Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, zwei verschiedene Methoden der humanen Monozytenisolierung für die dendritische Zellgenerierung in vitro zu vergleichen und die CT11c, CT14-Zelloberflächenexpression der resultierenden Monozyten-abgeleiteten Populationen durch bildgebende Durchflusszytometrie zu charakterisieren. Diese Monozyten-Isolierungsprotokolle können zur Entwicklung zuverlässiger Methoden für die Aufreinigung menschlicher dendritischer Zellen für Forschung und klinische Anwendungen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Protokolle besteht darin, dass sie die Isolierung menschlicher Monozyten und ihre Differenzierung in lebensfähige und funktionsfähige Monozytenzellen erleichtern.

Darüber hinaus ist dies die erste Studie, die die spezifische Population von dendritischen Zellen aus Monozyten mittels Einzelzell-Bildgebungs-Durchflusszytometrie charakterisiert. Diese Methode kann auch als Alternative für die Isolierung anderer seltener Zellen mit einer ausreichenden Ausbeute für nachgelagerte Forschungsanwendungen eingesetzt werden. Die visuelle Demonstration dieser Methoden ist von entscheidender Bedeutung, da es eine Herausforderung sein kann, die Blutproben ohne die entsprechende Anleitung und Erfahrung sicher zu handhaben.

Beginnen Sie damit, die Blutprobe mit PBS in einem T75-Kolben auf ein Eins-zu-Eins-Verhältnis zu verdünnen. Geben Sie dann 15 Milliliter Dichtegradientenlösung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und schichten Sie vorsichtig 25 bis 30 Milliliter des verdünnten Blutes über den Gradienten. Um eine korrekte Trennung der mononukleären Zellen des peripheren Blutes zu erreichen, wird das Blut schnell, aber vorsichtig und ohne Vermischung der Schichten auf die Dichtegradientenlösung geladen.

Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation, gefolgt von der Übertragung der Grenzschicht der weißen Blutkörperchen in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS und suspendieren Sie das endgültige Pellet 15 Minuten lang bei 4 Grad Celsius in 10 Millilitern Ammoniumchlorid-Kalium-Lysingpuffer. Waschen Sie dann die Zellen noch zwei weitere Male in PBS.

Um Monozyten nach der Adhärenzmethode zu isolieren, kultivieren Sie fünfmal 10 bis zu den sieben Zellen des resultierenden PBMC-Pellets pro 10 Milliliter des vollständigen Mediums in einem neuen T75-Kolben für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator. Entsorgen Sie am Ende der Inkubation die nicht adhärenten Schwimmzellen und waschen Sie die adhärenten Zellen vorsichtig zweimal mit PBS. Füttern Sie dann die adhärenten Zellen mit vollständigem Zellkulturmedium, das mit humanem GMCSF und IL4 ergänzt ist, und stellen Sie die Kultur für fünf bis sieben Tage in den Inkubator zurück.

Um die Monozyten durch magnetische Trennung zu isolieren, übertragen Sie nach dem Sammeln des PBMC durch Dichtegradiententrennung die weiße Blutkörperchenschicht in ein Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen und resuspendieren Sie die Zellen in PBS in einer Konzentration von fünfmal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter. Als nächstes fügen Sie den Zellen 50 Mikroliter eines humanen Monozytenanreicherungscocktails pro Milliliter hinzu und inkubieren die Zellen mit dem Cocktail bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Fügen Sie dann 50 Mikroliter magnetische Partikel pro Milliliter Zellen mit sorgfältigem Mischen hinzu und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 4 Grad Celsius.

Am Ende der zweiten Inkubation fügen Sie den Zellen PBS hinzu, um das Gesamtvolumen auf zwei Komma fünf Milliliter zu erhöhen, und mischen Sie durch zwei- bis dreimaliges Pipettieren. Legen Sie dann das Styroporrohr bei Raumtemperatur in eine geeignete magnetische Vorrichtung. Nach zweieinhalb Minuten, während sich das Röhrchen noch im Magneten befindet, wird die gereinigte Monozytenfraktion in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.

Kultivieren Sie dann die gereinigten Monozyten und das vollständige Zellkulturmedium, ergänzt mit GMCSF und IL4 für fünf bis sieben Tage, wie gerade gezeigt. Nach sieben Tagen der Differenzierung geben Sie eins mal 10 an die sechs Zellaliquats der von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen in die entsprechende Anzahl von Ein-Komma-Fünf-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie jeder Probe 50 Mikroliter hitzeinaktiviertes humanes Serum hinzu, um jeden unspezifischen Befund zu blockieren. Nach 10 Minuten zentrifugieren Sie die Zellen und suspendieren Sie die Pellets 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt in den entsprechenden fluoreszenzkonjugierten Primärantikörpern.

Waschen Sie dann die Zellen zweimal in einem Milliliter PBS und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern PBS pro einmal zehn zu den sechs Zellen. Geben Sie kurz vor der Analyse einen Mikroliter DAPI in jedes Röhrchen. Lesen Sie dann die Proben auf einem Einzelzell-Imaging-Durchflusszytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers ab.

Im Durchschnitt machen Monozyten, die durch die Adhärenzmethode isoliert wurden, etwa sechs Komma zwei Prozent der gesamten Population von peripheren Blutmonozytenzellen (PBMC) aus, während die durch magnetische Trennung isolierten Monozyten bis zu 25 Prozent der gesamten PBMC ausmachen. Monozyten, die mit beiden Methoden isoliert werden, sind gleichermaßen lebensfähig. MDDCs, die von Monozyten differenziert wurden, die mit beiden Methoden gereinigt wurden, wurden zunächst auf der Grundlage von DAPI-negativen oder lebensfähigen Zellen aus insgesamt einzelnen Zellen gated durchgeführt, gefolgt von einem Gating jeder Zellpopulation.

Beide Isolationsmethoden ergaben eine niedrige CD14-positive Population und beide Methoden ergaben eine hohe CD11c-positive Gesamtpopulation. Weitere phänotypische Analysen wurden an allen CD11c-positiven Zellen durchgeführt, und obwohl die magnetische Isolierung einen höheren Prozentsatz an doppelt positiven CD11c-positiven CD14-positiven Zellen ergibt, war dieser Effekt im Vergleich zur Adhärenzmethode nicht signifikant. Bei diesen doppelt positiven CD11c-positiven, CD14-positiven Zellen kann es sich um differenzierte MDDCs im Frühstadium handeln, die den monozytären CD14-Marker noch nicht abgesetzt haben.

Bei der Analyse der einzelnen CD11c-positiven Zellen ergibt die Adhärenzmethode die höchste Ausbeute an CD11c-positiven und CD14-negativen Zellen. Bei diesen einzelnen positiven Zellen kann es sich um differenzierte MDDCs im Spätstadium handeln. Sobald sie gemeistert sind, können die Adhäsions- und magnetischen Isolationstechniken in drei bis vier bzw. ein bis zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle 48 Stunden frische Zytokine zur Differenzierung der dendritischen Zellen zu haben, wenn das Medium wieder aufgefüllt wird. Die Arbeit mit biologisch gefährlichen Flüssigkeiten wie Blut kann äußerst schädlich sein, und bei der Durchführung dieser Verfahren sollte immer geeignete persönliche Schutzausrüstung und Entsorgungsmethoden verwendet werden. Diese Studie ebnet Forschern auf dem Gebiet der Immunologie den Weg, um die Verwendung menschlicher Monozyten und dendritischer Zellen für die therapeutische Behandlung zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Isolierung menschlicher Monozyten optimieren können, um verschiedene Populationen von Monozytenzellen in vitro zu erzeugen.