Name: Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Erfahren Sie zwei Methoden zur Isolierung humaner Monozyten für dendritische Zellen mittels Adhärenz und magnetischer Trennung. Diese Protokolle ermöglichen die Charakterisierung durch Imaging-Durchflusszytometrie für immunologische Forschung.

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Diese Forschung wird unterstützt durch das National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, Preis K99/R00 AA021264. Zusätzliche Laborunterstützung im Rahmen des Startpakets wurde von der Abteilung für Immunologie, dem Institut für NeuroImmunpharmakologie, dem Herbert Wertheim College of Medicine und dem FIU-Büro für Forschung und wirtschaftliche Entwicklung erhalten. Gianna Casteleiro wurde von NIH/NIGMS R25 GM061347 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

Insgesamt menschlichem Blut Studien wurden von der Institutional Review Board (IRB) der FIU, IRB-Protokoll Genehmigung # IRB-13-0440, geprüft und genehmigt. Menschliche leukopaks wurden aus der Gemeinschaft Blutbank in Miami, FL gekauft. 1. Isolierung von PBMCs durch Standarddichte Gradiententechnik <ol><li> Durchführen einer 1: 1-Verdünnung von Blut mit 1x-phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einem T75-Kolben. </li><li> Pipette 15 ml Dichtegradient-Lösung in 50 ml Zentrifugenröhrchen und Schicht sorgfältig (25 bis 30 ml / Röhrchen) des verdünnten Blut über diesen Gradienten. </li><li> Zentrifuge für 20 min bei 1200 × g mit einer Beschleunigung von 1 und Verzögerung von 0. </li><li> Nach dem Zentrifugieren sammeln, um die Grenzschicht (weiße Blutkörperchen) in eine neue 50 ml Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Zellen zweimal in PBS (3 min bei 1.080 × g). Entsorgen Sie jedes Mal den Überstand. </li><li> Behandlung von Zellen mit Ammoniumchlorid-Kalium Lysieren (ACK) Puffer (zur Lyse der roten Blutzellen). 10 ml Puffer und incubate für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, Zentrifuge 3 min bei 1.080 x g und verwerfen jedes Mal Überstand. </li><li> Speichern Sie das Pellet, das die PBMCs enthalten wird. </li><li> Fahren Sie mit Monozyten- Reinigungsverfahren der Wahl. </li></ol> 2. Monozyt Reinigung durch Adherence-Methode <ol><li> Bereiten vollständige Zellkulturmedium, das L-Glutamin (300 mg / ml) und supplementiert mit Penicillin (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) und 10% fötalem Rinderserum. </li><li> Erlauben PBMCs für etwa 2 Stunden anhaften , indem sie in einem T75 - Kolben bei einer Konzentration von 5 x 10 7 Zellen pro 10 ml vollständigem Medium bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator kultiviert werden . </li><li> Nach der Inkubation Entfernen nicht-adhärenten Zellen aus den Kulturkolben schwimmend und sanft adhärenten Zellen zweimal mit PBS waschen. </li><li> Inkubieren adhärenten Zellen in Komplettzellkulturmedium, supplementiert mit 2 &amp; mgr; l / ml von humanem Granulozyten-macrophage Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und Interleukin 4 (IL-4) in einer Stammkonzentration von 10 ug / ml gelagert. </li><li> Ändern Sie die Hälfte des Mediums und füllt Zytokine alle 48 Stunden. </li><li> Lassen Sie 5 - 7 Tage die für die Differenzierung von Monozyten in MDDCs. </li></ol> 3. Monozyt Reinigung durch magnetische Trennung Methode <ol><li> Sammeln Sie PBMCs von Standarddichte Gradiententechnik, gießen Sie in ein 5 ml Polystyrolröhrchen und resuspendieren in PBS-Puffer bei einer Konzentration von Zellen / ml. </li><li> In menschlichen Monozyten Anreicherung Cocktail 50 &amp; mgr; l / ml Zellen, gut mischen und Inkubation bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Nach der Inkubation hinzufügen magnetischen Teilchen 50 &amp; mgr; l / ml Zellen, gut mischen und bei 4 ° C für 5 min inkubiert. </li><li> Bringen Zellsuspension auf ein Gesamtvolumen von 2,5 ml bis durch Zugabe von PBS-Puffer, gut mischen durch Pipettieren auf und ab 2 - 3 mal. </li><li> Legen Sie das Polystyrolröhrchen ohne Kappe in die Magnetvorrichtung und zur Seite bei RT-Set für 2.5 Minuten. </li><li> Nach der Inkubation und in einer kontinuierlichen Bewegung, um den Magneten aufzunehmen und