Name: Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Lernen Sie die Erzeugung und Anwendung von Rinder-Monozyten-dendritischen Zellen zur Bewertung der Impfstoffimmunogenität in vitro. Diese Methode schließt eine Lücke in der Tierimpfstoffforschung.

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Wir danken Dr. Eveline Wodak und Dr. Angelika Loistch (AGES) für ihre Unterstützung bei der Bestimmung des Gesundheitszustands der Tiere und für die Bereitstellung von BTV, Dr. Bernhard Reinelt für die Bereitstellung von Rinderblut und Dr. Bharani Settypalli und Dr. William Dundon von der IAEO für nützliche Ratschläge zu den Real-Time-PCR-Experimenten bzw. zur Sprachbearbeitung.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Diese Studie demonstriert eine standardisierte In-vitro-Methode zur Generierung und Phänotypisierung von bovinen MoDCs und deren anschließende Verwendung zur Messung der Immunogenität eines kommerziellen Impfstoffs (z. B. RV). Rinder-MoDCs können als Werkzeug für das Screening potenzieller Impfantigene gegen Rinderkrankheiten und die Vorhersage ihrer potenziellen klinischen Auswirkungen auf der Grundlage von Immunreaktionen verwendet werden, bevor mit In-vivo-Tierversuchen fortgefahren wird. Die generie...

