die normale Eindringkörperkonfiguration durchzuführen.

Schieben Sie nun den Probentisch mindestens fünf Millimeter zurück und montieren Sie den Hebelarm. Wiederholen Sie die Kalibrierung der Flüssigkeitszelle in der neuen Konfiguration, indem Sie Flüssigzelle als Eindringkörpertyp auswählen. Klicken Sie auf Weiter, um den Kalibrierfaktor für die Flüssigkeitszelle zu erhalten.

Vergrößern Sie als Nächstes den Abstand der Kondensatorplatte. Durch die Vergrößerung des Kondensatorplattenabstands wird die maximal messbare Tiefe erhöht, die bei der Prüfung hochnachgiebiger Materialien erforderlich ist. Drehen Sie mit einem Schraubenschlüssel die drei Muttern, die den Abstand der Kondensatorplatte steuern, in kleinen Schritten im Uhrzeigersinn

Wählen Sie nach jeder vollständigen Umdrehung im Uhrzeigersinn im Wartungsmenü die Option Brückenkasteneinstellung und erhalten Sie einen guten Pendeltest. Stellen Sie die Muttern langsam weiter ein, bis die Kalibrierung für die ungefähre Tiefe einen Wert von 70.000 Nanometern pro Volt oder höher anzeigt.

Positionieren Sie dann einen neuen Endanschlag an der Unterseite des Pendels, der über ein Netzteil ein- und ausgeschaltet werden kann. Ziehen Sie den ursprünglichen Endanschlag hinter dem Pendel zurück, um ein potenzielles Hindernis für die Pendelbewegung zu beseitigen und höhere Aufprallgeschwindigkeiten sowie höhere Eindringtiefen in nachgiebige Proben zu ermöglichen. Schalten Sie die Stromversorgung für den Magneten ein und stellen Sie sie auf 10 Volt ein.

Gehen Sie als Nächstes zum Menü "Experiment" und wählen Sie "Schlag" und "Impulsverschiebung anpassen". Befolgen Sie die Anweisungen der Software, um den Schwenkabstand des Pendels zu kalibrieren. Wenn die Aufpralleindringung vollständig eingerichtet ist, aspirieren Sie das Medium und trocknen Sie die Gehirnscheibe.

Verwenden Sie dann eine dünne Schicht Cyanacrylat-Kleber, um das geschnittene Gehirn an dem Aluminium-Probenpfosten zu befestigen. Schieben Sie dann die Flüssigzelle über den zweiten O-Ring am Probenpfosten und füllen Sie die Flüssigzelle mit fünf Millilitern kohlendioxidunabhängigem Medium, um das Gewebe vollständig einzutauchen. Bewegen Sie das Bad in negativer X-Richtung, bis sich die Spitze des Hebelarms richtig über dem Bad befindet.

Bewegen Sie sich dann in positiver Z-Richtung, bis die Spitze vollständig in das Bad eingetaucht ist und sich vor der Probe befindet. Nehmen Sie mit dem Fenster "Probentischsteuerung" vorsichtig Kontakt auf und ziehen Sie den Tisch dann etwa 30 Mikrometer von der Probenoberfläche weg. Klicken Sie im Menü Experiment auf Auswirkung, und richten Sie ein Auswirkungsexperiment ein.

Wählen Sie eine bestimmte Impulslast, die sich direkt auf die resultierende Aufprallgeschwindigkeit bezieht, basierend auf der Kalibrierung des Schwenkabstands. Führen Sie dann das geplante Experiment aus. Wenn das Pendel zurückschwingt und sich die Probenoberfläche weiter in die Messebene bewegt, schalten Sie den unteren Endschalter aus.

Die Verschiebung der Sonde in Abhängigkeit von der Zeit wird von der Software aufgezeichnet. Befestigen Sie Schleifpapier an der Messsonde mit einem Durchmesser von 25 Millimetern. Befestigen Sie als Nächstes das thermische System und montieren Sie die Sonde.

Befestigen Sie zum Schluss ein weiteres Stück Schleifpapier an der unteren Platte, die mit der oberen Platte ausgerichtet ist. Kalibrieren Sie das Rheometer gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nullen Sie zunächst die Kraft auf die Sonde.

Stellen Sie zweitens den Kontakt zwischen der Sonde und der Bodenplatte her. Messen Sie dann die Trägheit der Sonde. Führen Sie abschließend eine Motoreinstellung durch.

Senken Sie dann die Messplatte langsam ab. Wenn sich die Platte innerhalb eines Millimeters vom Gewebe befindet, senken Sie sie in Schritten von 0,1 Millimetern ab, bis die Platte vollständig mit der Oberseite des Gewebes in Kontakt kommt und die gemessene Normalkraft dem gewünschten Wert entspricht. Spritzen Sie eine kleine Menge Medium an den Rändern der Probe aus, um die Hydratation während des Eingriffs aufrechtzuerhalten.

Senken Sie die Thermohaube ab. Klicken Sie anschließend auf Datei, Neu und wählen Sie auf der Registerkarte Gel die Option Frequenz-Sweep aus. Klicken Sie dann auf Fenstermessung, einen Frequenz-Sweep und doppelklicken Sie auf das Schwingungsfeld.

Geben Sie den Frequenzbereich, die Dehnung und die Anzahl der Punkte ein. Wählen Sie abschließend OK und klicken Sie auf Start, um den Frequenzdurchlauf zu starten. Hier sind repräsentative Eindring- und Kraft-Zeit-Reaktionen sowohl für Kriechnachgiebigkeits- als auch für Kraftrelaxationsexperimente.

Anhand dieser Daten und der Geometrie des Systems können die Kriechnachgiebigkeit und die Kraftrelaxationsmodule für verschiedene Regionen des Gehirns berechnet werden. Die Impakteinkerbung misst die mechanischen Eigenschaften des Gewebes bei hohen Raten räumlich und zeitlich konzentrierter Belastung. Die resultierenden Stoßreaktionsparameter können bei verschiedenen Aufprallgeschwindigkeiten quantifiziert werden, was eine Möglichkeit bietet, die geschwindigkeitsabhängigen Eigenschaften des Gewebes zu untersuchen.

Die Rheologie misst die frequenzabhängigen viskoelastischen Eigenschaften von Schüttgut in Bezug auf die Speicher- und Verlustmodule. Der Speichermodul ist fast eine Größenordnung größer als der Verlustmodul bei niedrigen Frequenzen, was darauf hindeutet, dass elastische Eigenschaften das Verhalten des Hirngewebes dominieren. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, das Gewebe ausreichend mit Feuchtigkeit zu versorgen oder in eine Flüssigkeit einzutauchen, die dem Gewebe hilft, seine richtige Struktur zu erhalten.

Die Entwicklung dieser demonstrierten Techniken hat den Weg für Materialforscher geebnet, synthetische Gele zu entwerfen und zu optimieren, die die mechanische Reaktion des Gehirns nachahmen können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Rasterkraftmikroskop-gestützte Indentation, Schlagindentation und Rheologie verwendet werden, um die viskoelastischen mechanischen Eigenschaften von Gewebe zu charakterisieren. Denken Sie bei der Interpretation der gesammelten Daten an die zugrundeliegende Annahme, dass das deformierte Volumen des Gewebes strukturell homogen und elastisch isotrop ist.

Dies gilt nicht unbedingt für alle biologischen Gewebe. Wenn Ihre Fragen zur Mechanik biologischer Gewebe besser definiert werden, können Sie eines oder mehrere dieser mechanischen Experimente auswählen, um die Frage auf der entsprechenden Längenskala oder Zeitskala von Interesse zu beantworten.