die gewünschte gereinigte Monocyten-Fraktion in ein sauberes 50 ml Zentrifugenröhrchen gießen. </li><li> Inkubieren adhärenten Zellen in Komplettzellkulturmedium, supplementiert mit 2 &amp; mgr; l / ml von humanem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und Interleukin 4 (IL-4) in einer Stammkonzentration von 10 ug / ml gelagert. </li><li> Jede 48 Stunden, ändern Sie für 5 min bei 1.080 xg Hälfte des Mediums, des Abschaltens und erneut zu suspendieren Pellet mit neuen Medien (cRPMI) und Zytokinen. </li><li> Lassen Sie 5 - 7 Tage die für die Differenzierung von Monozyten in MDDCs. </li></ol> 4. Trypanblauausschluß Viability Assay Hinweis: Verwenden Sie diese Technik Zellausbeute und die Lebensfähigkeit von PBMCs zu erhalten, Monozyten und MDDCs. <ol><li> Ernten Sie die Zellen unter Verwendung von Standard-Trypsin-EDTA und führen Sie wäscht der Kolben und das Zellpellet unter Verwendung von PBS. Abhängig von der Größe des Pellets wiederin 5 bis 10 ml PBS suspendieren das Pellet aufzulösen. </li><li> In einem Mikrozentrifugenröhrchen, führen Sie eine 1: 1-Verdünnung von Trypanblau Reagenz mit verdünnter Zellpellet. </li><li> Aus dieser Mischung aliquote 10 ul in eine Zelle zu zählen Rutsche und Leseergebnisse eine automatische Zellzähler mit dem Protokoll des Herstellers nach. Wenn eine automatische Zellzähler nicht verfügbar ist, eine ähnliche Zellzahl ist möglich, eine Hämozytometer oder einen manuellen Zähler verwenden. </li></ol> 5. MTT Assay <ol><li> Platten Zellen bei einer Konzentration von 4 x 10 4/100 &amp; mgr; l Vollmedium in jede Vertiefung in einer 96-Well - Platte. Erlauben Sie 24 h für Zellen zur Kultur anzupassen. </li><li> Inkubieren und führen Messungen bei 0 (Tag 0), 36 (Tag 3) und 84 (Tag 7) hr sind. </li><li> Nach Beendigung der gewünschten Inkubation entfernen Medien und ersetzen mit 100 ul PBS allein. </li><li> Bereiten 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl Tetrazolium Bromid-Lösung (MTT) (5 mg / ml) durch 10 ml dimeth ZugabeSulfoxid yl (DMSO) bis 1 g Natriumdodecylsulfat (SDS). </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l (5 mg / ml) MTT-Lösung in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 2 weitere Stunden. </li><li> Nach der Inkubation entfernen Stände, die PBS und nicht umgesetzten MTT Mischung (gelb-Farblösung) enthalten. </li><li> 100 l SDS-DMSO-Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für eine weitere Stunde. </li><li> Lesen Sie die Absorption bei 540 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader. </li></ol> 6. Zeiloberflächenfärbung Analyse von Imaging Durchflusszytometrie <ol><li> Nach 7 Tagen der Differenzierung von gereinigten Monozyten, verzichtet werden 1x10 6 Zellen Aliquots der Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in die entsprechende Anzahl von 1,5 - ml - Röhrchen. </li><li> Beginnen Zelloberflächenfärbung durch Blockieren Zellen unter Verwendung von 50 ul hitzeinaktiviertem (HALLO) Humanserum, Inkubation bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Nach der Inkubation Zentrifugen Zellen bei 720 xg für 5 min, Überstand verwerfen. </li><li> Zu Zelle pellet, fügen jeweiligen Fluorochrom-konjugierte Antikörper (zB Anti-CD11c oder anti-CD14) und lichtgeschützt für 20 min bei 4 ° C inkubieren. In getrennten Röhren, bereiten einzelne fluorochromgefärbt Proben / ml), da sie für die Kompensation benötigt werden. </li><li> Nach der Inkubation, Waschen zweimal Zellen in 1 ml PBS-Puffer und zentrifugieren jedes Mal bei 720 × g für 5 min. </li><li> Halten geschützten Zellen aus Licht, resuspendieren in PBS-Puffer bei einer Konzentration von Zellen / 100 &amp; mgr; l für die Durchflusszytometrie-Analyse. </li><li> Um auf lebende Zellen zu Gate, fügen 1 ul DAPI zu jedem Röhrchen vor, um die Zellen auf Einzelzell Imaging Durchflusszytometrie Instrument erwerben den Anweisungen des Herstellers nach. </li></ol> 7. Statistische Analyse <ol><li> Input alle Daten in einer Tabellenkalkulation. </li><li> Vergleichen Sie die Ergebnisse der Schüler t-Test und / oder Einweg-ANOVA als angemessen. </li><li> Betrachten Unterschiede statistisch signifikant zu sein, wenn p &lt;0,05. </li&gt; </ol>

