Aggregate Größenoptimierung in Mikrotiterplattenvertiefungen für Abhänge-basierte Herz Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen
25. September 2016
Herkömmliche Verfahren Aufhängungsaggregat Cardiac Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sind geplagt mit Kultur Heterogenität bezüglich Aggregatgröße und Form zu initiieren. Hier beschreiben wir eine robuste Methode zur kardialen Differenzierung Mikrotitervertiefungen Verwendung Größe gesteuert erzeugen HPSC kultiviert Aggregate unter Herzfördernden Bedingungen.
Zuerst zentrifugieren Sie eine einzellige humane pluripotente Stammzelle oder HPSC-Suspension fünf Minuten lang bei 200-mal g. Nach der Zentrifugation wird das Waschmedium aspiriert und die Zellen im Aggregationsmedium mit einer Dichte von 1,2 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter wieder suspendiert. Als nächstes säen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung auf der vorbereiteten Mikrotiterplatte und verteilen Sie die Zellen gleichmäßig.
Um eine große Anzahl von Vertiefungen zu säen, wirbeln Sie die Zellsuspension regelmäßig vortexen, um ein Absetzen zu verhindern. Nach der Aussaat zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 200 mal g. Beobachten Sie die Platte nach dem Schleudern unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass sich die Zellen auf den Boden jeder Mikrovertiefung gedreht haben.
Inkubieren Sie die Platte dann 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem hypoxischen Inkubator mit 5 % C und zwei O und 2 %. Einen Tag nach der Aggregation untersuchen Sie die Aggregate unter dem Mikroskop. Im Vergleich zur Aggregation unmittelbar nach der Zentrifuge sollten sie intakt erscheinen und glatte Kanten aufweisen.
Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Mikrotiterplatte waagerecht halten und die Spitze einer P-1000-Mikropipette an die Oberfläche des Kulturmediums und an den Rand der Vertiefung legen. Entfernen Sie dann langsam das Medium und achten Sie darauf, die Aggregate am Boden der Mikrovertiefungen nicht zu stören. Nachdem Sie den Mediumspegel auf etwa ein bis zwei Millimeter von der texturierten Mikrowell-Oberfläche reduziert haben, kippen Sie die Platte langsam und saugen Sie das restliche Medium langsam aus der Vertiefung an.
Fügen Sie einen Millileter frisch zubereitetes, vorgewärmtes Induktionsmedium der ersten Stufe hinzu, indem Sie die Pipettenspitze gegen den Innenrand der Vertiefung halten und das Medium sehr langsam gegen die Innenwand der Vertiefung abgeben. Stellen Sie die Platte drei Tage lang unter hypoxischen Bedingungen wieder in den Inkubator. Verwenden Sie am vierten Tag eine serologische Fünf-Milliliter-Pipette, um die Aggregate aus jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte zu ernten.
Sammeln Sie bis zu 10 Vertiefungen mit Zuschlagstoffsuspension in einem konischen 15-Milliliter-Rohr. Lassen Sie die Aggregate 15 Minuten lang in einem hypoxischen Inkubator absetzen. Nachdem sich die Aggregate abgesetzt haben, aspirieren Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie die Aggregate erneut in zehn Millilitern vorgewärmtem Waschmedium, um die verbleibenden induktiven Zytokine zu entfernen.
Die Zuschlagstoffe werden zwei Minuten lang bei 50-mal g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und die pelletierten Zuschlagstoffe in einem vorgewärmten Induktionsmedium der zweiten Stufe wieder suspendiert. Übertragen Sie die Zuschlagstoffsuspension auf eine 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz von einem Milliliter pro Well.
Betrachten Sie die Aggregate unter dem Mikroskop als gleichmäßige, dichtzellige Cluster. Inkubieren Sie unter hypoxischen Bedingungen bis zum sechsten Tag. Am sechsten Tag werden wie bisher bis zu 10 Milliliter Zuschlagstoffe pro konischem 15-Milliliter-Rohr gepoolt.
