La mise en œuvre d'un système anti-Stokes cohérente Raman Scattering (CARS) sur un Ti: saphir et microscope à balayage laser OPO Based Laser Standard

L’objectif global de cette procédure est de mettre en œuvre une technique de microscopie complémentaire appelée CARS, qui permet une imagerie sans marquage, chimiquement sélective, du mode de vie sur un microscope à balayage laser multiphoton standard basé sur un laser titane-saphir femtoseconde et un oscillateur de paramètres optiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie ou des neurosciences, telles que la compréhension des maladies liées aux lipides, des mécanismes de pénétration cutanée ou des troubles cutanés. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à mettre en œuvre sur une microscopie à balayage laser standard basée sur les lasers Ti :Sapphire et OPA.

Hassan Boukhaddaoui, associé de recherche et responsable de la plateforme d’imagerie du laboratoire, et Vasyl Mytskaniuk feront la démonstration de la procédure. Allumez les lasers titane-saphir et OPO comme présenté dans le protocole de texte. Allumez l’ordinateur du microscope.

Allumez les commutateurs des composants du microscope. Démarrez le logiciel en double-cliquant sur l’icône sur le bureau et configurez-le selon le protocole texte. Ensuite, placez un miroir dichroïque avec une longueur d’onde de coupure à 760 nanomètres dans le curseur du port latéral.

Localisez-le dans l’espace infini au-dessus de l’embout nasal de l’objectif. Placez le filtre passe-bande étroite et le cube réflecteur devant PMT1 pour enregistrer uniquement le signal CARS à 670 nanomètres afin de reproduire les résultats présentés. Ensuite, placez des filtres à bande étroite spécifiques devant PMT3 pour l’observation de la myéline en fluorescence, et devant PMT4 pour l’observation SHG.

Dans le logiciel, réglez le signal sur le détecteur à l’aide d’un filtre passe-bande ad hoc. Ouvrez l’outil Trajectoire de la lumière dans le menu du gestionnaire de configuration de l’onglet Acquisition, puis activez le PMT souhaité et sélectionnez une couleur pour le canal. Par exemple, utilisez du vert pour les voitures et du magenta pour SHG.

Les deux faisceaux qui proviennent du même laser saphir titane ne sont pas synchronisés lorsqu’ils atteignent le microscope car le faisceau OPO est retardé lorsqu’il est généré. Suivez cette procédure pour les resynchroniser en ajustant la longueur de l’un des pads de faisceau laser en incorporant une ligne à retard. L’utilisation d’une photodiode rapide et d’un oscilloscope rapide est requise.

Tout d’abord, à l’aide de câbles BNC, connectez le canal d’entrée CH1 de l’oscilloscope à la sortie de sortie laser BNC électrique. Ensuite, connectez le canal d’entrée CH2 à la photodiode. Ensuite, choisissez le canal CH1 comme déclencheur en appuyant sur le menu de déclenchement, puis sur la source du bouton du menu principal, puis sur le bouton du menu latéral qui correspond au canal sélectionné comme CH1.

Positionnez et fixez maintenant à l’aide de poteaux de montage optiques la photodiode dans le plan focal d’un objectif de microscope à air 10x. Dans l’outil Canaux, définissez la longueur d’onde du laser titane-saphir à 830 nanomètres à faible puissance, ce qui correspond à moins de 1 % de la puissance totale. Dans l’outil Mode d’acquisition, réduisez la zone de balayage à un point afin d’éclairer la photodiode avec le faisceau le plus petit.

Activez ensuite le balayage laser en cliquant sur le bouton continu. Appuyez sur Autoset sur l’oscilloscope et déplacez manuellement la photodiode pour obtenir un train d’impulsions sur l’écran de l’oscilloscope. Appuyez sur le bouton marche/arrêt pour figer l’affichage.

Ensuite, désactivez le balayage laser titane-saphir. Dans le logiciel, cliquez sur l’outil Canaux, désélectionnez le laser de 830 nanomètres et réglez le signal OPO sur 1107 nanomètres et faible puissance. Allumez ensuite le balayage laser PO, enregistrez les trains d’impulsions du laser OPO sur l’oscilloscope et désactivez le balayage laser PO.