Tierärztliche Impfungen stellen einen entscheidenden Aspekt der Tierhaltung und -gesundheit dar, da sie zur Verbesserung der Ernährungssicherheit und des Tierwohls beitragen, indem sie Schutz vor Krankheiten bieten, die den Viehzuchtsektor weltweit betreffen1. Eine wirksame In-vitro-Methode zur Beurteilung der Immunogenität möglicher Impfstoffkandidaten würde dazu beitragen, den Prozess der Impfstoffentwicklung und -produktion zu beschleunigen. Es ist daher notwendig, das Feld der Immuntests mit innovativen Methoden auf der Grundlage von In-vitro-Studien zu erweitern, da dies dazu beitragen würde, die Komplexität der Immunprozesse im Zusammenhang mit Immunisierung und Erregerinfektion aufzudecken. Derzeit werden In-vivo-Immunisierungs- und Provokationsstudien an Tieren, die regelmäßige Probenahmen (z. B. Blut und Milz) erfordern, verwendet, um die Immunogenität von Impfstoffkandidaten und Adjuvantien zu messen. Diese Tests sind teuer, zeitaufwändig und haben ethische Implikationen, da in den meisten Fällen die Euthanasie der Tiere am Ende der Studien durchgeführt wird.
Als Alternative zu In-vivo-Assays wurden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) verwendet, um impfstoffinduzierte Immunantworten in vitrozu untersuchen 2. PBMCs sind eine heterogene Zellpopulation, die sich zu 70 % bis 90 % aus Lymphozyten, zu 10 % aus Monozyten und einer begrenzten Anzahl von dendritischen Zellen (DCs, 1 % bis 2 %) zusammensetzt3. PBMCs beherbergen antigenpräsentierende Zellen (APCs) wie B-Zellen, Monozyten und DCs, die den Organismus ständig auf der Suche nach Anzeichen von Infektionen oder Gewebeschäden patrouillieren. Lokal sezernierte Chemokine erleichtern die Rekrutierung und Aktivierung von APCs an diesen Stellen, indem sie an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Im Falle von Monozyten lenken Chemokine ihr Schicksal darauf, sich entweder in DCs oder Makrophagen zu differenzieren4. Sobald DCs auf einen Erreger treffen und ihn einfangen, wandern sie zu sekundären lymphatischen Organen, wo sie die prozessierten Pathogenpeptidantigene mit Hilfe von MHC-Oberflächenproteinen der Klasse I oder II CD8+ T-Zellen bzw. CD4+ T-Zellen präsentieren und so eine Immunantwort auslösenkönnen 5,6.
Die Schlüsselrolle, die DCs bei der Orchestrierung einer schützenden Immunantwort gegen verschiedene Krankheitserreger spielen, macht sie zu einem interessanten Forschungsziel für das Verständnis intrazellulärer Immunmechanismen, insbesondere bei der Entwicklung von Impfstoffen und Adjuvantien gegen Infektionserreger7. Da der Anteil der DCs, die aus PBMCs gewonnen werden können, eher gering ist (1%-2%), wurden stattdessen Monozyten verwendet, um DCs in vitro zu erzeugen 8. Diese von Monozyten abgeleiteten DCs (MoDCs) wurden zunächst als mögliche Behandlungsstrategie in der Krebsimmuntherapie entwickelt9. In jüngerer Zeit wurden MoDCs für die Impfstoffforschung verwendet 10,11,12, und klassische Monozyten sind der vorherrschende Subtyp (89 %) für die MoDC-Produktion 13. Die Herstellung von MoDCs in vitro wurde zuvor durch die Zugabe von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) in Kombination mit anderen Zytokinen wie Interleukin-4 (IL-4), Tumornekrosefaktor α (TNF-α) oder IL-13erreicht 14,15,16.
Der Erfolg eines In-vitro-MoDC-Assays hängt von der Fähigkeit antigenstimulierter reifer MoDCs ab, das Ausmaß und die Art der Immunantwort spezifisch für die Art des nachgewiesenen Antigens zu modulieren17. Die Art des Erregers, der von MoDCs erkannt und präsentiert wird, bestimmt die Differenzierung von CD4+ T-Helferzellen (Th) in Th1-, Th2- oder Th17-Effektorzellen und ist durch ein pathogenspezifisches sekretorisches Zytokinprofil gekennzeichnet. Eine Th1-Antwort wird gegen intrazelluläre Pathogene hervorgerufen und führt zur Sekretion von Interferon-gamma (IFN-γ) und Tumornekrosefaktor beta (TNF-β), was den phagozytischen Schutz moduliert. Eine Th2-Antwort wird gegen parasitäre Organismen ausgelöst und ist durch die Sekretion von IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 gekennzeichnet, die einen phagozytisch-unabhängigen humoralen Schutz initiiert. Th17 bietet einen neutrophilenabhängigen Schutz vor extrazellulären Bakterien- und Pilzinfektionen, die durch die Sekretion von IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 und TNF-α 18,19,20,21 vermittelt werden. Aufgrund früherer Studien wurde festgestellt, dass nicht alle Erreger innerhalb des erwarteten Zytokinprofils liegen. Zum Beispiel stimulieren dermale MoDCs als Reaktion auf eine parasitäre Leishmanieninfektion die IFN-γ Sekretion von CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen und induzieren so eine proinflammatorische Th1-Antwort22.
Es wurde auch gezeigt, dass MoDCs von Hühnern, die mit Salmonella-Lipopolysaccharid (LPS) geprimt wurden, eine variable Antwort gegen Salmonella typhimurium induzieren können, indem sie sowohl Th1- als auch Th2-Antworten aktivieren, während Salmonella gallinarum allein eine Th2-Antwort induziert, was die höhere Resistenz des letzteren gegenüber der MoDC-Clearanceerklären könnte 23. Die Aktivierung von MoDCs gegen Brucella canis (B. canis) wurde sowohl bei Hunden als auch bei menschlichen MoDCs berichtet, was bedeutet, dass dies einen zoonotischen Infektionsmechanismus darstellen könnte24. Humane MoDCs, die mit B. canis geprimt sind, induzieren eine starke Th1-Antwort, die eine Resistenz gegen schwere Infektionen verleiht, während canine MoDCs eine dominante Th17-Antwort mit einer reduzierten Th1-Antwort induzieren, was in der Folge zur Etablierung einer chronischen Infektion führt25. Bovine MoDCs zeigen eine erhöhte Affinität für das Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV), das mit Immunglobulin G (IgG) konjugiert ist, im Vergleich zu nicht-konjugierten FMDV allein, da die MoDCs als Antwort auf die erstgenannten einen Virus-Antikörper-Komplex bilden10. Zusammenfassend zeigen diese Studien, wie MoDCs verwendet wurden, um die Komplexität von Immunantworten während der Infektion mit Krankheitserregern zu analysieren. Die adaptiven Immunantworten können durch die Quantifizierung spezifischer Marker bewertet werden, die mit der Proliferation von Lymphozyten assoziiert sind. Ki-67, ein intrazelluläres Protein, das nur in sich teilenden Zellen nachgewiesen wird, gilt als zuverlässiger Marker für Proliferationsstudien26, und in ähnlicher Weise entspricht CD25, das während der späten Phase der Aktivierung auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert wird, der Proliferation von Lymphozyten27,28.
Diese Studie demonstriert eine standardisierte Methode zur In-vitro-Generierung von Rinder-MoDCs und deren Anwendung in einem In-vitro-Immunassay, der zur Prüfung der Immunogenität von Impfstoffen verwendet wird. Ein kommerziell erhältlicher Tollwutimpfstoff (RV) wurde verwendet, um die Wirksamkeit dieses Tests zu validieren. Die Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten wurde mittels Durchflusszytometrie, quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) durch die Analyse etablierter Zellaktivierungsmarker wie Ki-67 und CD25 und der Sekretion von IFN-γ 28,29,30,31 gemessen. Während des MoDC-Assays werden keine Tier- oder Humanversuche durchgeführt.