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<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+dendritic+cells+through+CD40+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking.</a> J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).</li>
<li>Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Linkage+of+Innate+to+Adaptive+Immunity+via+Maturing+Dendritic+Cells+In+Vivo+Requires+CD40+Ligation+in+Addition+to+Antigen+Presentation+and+CD80%2F86+Costimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation.</a> J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).</li>
<li>Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+and+maturation+on+human+monocyte-derived+dendritic+cell+surface+markers%2C+necrosis+and+antigen+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding.</a> Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).</li>
</ol>

Alle Autoren legen keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen.

Basierend auf den bekannten Schwierigkeiten bei der Isolierung und MDDCs aus menschlichem Blut, ist die vorliegende Studie zielte darauf ab, um einen umfassenden Vergleich von zwei etablierte Methoden zur Erzeugung von MDDCs erzeugen. Das erste Verfahren ist im Vergleich eine gut etablierte traditionelle Methode zur Erzeugung MDDCs durch die Fähigkeit der Monozyten Ausnutzen auf Glas oder Kunststoff (Adhärenz - Methode) 21,22,27 haften. Die Einhaltung Methode ist schnell und kostengünstig, und erfordern nicht...

Dendritische Zellen (DCs) sind wesentliche Vermittler der angeborenen und adaptiven Immunsystem. Sie funktionieren auf primäre Immunantworten induzieren und die Entwicklung von immunologischen Gedächtnisses erleichtern. Diese Zellen sind in erster Linie verantwortlich für die Antigen - capture, Migration und T - Zell - Stimulation und werden daher als professionelle Antigen präsentierende Zellen bezeichnet (APCs) 1 .Manipulation von DCs in einer Vielzahl von Forschungsfeldern und im klinischen Umfeld verwendet werden könnte , anders zu behandeln Entzündungserkrankungen wie HIV 6,7, Krebs 8, Autoimmunerkrankungen 9 und allergische Reaktionen 10. DCs sind auch für Drogenmissbrauch Forschung eingesetzt, um unbekannte Mechanismen und Wege zu lösen , wie sie im Zusammenhang mit Alkoholabhängigkeit 11-14, Drogenabhängigkeit 13,15, und die Kombination von HIV - Infektionen und Drogenmissbrauch 16-19. Diese laufenden Studien und zukünftige Studien in auf dem Gebiet der Immunologie machen in vitro Generierung von DCs extrem wichtig für die Forschung. Es gibt jedoch einige Schwierigkeiten , die mit DCs aus humanem Blut zu isolieren , da sie nur 0,1 bilden - 1% der gesamten mononuklearen Blutzellen 20. Bis heute sind einige der gut etablierten Methoden zur Erzeugung von DCs in vitro besteht aus Kunststoff oder Glas , Adhäsion von Monozyten 21,22, Dichtegradientenzentrifugation 23, spezifischer Marker basierend Trennung wie magnetische aktivierte Zellsortierung 22, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung 24, positive Selektion von CD14 + Monozyten Dextran-beschichteten magnetischen Nanopartikel 25 verwenden und schnelle Isolierung von hoch gereinigten Monozyten vollautomatisierte negativen Zellselektion 26 verwendet wird . Allerdings bleibt die beste Methode der Wahl umstritten. Daher DC Erzeugungstechniken zu verbessern, wurden verschiedene Verfahren entwickelt worden, in denenDie Reinheit dieser Zellen stark durch Differenzierung aus gereinigtem CD34 + Vorläuferzellen und Monozyten , isoliert aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) 27 erhöht werden kann. Wie vor erwähnt, ist ein weit verbreitetes und beliebte Methode für Monozyten - abgeleiteten dendritischen Zellen (MDDCs) Erzeugen der Fähigkeit der Monozyten zu untersuchen , um Glas oder Kunststoff (Adhärenz - Methode) 21,22,27 haften. Die Einhaltung Methode ist eine schnelle und einfache Methode, die nicht die Verwendung von komplexer Ausrüstung erfordert. Jedoch enthalten einige Nachteile dieses Verfahrens Lymphozyt Kontamination, eine geringe Flexibilität und Monocyten transient Manipulation 28. Ein alternatives Verfahren zur Einhaltung Methode ist die magnetische Isolierung von Monozyten aus Gesamt PBMCs, insbesondere bei Verwendung eines menschlichen Monocyten - Anreicherungs Kit, der 26 Monozyten aus PBMCs durch negative Selektion isoliert ausgebildet ist. Während dieses Verfahrens werden unerwünschte Zellen zur Entfernung mit tetrameren gezielteAntikörper-Komplexe und Dextran-beschichtete magnetische Teilchen. Der Vorteil dieser Isolationsmethode besteht darin, daß die unerwünschten