Maintenant, comparez le décalage temporel entre les signaux titane-saphir et APO. Calculez la longueur de la ligne à retard, qui servira à positionner les miroirs. Avant de continuer, mettez des lunettes de sécurité et retirez tous les bracelets en chaîne ou les montres des poignets.

Maintenant, ouvrez la ligne laser titane-saphir où la ligne à retard sera mise en œuvre en retirant les tubes de protection. Sélectionnez ensuite une longueur d’onde dans le domaine visible afin de pouvoir observer facilement le faisceau laser, par exemple 700 nanomètres à faible puissance, et activez le balayage laser. Insérez maintenant deux diaphragmes à iris dans la ligne laser ouverte à l’aide des poteaux de montage optiques.

Positionnez un iris à la sortie de la ligne à retard et placez l’autre iris à l’entrée du périscope. Ensuite, diminuez l’ouverture du diaphragme de l’iris et ajustez les positions du diaphragme pour qu’elles s’adaptent à la trajectoire du faisceau laser, puis fixez-les sur la table optique. Enfin, ajustez la position verticale d’un troisième diaphragme à iris mobile.

Les diaphragmes de taille serviront de contrôle pour la procédure de réalignement afin de vérifier la position du faisceau laser tout en positionnant successivement les quatre miroirs de la ligne à retard. Maintenant, placez le miroir M1 sur une monture de miroir cinématique compacte à l’entrée de la ligne à retard, et ajustez sa position et son orientation pour maintenir la hauteur du faisceau à l’aide du diaphragme à iris mobile. Placez ensuite les miroirs M2 et M3 à 90 degrés sur la platine de translation en fonction de la longueur de la ligne à retard calculée et ajustez leur orientation à l’aide du diaphragme à iris mobile.

Placez M4 à la sortie de la ligne à retard juste avant l’iris et ajustez soigneusement sa position et son angle pour s’adapter à la trajectoire du faisceau laser à travers les deux diaphragmes fixes de l’iris. Positionnez maintenant la carte de visualisation laser à la sortie de l’objectif du microscope et vérifiez le profil du faisceau laser. Si nécessaire, ajustez légèrement l’orientation de M4 pour observer un disque brillant uniforme.

Enfin, repositionnez la photodiode rapide sous le faisceau laser dans le plan de mise au point de l’échantillon. Observez ensuite le décalage temporel entre le faisceau laser titane-saphir et le faisceau OPO sur l’oscilloscope. Si nécessaire, modifiez la longueur de la ligne à retard en déplaçant l’ensemble de l’étage de traduction pour synchroniser les impulsions.

Le chevauchement spatial des deux faisceaux nécessaires à un signal CARS est obtenu en visualisant des billes de polystyrène fluorescent fixées sur une lame de microscope. Concentrez-vous sur les perles à l’aide d’un objectif d’eau 20x. Maintenant, dans l’outil Canaux de l’onglet acquisition, ajoutez la piste un ou utilisez la piste existante.

Sélectionnez la longueur d’onde à 830 nanomètres et la faible puissance pour le faisceau laser titane-saphir. Basculez la couleur sur le vert dans la zone Track One de la fenêtre Canaux et dans la zone PMT3 ou PMT4 de la fenêtre du chemin de lumière. Ensuite, ajoutez la deuxième piste pour le faisceau laser OPO et réglez la longueur d’onde à 1107 nanomètres et à faible puissance.

Basculez la couleur sur rouge dans la zone de la piste deux de la fenêtre Canaux et dans la zone PMT3 ou PMT4 de la fenêtre du trajet de lumière. Maintenant, sélectionnez la zone de balayage maximale et ajustez le gain des deux pistes à 600. Ensuite, appliquez séquentiellement le balayage des deux faisceaux sur l’échantillon en cliquant sur continu.

Observez l’image dans la zone de l’écran dans la vue 2D. Augmentez la puissance des deux lasers. Si nécessaire, déplacez légèrement le moteur de mise au point pour trouver le plan de mise au point des billes.