<table><tbody><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>A1049201</td><td>Ammonium-Chlorid-Kalium-Puffer für die Lyse von Rest-Erythrozyten in geernteten PBMC-Fraktion</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Heparin-Röhrchen</td><td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td><td>366480</td><td>10 ml, Additiv Natrium-Heparin 158 USP-Einheiten, Glasröhrchen, 16 x 100 mm Größe</td></tr><tr><td>Rinder-Dendritische Zellwachstumskit</td><td>Bio-Rad, UK</td><td>PBP015KZZ</td><td>Zytokin-Cocktail bestehend aus rekombinantem bovinem IL-4 und GM-CSF</td></tr><tr><td>bovinem IFN-& gamma; ELISA-Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA5638KZZ</td><td>Kit zur Messung der IFN- und Gamma-Expression in Kulturüberständen</td></tr><tr><td>CD14-Antikörper</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2678F</td><td>Maus Anti-Rinder CD14 monoklonaler Antikörper, Klon CC-G33, Isotyp IgG1</td></tr><tr><td>CD25 Antikörper</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2430PE</td><td>Maus Anti-Rinder CD25 monoklonaler Antikörper, Klon IL-A11, Isotyp IgG1</td></tr><tr><td>CD4 Antikörper</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1653A647</td><td>Monoklonaler Anti-Rinder-CD4-Antikörper der Maus, Klon CC8, Isotyp IgG2a</td></tr><tr><td>CD40 Antikörper</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2431F</td><td>Maus Anti-Rinder-CD40 monoklonaler Antikörper, Klon IL-A156, Isotyp IgG1</td></tr><tr><td>CD8 Antikörper</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA837F</td><td>Maus Anti-Rinder-CD8 monoklonaler Antikörper, Klon CC63, Isotyp IgG2a</td></tr><tr><td>CD86 Antikörper</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2437PE</td><td>Maus Anti-Rinder CD86 monoklonaler Antikörper, Klon IL-A190, Isotyp IgG1</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Nachweissystem</td><td>Bio-Rad-Thermocycler</td><td></td> <td>PCR-Maschine</td></tr><tr><td>Corning Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon Corning&nbsp;</td><td>352096 & 352070</td><td>15 mL und 50 mL, hochklarer Poypropylen-Konusboden, graduiert, sterial, Verschluss mit Schraubverschluss, Falkenröhrchen</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Plus</td><td>BD Bio Sciences</td><td>555028</td><td>Fixations-/Permeabilisierungskit mit BD golgiPlug, zur Verwendung für die Färbung von Durchflusszytometerzellen</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1009832500</td><td>Absolute für die Analyse EMSURE&nbsp; ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10500064</td><td>Qualifiziertes, hitzeinaktiviertes</td></tr><tr><td>Ficoll Plaque PLUS</td><td>GE Gesundheitswesen Life Sciences, USA</td><td>341691</td><td>Lymphozyten-Isolationsmedium</td></tr><tr><td>FlowClean Reinigungsmittel</td><td>Beckman Coulter, Life Sciences</td><td>A64669</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA-</td><td></td><td>Durchflusszytometer Histogramm-Software</td></tr><tr><td>FlowTubes/ FACS&nbsp; (Fluoreszenzaktivierte Einzelzellsortierung) Röhre</td><td>Falcon Corning&nbsp;</td><td>352235</td><td>5 ml, steriales Polystyrol-Reagenzglas mit rundem Boden und Schnappverschluss für das Zellsieb, Verwendung in der Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td><td>Sigma Aldrich, Deutschland</td><td>60842-46-8</td><td>FITC-dextran MW</td></tr><tr><td>Gallios Durchflusszytometer</td><td>Beckman Coulter-Durchflusszytometermaschine</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hartschalen-PCR-Platten für 96 Brunnen</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td>96 Well, flaches Profil, dünnwandig, mit Rand, weiß/klar</td></tr><tr><td>Humane CD14-Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Bioteck, Deutschland</td><td>130-050-201</td><td>2 mL Mikrokügelchen, konjugiert mit monoklonalen anti-humanen CD14-Antikörpern Isotyp IgG2a, verwendet für die Selektion von Rindermonozyten aus PBMCs</td></tr><tr><td>Kaluza</td><td>Beckman Coulter, Deutschland</td><td></td> - <td>Mehrfarbige Datenanalysesoftware für Durchflusszytometer</td></tr><tr><td>MACS Säule</td><td>Miltenyi Bioteck, Deutschland</td><td>130-042-401</td><td>Magnetisch aktivierte Zellsortierung oder immunmagnetische Zelltrennungssäule zur Trennung verschiedener CD14-Zellpopulationen auf Basis von Zelloberflächenantigenen</td></tr><tr><td>MHC Klasse II