markierten Zellen mit Hilfe eines Magneten getrennt werden, während die Zielzellen frei, ohne dass Spalten aus in ein neues Röhrchen gegossen werden. Bis heute mit der Verfügbarkeit von spezifischen monoklonalen Antikörpern, die spezifisch Zellpopulationen, die magnetische Trenntechnik hat etikettieren kann nicht einfach eine zusätzliche Methode, sondern eine Notwendigkeit für die Isolierung von seltenen Zellen in dem Gebiet der Immunologie werden. Beispielsweise Techniken wie magnetische Zellsortierung mit handelsüblichen paramagnetischem MACS-Nanopartikel haben die Entwicklung neuer Ansätze für Forschung und klinische Anwendungen 22,29 erleichtert. Darüber hinaus haben die jüngsten Studien Forschung Vergleich DC Generation von Monozyten Adhärenz und MACS - Technologie Methoden eine höhere DC - Reinheit und Lebensfähigkeit nachgewiesen MACS getrennt Monozyten 22,30 verwendet. Die aktuelle Studie präsentiertEin Vergleich zwischen den zwei Verfahren zur Herstellung von humanen DCs aus Monozyten aus PBMCs isoliert: 1) monocyte Isolierung durch Adhärenz und 2) monocyte Isolierung durch negative Selektion Kommerzielle menschlichen Monocyten Anreicherungs Kit. Diese Studie liefert Hinweise darauf, dass die negative Selektion magnetische Trennverfahren Monozyten erzeugt die höchste Ausbeute an Monozyten keine signifikanten Unterschiede in Monozyten Lebensfähigkeit zu isolieren, wenn sie mit isolierten Monozyten durch die Einhaltung Methode verglichen. Wiederum nach sieben Tagen, die durch magnetische Trennung getrennt Monozyten in MDDCs differenziert mit deutlich höheren proliferative Kapazität und höhere Menge an Zellen, die doppelt positiven (+ CD11c / CD14 +) Phänotyp ohne MDDC Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Insgesamt unterscheidet sich die aktuelle Studie aus den bisherigen Studien oben Bezug genommen wurde, da es die Fähigkeit beider Techniken demonstriert gleichzeitig Monozyten erzeugen, die von wuchernden fähig sind und Differenzierung in CD11c +MDDCs (&gt; 70%) nach sieben Tagen in Kultur ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Darüber hinaus bietet der derzeitige Ansatz zum ersten Mal Charakterisierung verschiedener CD11c / CD14 MDDCs Populationen von Abbildungs ​​Durchflusszytometrie. Zusammengefasst, da DCs eine Brenn Rolle in Bezug auf die Forschung im Bereich der Immunologie spielen, müssen verschiedene Parameter berücksichtigt werden , wenn man bedenkt , wie sie abgeleitet sind und welche sind Methoden verwendet , um sie in vitro zu isolieren und Kultur. Daher zielt diese Studie Erkenntnisse über zwei verschiedene Methoden der Monozyten-Isolierung und wie diese Methoden unterschiedlich Monozyten Lebensfähigkeit und Ausbeute schließlich dendritischen Zellen Lebensfähigkeit, Proliferation zu beeinflussen, und Phänotyp beeinflussen. Diese Ergebnisse werden stark auf dem Gebiet der Immunologie beitragen und ein ausführliches Protokoll der DC-Isolierung, Reinigung und Charakterisierung liefern.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>Muss bei RT verwendet</td></tr><tr><td>werden Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing-Puffer</td><td>Qualität Biologisch</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Puffer</td><td>StemCell</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Humanes Monozytenanreicherungskit</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatisierter Zellzähler</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0101</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Fleck (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 Multimode-Lesegerät</td><td>Biotek</td><td>7131000</td><td></td></tr><tr><td>XTT Natriumsalz-Bioreagenz (XTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X4626-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid-Bioreagenz (DMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolylblau-Tetrazoliumbromid (MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>m5655-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Phenazin-Methosulfat (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9626-1G</td><td></td></tr><tr><td>Inaktiviertes (HI) Humanserum</td><td>Chemicon</td><td>S1-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Durchflusszytometer</td><td>BD Accuri</td><td>653119</td><td></td></tr><tr><td>FlowSight Amnis Durchflusszytometer</td><td>EMD Millipore</td><td>100300</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung von humanen monozyten-abgeleiteten dendritischen zellen durch imaging durchflusszytometrie: ein vergleich zwischen zwei monozyt isolation protokolle

