Aggregate Größenoptimierung in Mikrotiterplattenvertiefungen für Abhänge-basierte Herz Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Zuerst zentrifugieren Sie eine einzellige humane pluripotente Stammzelle oder HPSC-Suspension fünf Minuten lang bei 200-mal g. Nach der Zentrifugation wird das Waschmedium aspiriert und die Zellen im Aggregationsmedium mit einer Dichte von 1,2 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter wieder suspendiert. Als nächstes säen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung auf der vorbereiteten Mikrotiterplatte und verteilen Sie die Zellen gleichmäßig.

Um eine große Anzahl von Vertiefungen zu säen, wirbeln Sie die Zellsuspension regelmäßig vortexen, um ein Absetzen zu verhindern. Nach der Aussaat zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 200 mal g. Beobachten Sie die Platte nach dem Schleudern unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass sich die Zellen auf den Boden jeder Mikrovertiefung gedreht haben.

Inkubieren Sie die Platte dann 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem hypoxischen Inkubator mit 5 % C und zwei O und 2 %. Einen Tag nach der Aggregation untersuchen Sie die Aggregate unter dem Mikroskop. Im Vergleich zur Aggregation unmittelbar nach der Zentrifuge sollten sie intakt erscheinen und glatte Kanten aufweisen.

Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Mikrotiterplatte waagerecht halten und die Spitze einer P-1000-Mikropipette an die Oberfläche des Kulturmediums und an den Rand der Vertiefung legen. Entfernen Sie dann langsam das Medium und achten Sie darauf, die Aggregate am Boden der Mikrovertiefungen nicht zu stören. Nachdem Sie den Mediumspegel auf etwa ein bis zwei Millimeter von der texturierten Mikrowell-Oberfläche reduziert haben, kippen Sie die Platte langsam und saugen Sie das restliche Medium langsam aus der Vertiefung an.

Fügen Sie einen Millileter frisch zubereitetes, vorgewärmtes Induktionsmedium der ersten Stufe hinzu, indem Sie die Pipettenspitze gegen den Innenrand der Vertiefung halten und das Medium sehr langsam gegen die Innenwand der Vertiefung abgeben. Stellen Sie die Platte drei Tage lang unter hypoxischen Bedingungen wieder in den Inkubator. Verwenden Sie am vierten Tag eine serologische Fünf-Milliliter-Pipette, um die Aggregate aus jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte zu ernten.

Sammeln Sie bis zu 10 Vertiefungen mit Zuschlagstoffsuspension in einem konischen 15-Milliliter-Rohr. Lassen Sie die Aggregate 15 Minuten lang in einem hypoxischen Inkubator absetzen. Nachdem sich die Aggregate abgesetzt haben, aspirieren Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie die Aggregate erneut in zehn Millilitern vorgewärmtem Waschmedium, um die verbleibenden induktiven Zytokine zu entfernen.

Die Zuschlagstoffe werden zwei Minuten lang bei 50-mal g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und die pelletierten Zuschlagstoffe in einem vorgewärmten Induktionsmedium der zweiten Stufe wieder suspendiert. Übertragen Sie die Zuschlagstoffsuspension auf eine 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz von einem Milliliter pro Well.

Betrachten Sie die Aggregate unter dem Mikroskop als gleichmäßige, dichtzellige Cluster. Inkubieren Sie unter hypoxischen Bedingungen bis zum sechsten Tag. Am sechsten Tag werden wie bisher bis zu 10 Milliliter Zuschlagstoffe pro konischem 15-Milliliter-Rohr gepoolt.

Nachdem sich die Aggregate abgesetzt haben, aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Aggregate erneut in dem vorgewärmten Induktionsmedium der dritten Stufe. Verteilen Sie die Aggregate mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette in eine 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz von einem Milliliter pro Well. Führen Sie am 10. Tag der Kultur einen vollständigen Medienwechsel durch.

Am Tag 12 werden die Zellen für den Rest des Kulturzeitraums in normoxische Kulturbedingungen von 20 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid überführt. Nach 12 Tagen Differenzierung, was sechs Tagen im kardiologischen Induktionsstadium entspricht, wurden mittlere, heftige aggregierte Kontraktionen beobachtet. An Tag 17 sind 74,8 % der Zellen mittels Durchflusszytometrie positiv für kardiales Troponin T, wie aus dem gefüllten Teil des Histogramms hervorgeht.

Ebenfalls zu sehen sind Zellen, die nur mit dem Sekundärantikörper gefärbt wurden, dargestellt durch den ungefüllten Abschnitt des Histogramms. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Aggregate am vierten Tag gut zu waschen, um Spuren von Zytokinen zu entfernen, insbesondere von Activin-A, das die Differenzierung des Endoderms fördert, auf Kosten der kardialen Induktion. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die Kaltkultur von induktiven Zelltypen innerhalb des Aggregats, durchgeführt werden, um andere Fragen zu beantworten, z. B. wie die parakrine Signalübertragung aus benachbarten embryonalen Geweben die Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in die kardiale Linie beeinflusst.