DQ DR Polymorpher Antikörper</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2228F</td><td>Maus Anti-Schaf MHC Klasse II DQ DR Polymorph:FITC, Klon 49.1, Isotyp IgG2a, kreuzreaktiv mit</td></tr><tr><td>Rinder-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HS4325</td><td>1,5 mL, konischer Boden, graduiert, steriale Röhre</td></tr><tr><td>Microsoft Power Point</td><td></td> <td>Microsoft-Die</td> <td>grafischen Illustrationen des Versuchsdesigns</td></tr><tr><td>Maus IgG1 Negativkontrolle: FITC für CD14, CD40 Antikörper</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928F</td><td>Isotypkontrolle CD14 und CD40 monoklonale Antikörper&nbsp;</td></tr><tr><td>Maus IgG1 Negativkontrolle: PE für CD86 Antikörper</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928PE</td><td>Isotypkontrolle CD86 monoklonale Antikörper&nbsp;</td></tr><tr><td>Maus IgG1 Negativkontrolle: RPE für CD25 Antikörper</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928PE</td><td>Isotypkontrolle CD25 monoklonaler Antikörper&nbsp;</td></tr><tr><td>Maus-IgG2a-Negativkontrolle: FITC für MHC-Klasse-II-Antikörper</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA929F</td><td>Isotypkontrolle für monoklonale MHC-Klasse-II-Antikörper</td></tr><tr><td>Nobivac Tollwut</td><td>MSD Tiergesundheit,</td> <td>UK-1</td> <td>& Mikro; L/ml zellkultivierter inaktivierter Impfstoff mit > 2 I.E./mL Tollwutvirusstamm</td></tr><tr><td>Optische Dichtungen</td><td>Bi0-Rad</td><td>TCS0803</td><td>0,2 mL flaches PCR-Röhrchen 8-Kappen-Streifen, optisch, ultraklar, kompatibel für qPCR-Maschine</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>pH 7,4, 1x Konzentration</td></tr><tr><td>Prism - GraphPad 5 Software&nbsp;</td><td>Dotmatics-Statistical</td><td></td> <td>software</td></tr><tr><td>Aufgereinigter Anti-humaner Ki-67 Antikörper</td><td>Biolegend, USA</td><td>350501</td><td>Monoklonaler Antikörper, kreuzreaktiv mit Kuh, Klon ki-67</td></tr><tr><td>Aufgereinigter Maus IgG1 k Isotyp Ctrl Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>400101</td><td>Isotypkontrolle für monoklonalen Ki-67 Antikörper</td></tr><tr><td>READIDROP Propidium Iodid</td><td>BD Bio Sciences</td><td>1351101</td><td>Marker für lebende/tote Zellen für die Durchflusszytometrie, Amin-reaktiver Farbstoff</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-2-Protein</td><td>R& D System, USA</td><td>202-IL-010/CF</td><td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Kit zur Extraktion von Gesamt-RNA; RLT-Puffer = Lysepuffer; RW1-Puffer = stringenter guanidinhaltiger Waschpuffer; RDD-Puffer = DNase-Puffer; RPE-Puffer = Schonwaschpuffer; RNaseOUT = RNase-Hemmer.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758</td><td>Zellkulturmedien mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat</td></tr><tr><td>SMART-servier medical art&nbsp;</td><td>Les Laboratories Servier-Lizenziert</td><td></td> <td>unter einer Creative Commons Attribution 3.0 unported Lizenz</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5270</td><td>2x qPCR Mix enthält dNTPs, Ss07d Fusionspolymerase, MgCl2, SYBR Green I Supermix = Supermix, ROX Normalisierungsfarbstoffe.</td></tr><tr><td>SuperScript III Erststrangsynthesesystem</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>18080051</td><td>Kit für cDNA-Synthese</td></tr><tr><td>Gewebekultur Testplatte 24</td><td>TPP, Schweiz</td><td>92024</td><td>24-Well-Platte, sterilisiert durch Strahlung, wachstumsverstärkt behandelt, Volumen 3,18 mL</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td>0,4%, 100 mL, Farbstoff zur Beurteilung der Zellviabilität</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>0,1 &micro; m membranfiltriertes destilliertes Wasser</td></tr><tr><td>VACUETTE Heparin-Blutentnahmeröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15206067</td><td>VACUETTE Heparin-Blutentnahmeröhrchen haben eine grüne Oberseite und enthalten sprühgetrocknetes Lithium-, Natrium- oder Ammoniumheparin an den Innenwänden und werden in der klinischen Chemie, Immunologie und Serologie eingesetzt. Das Antikoagulans Heparin aktiviert Antithrombin, wodurch die Gerinnungskaskade blockiert wird und so eine Vollblut-/Plasmaprobe entsteht.</td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W3500-1L</td><td>Steril gefiltertes, bioreaktives Reagenz für Zellkultur</td></tr></tbody></table>