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritische Zellen (DCs) sind Antigen-präsentierende Zellen des Immunsystems, die eine entscheidende Rolle bei der Lymphozytenreaktion, den Abwehrmechanismen des Wirts und der Pathogenese von Entzündungen spielen. Die Isolierung und Untersuchung von DCs war in der biologischen Forschung aufgrund ihrer charakteristischen Merkmale wichtig. Obwohl sie essentielle Schlüsselmediatoren des Immunsystems sind, sind DCs im Blut sehr selten und machen etwa 0,1 - 1% der gesamten mononukleären Zellen im Blut aus. Daher beruhen Alternativen für Isolierungsmethoden auf der Differenzierung von DCs von Monozyten, die aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) isoliert wurden. Die Verwendung geeigneter Isolierungstechniken, die Einfachheit, Erschwinglichkeit, hohe Reinheit und hohe Ausbeute der Zellen kombinieren, ist unbedingt zu berücksichtigen. In der vorliegenden Studie werden zwei unterschiedliche Methoden zur Erzeugung von DCs verglichen. Monozyten wurden durch Adhärenz selektiert oder mittels magnetischem Trennverfahren negativ angereichert, gefolgt von der Differenzierung in DCs mit IL-4 und GM-CSF. Die Lebensfähigkeit, Proliferation und der Phänotyp von Monozyten und MDDC wurden mit Hilfe von Viabilitätsfarbstoffen, MTT-Assays und CD11c/CD14-Oberflächenmarkeranalyse mittels bildgebender Durchflusszytometrie bewertet. Obwohl die magnetische Trennmethode im Vergleich zur Adhäsionsmethode einen signifikant höheren Prozentsatz an Monozyten mit höherer proliferativer Kapazität ergab, haben die Ergebnisse gezeigt, dass beide Techniken in der Lage sind, gleichzeitig Monozyten zu erzeugen, die in der Lage sind, sich nach sieben Tagen in Kultur zu proliferieren und zu lebensfähigen CD11c+ MDDCs zu differenzieren. Beide Methoden ergaben > 70% CD11c+ MDDCs. Daher liefern unsere Ergebnisse Erkenntnisse, die zur Entwicklung zuverlässiger Methoden zur Isolierung und Charakterisierung menschlicher DCs beitragen.

