In vivo Imagerie de tissus biologiques avec fluorescence combinée à deux photons et microscopie à diffusion Raman stimulée

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des biomolécules en fonction de leur vibration intrinsèque de liaisons chimiques spécifiques. Dans ce protocole, la configuration instrumentale d’un SRS intégré et d’un microscope à fluorescence à deux photons est décrite pour visualiser les structures cellulaires dans la moelle épinière de souris vivantes.

L’imagerie in vivo de tissus biologiques avec une résolution subcellulaire et une spécificité chimique est un outil puissant pour comprendre les processus dynamiques impliqués dans le métabolisme cellulaire, la réponse immunitaire et le remodelage des tissus. Avec la fluorescence combinée à deux photons et la microscopie à diffusion Raman stimulée, les informations biochimiques et biophysiques critiques des tissus biologiques peuvent être acquises à partir de multiples perspectives avec une résolution subcellulaire. Plus précisément, cette microscopie bimodale peut être utilisée pour imager la dynamique cellulaire et les interactions dans la moelle épinière de la souris afin d’étudier la progression des maladies neurodégénératives et des lésions de la moelle épinière.

Pour commencer, allumez le laser saphir de titane en passant de la position de veille à la position allumée et attendez 30 minutes que le laser se réchauffe. Allumez ensuite l’OPO en cliquant sur le bouton de démarrage du panneau de commande OPO et attendez 20 minutes que le laser se réchauffe. Une fois le laser picoseconde réchauffé, vérifiez la profondeur de modulation du faisceau stokes en abaissant la puissance du faisceau Stokes à environ 20 milliwatts, en ouvrant l’obturateur laser du faisceau Stokes et en plaçant un photodétecteur haute vitesse à la sortie OPO pour détecter le faisceau.

Ensuite, connectez le port de sortie du photodétecteur au port d’entrée d’un oscilloscope à l’aide d’un câble coaxial avec un connecteur BNC pour surveiller l’impulsion laser. Ouvrez ensuite la fenêtre de commande EOM dans le logiciel de contrôle OPO et ajustez la puissance et la phase EOM en fonction du diagramme d’intensité d’impulsion indiqué sur l’oscilloscope pour obtenir une profondeur de modulation maximale à 20 mégahertz. Dans le logiciel de contrôle OPO, ouvrez l’obturateur laser de la pompe tout en arrêtant la sortie Stokes.

Ensuite, cliquez sur la boîte de signal définie pour définir la longueur d’onde du faisceau de la pompe à 796 nanomètres, puis cliquez sur la boîte d’alimentation OPO définie et entrez 20 pour régler sa puissance au minimum pour l’alignement optique. Ensuite, placez la plaque d’alignement P1 derrière le séparateur de faisceau polarisant à environ 10 centimètres et placez la plaque P2 derrière P1 à environ 30 centimètres sur le chemin optique. Après avoir ouvert l’obturateur du microscope pour le faisceau laser picoseconde, ajustez le miroir M1 pour localiser le centre du faisceau laser picoseconde au trou traversant de P1. Utilisez une lunette infrarouge pour observer la position du point de faisceau à P1 lors du réglage du miroir M1. De même, ajustez le miroir M2 pour localiser le centre du faisceau laser picoseconde au trou traversant de P2. Utilisez la lunette infrarouge pour observer la position du point de faisceau à P2 lors du réglage du miroir M2. Après avoir réglé les miroirs jusqu’à ce que le centre du faisceau picoseconde se situe au trou traversant des deux plaques d’alignement, fermez l’obturateur du faisceau picoseconde dans le logiciel de contrôle du microscope.

Ensuite, ouvrez l’obturateur du microscope pour le faisceau laser femtoseconde. Ajustez le miroir M3 pour localiser le centre du point de faisceau laser femtoseconde au trou traversant de P1, puis ajustez le miroir M4 pour localiser le centre du point de faisceau laser femtoseconde au trou traversant de P2. Après avoir ajusté les miroirs jusqu’à ce que le centre du faisceau laser femtoseconde se trouve aux trous traversants des deux plaques d’alignement, fermez l’obturateur du microscope pour le faisceau femtoseconde. Ensuite, placez une caméra à la position de l’objectif pour visualiser l’emplacement des deux points de faisceau et marquer la position du faisceau de la pompe sur l’écran de la caméra comme référence.

Placez ensuite une plaque d’alignement P0 avant l’objectif L3 et ajustez le miroir optique à l’aide d’une touche hexagonale afin que le centre du faisceau Stokes passe le trou traversant de la plaque d’alignement au port de sortie laser. Utilisez la lunette infrarouge pour confirmer la position du point de faisceau à P0 pendant le réglage. Ensuite, retirez la plaque d’alignement P0 et utilisez la touche hexadécimale pour régler le miroir optique deux afin que le centre du faisceau Stokes coïncide avec la marque de référence du faisceau de pompe sur la caméra.