bestimmung der immunogenität von impfstoffen anhand von dendritischen zellen aus rindermonozyten

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritische Zellen (DCs) sind die potentesten antigenpräsentierenden Zellen (APCs) innerhalb des Immunsystems. Sie patrouillieren den Organismus auf der Suche nach Krankheitserregern und spielen eine einzigartige Rolle innerhalb des Immunsystems, indem sie die angeborene und die adaptive Immunantwort miteinander verbinden. Diese Zellen können phagozytieren und dann eingefangene Antigene den Effektor-Immunzellen präsentieren, was eine Vielzahl von Immunreaktionen auslöst. Diese Arbeit demonstriert eine standardisierte Methode zur In-vitro-Generierung von bovinen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs), die aus mononukleären Zellen (PBMCs) des peripheren Blutes von Rindern isoliert wurden, und ihre Anwendung bei der Bewertung der Immunogenität von Impfstoffen.
Die magnetische Zellsortierung wurde verwendet, um CD14+-Monozyten aus PBMCs zu isolieren, und die Supplementierung des kompletten Nährmediums mit Interleukin (IL)-4 und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) wurde verwendet, um die Differenzierung von CD14+-Monozyten in naive MoDCs zu induzieren. Die Generierung unreifer MoDCs wurde durch den Nachweis der Expression von Major Histocompatibility Complex II (MHC II), CD86 und CD40 Zelloberflächenmarkern bestätigt. Ein kommerziell erhältlicher Tollwutimpfstoff wurde verwendet, um die unreifen MoDCs zu pulsieren, die anschließend mit naiven Lymphozyten kokultiviert wurden.
Die durchflusszytometrische Analyse der antigengepulsten MoDCs und der Lymphozyten-Cokultur ergab die Stimulation der T-Lymphozytenproliferation durch die Expression von Ki-67-, CD25-, CD4- und CD8-Markern. Die Analyse der mRNA-Expression von IFN-γ und Ki-67 mittels quantitativer PCR zeigte, dass die MoDCs das antigenspezifische Priming von Lymphozyten in diesem in vitro Co-Kultursystem induzieren können. Darüber hinaus zeigte die mittels ELISA untersuchte IFN-γ-Sekretion einen signifikant höheren Titer (**p < 0,01) in der Tollwut-Impfstoff-gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur als in der nicht-antigengepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur. Diese Ergebnisse zeigen die Validität dieses In-vitro-MoDC-Assays zur Messung der Immunogenität von Impfstoffen, was bedeutet, dass dieser Assay verwendet werden kann, um potenzielle Impfstoffkandidaten für Rinder zu identifizieren, bevor mit In-vivo-Studien fortgefahren wird, sowie bei der Bewertung der Immunogenität von Impfstoffen kommerzieller Impfstoffe.

Diese Methodik beschreibt die In-vitro-Generierung von Rinder-MoDCs für die Evaluierung von Impfkandidatenantigenen vor der Durchführung von In-vivo-Studien. Abbildung 1 veranschaulicht das experimentelle Schema der bovinen MoDC-Generierung und die Anwendung der MoDCs für den In-vitro-Assay. Mit Hilfe der magnetischen Zellsortiertechnik war es möglich, etwa 26 Millionen CD14+-Myozyten aus den geernteten PBMCs zu gewinnen, die zuvor aus 50 ml Rinderblut ...

Die Methodik beschreibt die Generierung von bovinen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) und deren Anwendung für die In-vitro-Evaluierung von Antigenkandidaten während der Entwicklung potenzieller veterinärmedizinischer Impfstoffe bei Rindern.

Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Dieses Protokoll stellt einen funktionellen In-vitro-Assay dar, bei dem aus Rindermonozyten gewonnene dendritische Zellen verwendet werden, um die Immunogenität von Impfstoffen vor In-vivo-Studien zu messen. Damit wird eine bestehende Lücke in der Nutztiervakzinologie geschlossen. Es ist die Erzeugung und Anwendung von dendritischen Zellen.Als potenteste antigenpräsentierende Zellen sind dendritische Zellen zu einem wichtigen Forschungsziel für das Verständnis intrazellulärer Immunmechanismen, einschließlich der Wirksamkeit von Impfstoffen, geworden. Dieser Assay kann als Werkzeug für das Screening von Impfstoffkandidaten, als Qualitätskontrollstatus für die Impfstoffproduktion sowie für die Antigen- und Adjuvansauswahl eingesetzt werden. Richard Kangethe, Wissenschaftler im Labor für Tierproduktion und Tiergesundheit, demonstriert das Verfahren.Beginnen Sie damit, das Blut aus der Halsvenenpunktion des Kalbes umzukehren und mit heparinisierten Vacutainern zu mischen. Anschließend werden 20 Milliliter heparinisiertes Blut in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen überführt und mit 10 Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS verdünnt. Pipettieren Sie 15 Milliliter Lymphozyten-Isolationsmedium in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen und kippen Sie das Röhrchen in eine 45-Grad-Position.Legen Sie vorsichtig 30 Milliliter PBS-Blutmedium mit einer 25-Milliliter-Pipette auf die Lymphozytenisolierung und bringen Sie das Röhrchen langsam wieder in eine vertikale Position, bevor Sie es zentrifugieren. Sammeln Sie dann die dünne weiße Schicht der mononukleären Zellen des peripheren Blutes oder der PBMC-Schicht mit einer Pasteurpipette und übertragen Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die geernteten PBMCs zweimal mit 40 Millilitern PBS pro Waschgang und mischen Sie sie gründlich.Nach dem Zentrifugieren wird das Pellet in 15 Milliliter Ammoniumchlorid-Kaliumpuffer oder ACK-Puffer resuspendiert. Nach 10 bis 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur fügen Sie bis zu 40 Milliliter PBS hinzu und zentrifugieren das Röhrchen mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter des vollständigen Nährmediums.Fügen Sie dann fünf Mikroliter CD14 MicroBead-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzu und mischen Sie sie gründlich mit einer Pipette. Für die Durchflusszytometrie-Analyse werden 10 Mikroliter CD14-Fluorescein-Isothiocyanat oder FITC-Färbeantikörper zu den PBMCs gegeben und 15 Minuten bei vier bis acht Grad Celsius inkubiert, bevor Sie mit der Durchflusszytometrie fortfahren. Fügen Sie den ungefärbten PBMCs einen Milliliter Faxpuffer hinzu und zentrifugieren Sie ihn sieben Minuten lang bei 500 g und vier Grad Celsius.Anschließend wird das Pellet in 500 Mikrolitern Faxpuffer pro 100 Millionen Zellen resuspendiert. Als nächstes setzen Sie die immunomagnetische Zelltrennsäule in den Separator ein und platzieren Sie ein 50-Milliliter-Sammelröhrchen unter dem Säulenauslass zum Auffangen des Durchflusses. Nachdem Sie die Säule mit einem Milliliter entgastem Faxpuffer gewaschen haben, ersetzen Sie das gebrauchte 15-Milliliter-Röhrchen durch ein neues.Pipettieren Sie jeweils hundert Millionen Zellen in 500 Mikroliter Puffer, damit die Zellsuspension die Säule passieren kann. Spülen Sie die Säule anschließend dreimal mit jeweils drei Millilitern entgastem Faxpuffer aus. Nach der Erfassung des Durchflusses wird die erste eluierte naive Lymphozytenfraktion als CD14-negative Zellfraktion markiert.Nehmen Sie die Säule aus dem Abscheider und legen Sie einen neuen sterilen 15-Milliliter-Schlauch für die Abwassersammlung unter die Säule. Geben Sie fünf Milliliter Faxpuffer in die Säule und drücken Sie ihn sofort mit dem Kolben durch. Sammeln und markieren Sie die zweite Durchfluss- oder die naive Monozytenfraktion als CD14-positive Zellfraktion.Fügen Sie den geernteten CD14-positiven Monozyten ein komplettes Nährmedium hinzu, um 1 Million Zellen pro Milliliter zu erhalten. Geben Sie als Nächstes einen Milliliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer sterilen 24-Well-Platte, bevor Sie jede Vertiefung mit 40 Mikrolitern des im Kit enthaltenen Zytokincocktails ergänzen. Übertragen Sie am zweiten Tag die Hälfte des Inhalts jeder Vertiefung mit einer Pipette in einzelne 1,5-Milliliter-Röhrchen.Nachdem Sie die 1,5-Milliliter-Röhrchen sieben Minuten lang bei 500 g zentrifugiert haben, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern frischem Nährmedium. Übertragen Sie 500 Mikroliter dieser resuspendierten Zellsuspension zurück in die entsprechenden Vertiefungen, so dass das Endvolumen in der Vertiefung einen Milliliter beträgt. Reichern Sie jede Vertiefung mit 20 Mikrolitern Zytokincocktail an.Um antigengepulste MoDCs zu erzeugen, fügen Sie einen Mikroliter pro Milliliter Tollwutvirusimpfstoff oder RV-Suspension zu einem Milliliter naiver MoDC-Kultur in der 24-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Halten Sie am siebten Tag die 24-Well-Platte mit den antigengepulsten MoDCs 10 Minuten lang auf Eis, bevor Sie einen Milliliter eiskaltes