<html> Monozyten Ausbeute durch magnetische Trennung höher zu Monozyten Ausbeute nach der Adherence - Methode im Vergleich Die präsentierten Daten in Abbildung 1 Anzeige PBMC und Monozyten - Zellzahl durch den Trypanblau-Ausschluss - Verfahren am Tag der Isolierung von PBMCs und Trennung von Monozyten. Im Durchschnitt durch die Einhaltung Metho...

Diese Studie vergleicht zwei verschiedene Methoden der Isolierung humaner Monozyten zur Gewinnung von in vitro dendritischen Zellen (DCs). Monozyten werden durch Adhärenz selektiert oder durch magnetische Trennung negativ angereichert. Die Monozytenausbeute und -viabilität sowie die Viabilität, Proliferation und Expression von CD11c/CD14-Oberflächenmarkern werden zwischen beiden Methoden verglichen.

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Das übergeordnete Ziel dieser Studie besteht darin, zwei verschiedene Methoden zur Isolierung menschlicher Monozyten für die in-vitro-Generierung von dendritischen Zellen zu vergleichen und die CT11c- und CT14-Oberflächenexpression der resultierenden aus Monozyten abgeleiteten Populationen mittels bildgebender Durchflusszytometrie zu charakterisieren. Diese Protokolle zur Monozytenisolierung können zur Entwicklung zuverlässiger Methoden für die Aufreinigung menschlicher dendritischer Zellen für Forschungs- und klinische Anwendungen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Protokolle liegt darin, dass sie die Isolierung menschlicher Monozyten und deren Differenzierung in lebensfähige und funktionelle aus Monozyten abgeleitete Zellen erleichtern.Außerdem ist dies die erste Studie, die die spezifische Population monozytär abgeleiteter dendritischer Zellen mittels Einzelzell-Bildströmungszytometrie charakterisiert. Diese Methode kann auch als Alternative zur Isolierung anderer seltener Zellen mit ausreichender Ausbeute für nachgeschaltete Forschungsanwendungen eingesetzt werden. Die visuelle Darstellung dieser Methoden ist entscheidend, da die sichere Handhabung von Blutproben ohne entsprechende Anleitung und Erfahrung herausfordernd sein kann.Beginnen Sie damit, die Blutprobe in einem T75-Fläschchen im Verhältnis 1:1 mit PBS zu verdünnen. Geben Sie anschließend 15 Milliliter der Dichtegradientenlösung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und schichten Sie vorsichtig 25 bis 30 Milliliter der verdünnten Blutprobe über den Gradienten. Um eine ordnungsgemäße Trennung der peripheren mononukleären Blutzellen zu erzielen, geben Sie das Blut schnell, aber vorsichtig und ohne Vermischung der Schichten, auf die Dichtegradientenlösung.Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und überführen Sie anschließend die weiße Blutzellschicht in ein neues kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS und resuspendieren Sie das endgültige Pellet 15 Minuten lang in 10 Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer bei 4 Grad Celsius. Anschließend waschen Sie die Zellen nochmals zweimal in PBS.Um Monozyten mittels der Adhärenzmethode zu isolieren, kultivieren Sie fünf Mal 10 hoch 7 Zellen des resultierenden PBMC-Pellets pro 10 Milliliter vollständigem Medium in einer neuen T75-Flasche für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator. Entsorgen Sie am Ende der Inkubation die nicht-angewachsenen, schwebenden Zellen und waschen Sie die angewachsenen Zellen vorsichtig zwei Mal mit PBS. Versorgen Sie anschließend die angewachsenen Zellen mit vollständigem Zellkulturmedium, das mit humanem GM-CSF und IL-4 ergänzt wurde, und stellen Sie die Kultur für fünf bis sieben Tage zurück in den Inkubator.Um die Monocyten mittels magnetischer Trennung zu isolieren, überführen Sie nach der Gewinnung der PBMC durch Dichtegradientenzentrifugation die weiße Blutzellschicht in ein fünf Milliliter fassendes Polystyrolröhrchen und resuspendieren die Zellen in PBS auf eine Konzentration von fünf mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter eines menschlichen Monocyten-Anreicherungscocktails pro Milliliter Zellsuspension unter Mischen hinzu und inkubieren die Zellen mit dem Cocktail bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Danach geben Sie 50 Mikroliter magnetische Partikel pro Milliliter Zellsuspension unter vorsichtigem Mischen hinzu und inkubieren die Zellen bei 4 Grad Celsius für fünf Minuten.Am Ende der zweiten Inkubation PBS zu den Zellen hinzufügen, um das Gesamtvolumen auf 2,5 ml aufzufüllen, und durch zweimaliges bis dreimaliges Pipettieren mischen. Anschließend das Polystyrolröhrchen in ein geeignetes magnetisches Gerät bei Raumtemperatur stellen. Nach zweieinhalb Minuten, während sich das Röhrchen weiterhin im Magnet befindet, die gereinigte Monozyten-Fraktion in ein neues kegelförmiges 15-ml-Röhrchen abgießen.Kultivieren Sie anschließend die gereinigten Monozyten in