Continuez à régler les miroirs jusqu’à ce que le faisceau Stokes chevauche strictement le faisceau de la pompe à la fois sur les plans P0 et caméra. Ouvrez le logiciel de contrôle de l’amplificateur de verrouillage et réglez la longueur d’onde du laser de la pompe à 796 nanomètres et la puissance de la pompe et du faisceau de Stokes à 50 et 70 milliwatts correspondant respectivement à 15 et 25 milliwatts sur l’échantillon. Ensuite, utilisez de l’huile d’olive pour l’optimisation de la phase de l’amplificateur de verrouillage.

L’huile d’olive est scellée dans une lame avec du papier de soie attaché au fond pour améliorer la diffusion du signal ou la détection EPI-SRS. Placez l’échantillon d’huile d’olive sur la scène et ajustez la mise au point de l’objectif 25X sur l’échantillon. À l’aide du logiciel de contrôle du microscope, définissez les paramètres d’imagerie mentionnés dans le manuscrit textuel.

Ensuite, à l’aide du logiciel de contrôle de l’amplificateur de verrouillage, réglez la valeur de la constante de temps sur 10 microsecondes. Ensuite, scannez le faisceau laser sur l’échantillon, en réglant la phase avec une taille de pas de 22,5 degrés jusqu’à ce que l’intensité du signal SRS atteigne le maximum. Scannez ensuite l’échantillon avec l’obturateur laser fermé, en réglant la valeur de décalage avec une taille de pas d’un millivolt jusqu’à ce que le signal SRS moyen soit proche de zéro.

Ensuite, ouvrez la boîte de dialogue du gestionnaire de retard dans le logiciel de contrôle OPO et scannez l’huile d’olive, en réglant l’étape de retard jusqu’à ce que le signal SRS de l’huile d’olive atteigne son maximum. Arrêtez ensuite l’analyse et cliquez sur le bouton Ajouter des données dans la boîte de dialogue du gestionnaire de retard pour enregistrer les données de retard actuelles. Après avoir acquis de la même manière des données de retard à différents décalages Raman en imageant divers échantillons chimiques, sélectionnez l’ajustement des données dans l’ordre cinq dans la boîte de dialogue du gestionnaire de retard pour adapter les points de données actuels à la fonction polynomique du cinquième ordre.

Appliquez ensuite les données ajustées en cliquant sur le bouton Utiliser comme personnalisé et en cochant la case. L’étage de retard est automatiquement ajusté à différentes longueurs d’onde en fonction de la courbe de retard ajustée. Pour l’imagerie in vivo, fixez la souris au stade de stabilisation avec sa moelle épinière exposée et immergée dans une solution saline.

Montez maintenant l’étage de stabilisation sur un étage à cinq axes sous le microscope TPEF-SRS. Ensuite, fixez la tête de la souris avec deux barres de tête et abaissez la plaque de maintien pour offrir suffisamment d’espace pour le mouvement de la poitrine pendant la respiration, atténuant ainsi les artefacts de mouvement. Ensuite, ajustez l’étage de translation Z pour régler la mise au point jusqu’à ce que l’image Brightfield de la vascularisation de la moelle épinière puisse être observée sous un objectif 10X.

Localisez la veine dorsale de la moelle épinière au centre du champ de vision en réglant l’étape translationnelle à deux axes de l’étape à cinq axes. Ensuite, réglez les angles de roulis et de tangage de l’étage à cinq axes pour ajuster la surface dorsale de la moelle épinière perpendiculairement à l’axe de l’objectif en fonction de l’image Brightfield. Remplacez ensuite le 10X par un objectif d’immersion dans l’eau 25X pour l’imagerie TPEF-SRS.

Pour l’imagerie SRS, sélectionnez le séparateur de faisceau polarisant au-dessus de l’objectif en appuyant sur le bouton de commutation connecté à la nageoire motorisée. Pour l’imagerie TPEF, sélectionnez le miroir dichroïque D2 au-dessus de l’objectif en appuyant sur le bouton de commutation connecté à la nageoire motorisée. Enfin, définissez les paramètres d’imagerie comme décrit dans le manuscrit textuel et commencez à numériser l’échantillon.

L’imagerie bimodale in vivo des axones YFP et des gaines de myéline peu marqués dans la moelle épinière de la souris a révélé que les axones sont étroitement enveloppés par une épaisse couche de gaines de myéline. Comme on peut le voir sur l’image de la moelle épinière TPEF-SRS, les nœuds de Ranvier ont un diamètre axonal diminué et l’axilemme est directement exposé à la matrice extracellulaire. Combinée à de nouvelles sondes pour la fluorescence et l’imagerie SRS à fluorescence excitée à deux photons, la microscopie SRS peut réaliser simultanément l’imagerie structurelle et fonctionnelle de diverses biomolécules, facilitant ainsi notre compréhension des processus biologiques complexes.