PBS pro Well hinzufügen und gründlich mischen. Übertragen Sie die Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen.Waschen Sie die Vertiefungen mit zwei Millilitern eiskaltem PBS. Sammeln Sie die verbleibenden Zellen in jeder Vertiefung und füllen Sie den gewaschenen Inhalt in die entsprechenden Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 g für sieben Minuten.Nach dem Verwerfen des Überstands wird das antigengepulste MoDCs-Zellpellet in einem vollständigen Nährmedium resuspendiert, um die Endkonzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter einzustellen. Für die MoDC-Lymphozyten-Kokultur werden die Vertiefungen einer sterilen 24-Well-Platte am siebten Tag des Antigenpulses mit einem Milliliter der naiven Lymphozytenzellsuspension und einem Milliliter antigengepulster oder nicht-antigengepulster MoDC-Suspension besiedelt. Nach zwei Tagen Inkubation wird jede Vertiefung mit 20 Nanogramm rekombinantem Interleukin-2 pro Milliliter ergänzt und die Inkubation für weitere 120 Stunden fortgesetzt.Übertragen Sie am 14. Tag einen Milliliter der Co-Kultur in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie das Röhrchen. Anschließend wird das Zellpellet mit einem Milliliter antigengepulsten oder nicht gepulsten MoDCs resuspendiert. Gut mischen und die Zellsuspensionen in die entsprechenden Vertiefungen überführen.Nach der Färbung der PBMCs und der naiven Lymphozyten und Monozyten auf der Zelloberfläche wird ein Milliliter der Zellsuspension mit einer Pipette in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Dann resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS und füllen Sie es in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Sammeln Sie auch die Restzellen und die entsprechenden Röhrchen mit einem Milliliter PBS.Geben Sie dann 10 Milliliter PBS in das 15-Milliliter-Röhrchen mit den Zellen und mischen Sie es durch Pipettieren. Nachdem Sie das Röhrchen sieben Minuten lang bei 850 g zentrifugiert haben, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig mit der Restsuspension, die nach dem Dekantieren des Überstands übrig bleibt. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden und versiegeln Sie die Wells, um ein Verschütten zu vermeiden.Sobald die Färbung abgeschlossen ist, führen Sie die Durchflusszytometeranalyse durch. Passen Sie in der Echtzeitvorschau den Schwellenwert für die Fluoreszenz an, einschließlich Spannung und Verstärkung sowie der Zellgröße, um schließlich Gates um die gewünschte Zellpopulation zu zeichnen und gleichzeitig zelluläre Trümmer auszuschließen. CD14-Zellfärbung und Durchflusszytometrie zeigten, dass die naive Monozytenfraktion zu 98% aus CD14-positiven Monozytenzellen bestand und funktionell zur Antigenaufnahme fähig war.Die naiven MoDCs, die phänotypisch durch die Untersuchung der Expression von MHC Klasse 2 und co-stimulatorischen CD86- und CD40-Zelloberflächenmarkern charakterisiert wurden, validierten die dendritischen Zellen oder den DC-ähnlichen Phänotyp. Während der MoDC-Lymphozyten-Kokultur am neunten Tag wurde eine morphologische Veränderung beobachtet, die eine Dendritenverlängerung im RV-Puls zu MoDCs zeigte. Im Vergleich zur nicht-gepulsten MoDC-Lymphozytenkultur konnte eine signifikante Erhöhung der Lymphozytenproliferation durch die Hochregulation der Ki67- und CD25-Aktivierungsmarker auf den CD4-positiven und CD8-positiven T-Zellen an Tag 16 in der gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur nachgewiesen werden.Die CD8-positiven T-Zellen aus den reifen RV-gepulsten MoDC-Co-Kulturen zeigten eine achtfache Hochregulation von Ki67 im Vergleich zur unspezifischen Gruppe. Die CD4-positiven Zellen in der gleichen Co-Kultur zeigten einen siebenfachen Anstieg von Ki67 im Vergleich zu Kontrollen, was die Fähigkeit von RV-geprimten MoDCs demonstriert, das RV-Antigen naiven Lymphozyten zu präsentieren und sie in vitro zu aktivieren. Die qPCR-Quantifizierung von Kokulturen zeigte in allen Kokulturen, die GAPDH als Kalibrator verwendeten, einen Anstieg der Interferon-gamma-Expression um mehr als 30 % und einen Anstieg der Ki67-Expression um mehr als 5 %.Eine signifikant höhere Konzentration von sezerniertem Interferon gamma wurde in der RV-gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur im Vergleich zur unspezifischen Behandlungsgruppe beobachtet. Führen Sie den Schichtungsschritt sehr langsam und vorsichtig durch und achten Sie darauf, dass das Blut auf das Lymphozyten-Isolationsmedium gelegt wird. Achten Sie besonders darauf, alle PBMCs zu sammeln, ohne zu viel Material von den anderen Schichten zu sammeln.Andere Methoden wie Durchflusszytometrie, ELISA und quantitative PCR können nach diesem Verfahren angewendet werden, um die Aktivierung von Immunmarkern zu bewerten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt einen von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zelle, MoDC-basierten Assay zur Messung der Immunogenität von kommerziell erhältlichen Impfstoffen. MoDC-Assays untersuchen dendritische Zellreaktionen auf Antigene, Krankheitserreger oder Behandlungen und können Einblicke in Immunreaktionen, Impfstoffentwicklung und Immuntherapieforschung geben.