vollständigem Zellkulturmedium, das mit GM-CSF und IL-4 ergänzt ist, fünf bis sieben Tage lang, wie gerade gezeigt. Nach sieben Tagen der Differenzierung geben Sie jeweils eine Portion von 1 × 10⁶ Zellen der aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen in die erforderliche Anzahl von 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen jedem Proben 50 µL hitzeinaktiviertes humanes Serum hinzu, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Zentrifugieren Sie die Zellen nach 10 Minuten und resuspendieren Sie die Pellets in der entsprechenden fluoreszenzmarkierten primären Antikörperlösung für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, lichtgeschützt.Waschen Sie die Zellen anschließend zweimal in einem Milliliter PBS und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern PBS pro eine mal zehn hoch sechs Zellen. Unmittelbar vor der Analyse fügen Sie je einem Mikroliter DAPI zu jedem Röhrchen hinzu. Anschließend analysieren Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer für Einzelzellbildgebung gemäß den Herstelleranweisungen.Im Durchschnitt machen Monozyten, die mittels der Adhärenzmethode isoliert wurden, etwa sechs Komma zwei Prozent der gesamten peripheren mononukleären Blutzellen, oder PBMCs, aus, während die mittels magnetischer Trennung isolierten Monozyten bis zu 25 Prozent der gesamten PBMC-Population ausmachen. Monozyten, die mit beiden Methoden isoliert wurden, weisen eine vergleichbare Lebensfähigkeit auf. Aus Monozyten differenzierte MDDCs, die aus mittels beider Methoden gereinigten Monozyten stammten, wurden zunächst basierend auf DAPI-negativen oder lebensfähigen Zellen aus der Gesamtpopulation einzelner Zellen ausgewählt, gefolgt von der Selektion der jeweiligen Zellpopulationen.Beide Isolationsmethoden ergaben eine geringe Population einzelner CD14-positiver Zellen, und beide Methoden lieferten eine hohe Gesamtpopulation CD11c-positiver Zellen. Eine weitere phänotypische Analyse wurde an allen CD11c-positiven Zellen durchgeführt, und obwohl die magnetische Isolierung einen höheren Prozentsatz doppelt positiver CD11c-positiver, CD14-positiver Zellen ergab, war dieser Effekt im Vergleich zur Adhärenzmethode nicht signifikant. Diese doppelt positiven CD11c-positiven, CD14-positiven Zellen könnten MDDCs im frühen Differenzierungsstadium darstellen, die den monozytären Marker CD14 noch nicht verloren haben.Bei der Analyse der einzelnen CD11c-positiven Zellen liefert die Adhärenzmethode die höchste Ausbeute an CD11c-positiven, CD14-negativen Zellen. Diese einzelnen positiven Zellen könnten spät differenzierte MDDCs darstellen. Wenn die Methoden einmal beherrscht sind, können die Adhärenz- und die magnetische Isolierungstechnik, sofern ordnungsgemäß durchgeführt, in drei bis vier bzw. ein bis zwei Stunden abgeschlossen werden.Während dieses Verfahrens ist es wichtig, alle 48 Stunden frische Zytokine für die Differenzierung dendritischer Zellen hinzuzufügen, wenn das Medium erneuert wird. Das Arbeiten mit biohazardhaltigen Flüssigkeiten wie Blut kann äußerst schädlich sein, und die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung sowie ordnungsgemäßer Entsorgungsmethoden sollte stets beachtet werden, wenn diese Verfahren durchgeführt werden. Diese Studie ebnet Forschern auf dem Gebiet der Immunologie den Weg, die Verwendung menschlicher Monozyten und dendritischer Zellen für therapeutische Behandlungen zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Isolierung menschlicher Monozyten optimiert werden kann, um verschiedene Populationen monozytenabgeleiteter Zellen in vitro zu erzeugen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir stellen ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung von menschlichen Makrophagen. Buffy Coats werden durch Doppel Dichtegradientenzentrifugation isoliert verarbeitet und Monozyten werden dann an Makrophagen in Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel differenziert. Dies maximiert Makrophagen-Renditen und erleichtert die Zellernte für nachfolgende Experimente.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Hier zeigen wir, wie Monozyten durch magnetische Kügelchentrennung aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes nach Dichtegradientenzentrifugation von humanem antikoaguliertem Blut isoliert werden. Nach einer 5-tägigen Inkubation werden die menschlichen Monozyten in unreife dendritische Zellen differenziert und sind bereit für experimentelle Verfahren in einer nicht-klinischen Umgebung.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dieses Protokoll liefert eine Analyse der Makrophagen-Subpopulationen in das erwachsene Maus-Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie und ist hilfreich für die Untersuchung von mehreren Markern, die von diesen Zellen exprimiert werden.