Enfin, ajustez le recadrage et zoomez sur une seule perle ou sur un groupe de perles adjacentes. Ensuite, utilisez le contrôleur de périscope pour superposer les faisceaux dans le plan XY. Dans le logiciel, ouvrez l’onglet Gérer.

Cliquez sur les options du système et affichez la fenêtre de l’outil du périscope motorisé. De plus amples détails sont discutés dans le protocole de texte. Après avoir superposé les images des deux faisceaux laser, la synchronisation est réalisée.

Pour obtenir le réglage temporel précis pour activer CARS, préparez une lame de verre avec une gouttelette d’huile d’olive et un lamelle. Ensuite, à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau 20x, concentrez-vous sur le bord de la lamelle. Maintenant, sur la première voie, réglez la longueur d’onde à 830 nanomètres pour le faisceau laser titane-saphir et à 1107 nanomètres pour l’OPO.

Basculez les deux lasers dans la première piste pour obtenir un balayage simultané. Commencez avec les deux lasers à faible puissance. Ensuite, dans la fenêtre du chemin de lumière, décochez PMT4 et sélectionnez PMT1.

Choisissez ensuite la zone de balayage maximale et activez les balayages laser en cliquant sur le bouton continu. Réglez le gain à 600 et, si nécessaire, augmentez la puissance des deux lasers. Ensuite, ajustez l’intensité de l’affichage dans le bloc de contrôle de l’option d’affichage de l’affichage.

Ensuite, déplacez lentement l’étage de translation de la ligne à retard jusqu’à ce que le signal soit considérablement amélioré. Ensuite, diminuez la puissance des deux lasers. Maintenant, vérifiez si le signal est un signal CARS en éteignant alternativement l’un des deux lasers.

Si l’intensité du signal s’affaiblit ou disparaît, un signal CARS a été obtenu. Étant donné que le système final est dédié aux non-physiciens, entourez le chemin lumineux de la ligne à retard d’un boîtier d’enceinte et de tubes pour éviter l’accès direct à un faisceau laser nocif, non visible et de haute puissance de crête. Cependant, donnez accès au bouton de l’étape de translation.

Un colorant rouge fluro-myéline, qui a une sélectivité pour la myéline, a été utilisé pour observer la gaine de myéline. L’éclairage simultané à 830 et à 1095 nanomètres fournit un signal CARS. Les cercles correspondent à la gaine de myéline qui entoure les axones dans une coupe transversale.

La même structure se retrouve en chevauchant les images CARS et de fluorescence. Le niveau de détail des CARS et de l’étiquetage fluorescent est très similaire. Potentiellement éviter la nécessité d’utiliser des colorants.

Le système peut également générer simultanément un deuxième signal harmonique à partir des fibres de collagène au service externe des nerfs sciatiques. Un détecteur différent est utilisé pour enregistrer un signal à 550 nanomètres, car un filtre passe-bande étroite à 670 nanomètres est utilisé pour l’enregistrement du signal CARS. Les fibres sont illustrées par une fausse couleur magenta.

Le signal CARS à lui seul montre clairement les gaines de myéline. En visualisant simultanément les deux signaux, les gaines de myéline en vert sont observées entourées de fibres de collagène en magenta. Un signal CARS nécessite moins d’énergie que les signaux SHG ou THG.

signaux CARS ont été obtenus avec quatre milliwatts à 830 nanomètres et 13 milliwatts à 1095 nanomètres, tandis que 50 milliwatts à 1095 nanomètres étaient nécessaires pour obtenir un signal SHG. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de modifier étape par étape l’un des trajets du faisceau laser pour synchroniser temporellement les deux faisceaux laser. La mise en œuvre de la ligne à retard peut être réalisée en quelques semaines par des biologistes ayant une formation de base en optique expérimentale ou en collaboration avec des physiciens.

N’oubliez pas que travailler avec des faisceaux laser invisibles de haute puissance peut être extrêmement dangereux. Et des précautions, comme le port de lunettes lors de l’exécution de la procédure et l’enceinte finale de la trajectoire du faisceau laser, doivent être prises.