Ein impfstoffgepulster In-vitro-Assay auf Basis dendritischer Zellen zur Induktion der Lymphozytenproliferation

Das am häufigsten verwendete Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von autologen dendritischen Zellen (DCs) zur Verwendung bei Tumor-Immuntherapie beschrieben. Das Verfahren nutzt IL-4 und GM-CSF zu DCs aus Monozyten differenzieren. Die unreifen DCs sind, um zu reifen und dann mit Antigenen beladen stimuliert, bevor sie zurück in den Patienten injiziert werden.

Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie

Langzeit-kultivierten Interferon-γ enzymgebundenen immunospot Assay wird als Maß der zentralen Speicher-Antworten verwendet, und korreliert mit Schutz antimykobakteriellen Impfstoff Antworten. Mit diesem Test werden die peripheren mononukleären Blutzellen mit mycobakteriellen Antigene und IL-2 für 14 Tage, so dass die Differenzierung und Expansion des zentralen Gedächtnis-T-Zellen stimuliert.

Anwendung von Langzeit kultiviert Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay zur Beurteilung Effektor und Gedächtnis-T-Zell-Antworten in Cattle

Hier zeigen wir, wie Monozyten durch magnetische Kügelchentrennung aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes nach Dichtegradientenzentrifugation von humanem antikoaguliertem Blut isoliert werden. Nach einer 5-tägigen Inkubation werden die menschlichen Monozyten in unreife dendritische Zellen differenziert und sind bereit für experimentelle Verfahren in einer nicht-klinischen Umgebung.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Eine neuartige Technik für schnelle Antigen-Anzeige auf eine bakterielle Oberfläche präsentiert, die Oberfläche Biotinylierungen, gefolgt von Exposition gegenüber Proteine des Interesses an Fusion mit Monomeren Avidin beinhaltet. Laden von BCG mit ausgewählten Antigene erfolgreich verbessert seine Immunogenität, was darauf hindeutet, dass Oberflächendekoration traditionelle gentechnische Ansätze ersetzen kann.

Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwickeln und tolerogene dendritischen Zellen (TolDCs) zu charakterisieren und deren immuntherapeutischen nutzen zu bewerten.

Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

Experimentelle Verfahren für die spätere Gewinnung von lymphatischen Gewebe, lymphatischen Dendritische Zelle Aktivierung testen werden nach der Behandlung eine immunstimulierende Nanomaterials beschrieben.

Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung

Wir beschreiben ein Protokoll für die chemische Konjugation des Modellantigens Ovalbumin zu einem endozytoserezeptorspezifischen Antikörper für das in vivo dendritische Zell-Targeting. Das Protokoll umfasst die Reinigung des Antikörpers, die chemische Konjugation des Antigens sowie die Reinigung des Konjugats und die Überprüfung der effizienten Konjugation.

Chemische Konjugation eines gereinigten DEC-205-gerichteten Antikörpers mit Protein in voller Länge für das Targeting von dendritischen Zellen der Maus in vitro und in vivo

Ein einzigartiges, umfassendes Protokoll zur Generierung von de-sialylierten humanen monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (mo-DCs) aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung einer Sialidase-Behandlung wird vorgestellt. Des Weiteren werden Methoden zur Beurteilung der phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von mo-DCs beschrieben und evaluiert, wie die Behandlung mit Sialidase das Reifungsniveau von mo-DCs verbessert.

Generierung von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen mit unterschiedlichen sialylierten Phänotypen

Wir beschreiben ein Verfahren zur Bewertung der Fähigkeit pharmakologischer Wirkstoffe, tolerogene dendritische Zellen aus naiven Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in vitro zu generieren und ihre Wirksamkeit durch autologe regulatorische T-Zell-Generierung zu validieren.

Eine einfache und effiziente Methode zum Testen immunmodulatorischer Wirkstoffe zur Erzeugung tolerogener dendritischer Zellen aus humanen CD14+ -Monozyten

Lernen Sie die Erzeugung und Anwendung von Rinder-Monozyten-dendritischen Zellen zur Bewertung der Impfstoffimmunogenität in vitro. Diese Methode schließt eine Lücke in der Tierimpfstoffforschung.

Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten

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