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Charakterisierung von Monocyte Teilmengen von Vollblut Durchflusszytometrie. Dazu gehören wie Tor die Teilmengen und bewerten ihren Ausdruck der oberflächenmarker skizziert und geben ein Beispiel für die Beurteilung des Ausdrucks (entzündlich) M1 und M2-Marker (entzündungshemmend).

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Hier präsentieren wir Ihnen eine integrierte Protokoll, die Monocyte Subpopulation Handel unter in-vitro-Fluss durch Verwendung von spezifischen Oberflächenmarker und konfokale Fluoreszenzmikroskopie misst. Dieses Protokoll kann sequentielle Rekrutierung Schritte sowie zu erkunden, andere Leukozyten-Subtypen mit anderen spezifischen Oberflächenmarker Profil verwendet werden.

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung, Transfekung und Unterscheidung menschlicher Primärmonozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Kontrollen vorgestellt.

Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten

Die Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie kann wesentlich zum Verständnis des Musters der Immunantwort gegen Implantate beitragen. In dieser Arbeit wird eine präzise Methode zur Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Färbung für die durchflusszytometrische Analyse beschrieben.

Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

Ein einzigartiges, umfassendes Protokoll zur Generierung von de-sialylierten humanen monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (mo-DCs) aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung einer Sialidase-Behandlung wird vorgestellt. Des Weiteren werden Methoden zur Beurteilung der phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von mo-DCs beschrieben und evaluiert, wie die Behandlung mit Sialidase das Reifungsniveau von mo-DCs verbessert.

Generierung von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen mit unterschiedlichen sialylierten Phänotypen

Monozyten und Makrophagen sind sehr plastische und reprogrammierbare Immunzellen, die für Gesundheit und Krankheit entscheidend sind. Sie spüren und reagieren auf ein breites Spektrum von Reizen, indem sie spezifische Differenzierungsprogramme und Phänotypen übernehmen. Wir haben ein In-vitro-Modell standardisiert, um die Polarisation und Reprogrammierung von Makrophagen zu untersuchen, was ein wertvolles Werkzeug für die Forschung darstellt.

Reprogrammierungsmodell von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen für In-vitro-Assays

Wir beschreiben ein Verfahren zur Bewertung der Fähigkeit pharmakologischer Wirkstoffe, tolerogene dendritische Zellen aus naiven Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in vitro zu generieren und ihre Wirksamkeit durch autologe regulatorische T-Zell-Generierung zu validieren.

Eine einfache und effiziente Methode zum Testen immunmodulatorischer Wirkstoffe zur Erzeugung tolerogener dendritischer Zellen aus humanen CD14+ -Monozyten

Erfahren Sie zwei Methoden zur Isolierung humaner Monozyten für dendritische Zellen mittels Adhärenz und magnetischer Trennung. Diese Protokolle ermöglichen die Charakterisierung durch Imaging-Durchflusszytometrie für immunologische Forschung.

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle (Video) | JoVE Journal

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

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