Nachdem sich die Aggregate abgesetzt haben, aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Aggregate erneut in dem vorgewärmten Induktionsmedium der dritten Stufe. Verteilen Sie die Aggregate mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette in eine 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz von einem Milliliter pro Well. Führen Sie am 10. Tag der Kultur einen vollständigen Medienwechsel durch.
Am Tag 12 werden die Zellen für den Rest des Kulturzeitraums in normoxische Kulturbedingungen von 20 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid überführt. Nach 12 Tagen Differenzierung, was sechs Tagen im kardiologischen Induktionsstadium entspricht, wurden mittlere, heftige aggregierte Kontraktionen beobachtet. An Tag 17 sind 74,8 % der Zellen mittels Durchflusszytometrie positiv für kardiales Troponin T, wie aus dem gefüllten Teil des Histogramms hervorgeht.
Ebenfalls zu sehen sind Zellen, die nur mit dem Sekundärantikörper gefärbt wurden, dargestellt durch den ungefüllten Abschnitt des Histogramms. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Aggregate am vierten Tag gut zu waschen, um Spuren von Zytokinen zu entfernen, insbesondere von Activin-A, das die Differenzierung des Endoderms fördert, auf Kosten der kardialen Induktion. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die Kaltkultur von induktiven Zelltypen innerhalb des Aggregats, durchgeführt werden, um andere Fragen zu beantworten, z. B. wie die parakrine Signalübertragung aus benachbarten embryonalen Geweben die Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in die kardiale Linie beeinflusst.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine robuste Methode zur Herzdifferenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) unter Verwendung von Mikrotröpfchen zur Erzeugung größenkontrollierter Aggregate vor. Die Methode behebt Probleme der Kulturheterogenität, die mit herkömmlichen Techniken verbunden sind.
Wichtige Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellbiologie
- Kardiale Differenzierung
- Gewebetechnik
Hintergrund
- Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs) können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren, einschließlich Herzzellen.
- Konventionelle Methoden führen häufig zu Aggregaten unterschiedlicher Größe und Form, was die Differenzierungsergebnisse beeinträchtigt.
- Die Mikrotröchentechnologie bietet eine Lösung zur Erzeugung einheitlicher Aggregate.
- Herzdifferenzierungsfördernde Bedingungen sind entscheidend für eine effektive Differenzierung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Erzeugung von hPSC-Aggregaten mit kontrollierter Größe.
- Verbesserung der Konsistenz der kardialen Differenzierungsergebnisse.
- Erleichterung weiterer Forschung im Bereich des kardialen Gewebeengineerings.
Verwendete Methoden
- Zentrifugation einer hPSC-Suspension zur Aggregatbildung.
- Verwendung von Mikroplatten mit Vertiefungen zur Kontrolle der Aggregatgröße.
- Inkubation unter hypoxischen Bedingungen zur Förderung der kardialen Differenzierung.
- Stufenweise Mediumwechsel zur Induktion der Differenzierungsstadien.
Hauptergebnisse
- Es bildeten sich gleichmäßige Aggregate, die während des gesamten Differenzierungsprozesses erhalten blieben.
- Eine signifikante Expression von kardialem Troponin T wurde in differenzierten Zellen beobachtet.
- Die verbesserte Entfernung induktiver Zytokine förderte die Differenzierung in die kardiale Linie.
- Aggregatweite Kontraktionen wurden nach 12 Tagen der Differenzierung festgestellt.
Schlussfolgerungen
- Die Mikroplatten-Methode bietet einen zuverlässigen Ansatz für die kardiale Differenzierung von hPSCs.
- Durch größenkontrollierte Aggregate ergeben sich konsistentere Differenzierungsergebnisse.
- Diese Technik kann angewendet werden, um die kardiale Entwicklung und Krankheitsmodellierung weiter zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Kontrolle der Aggregatgröße bei der suspensionbasierten Herzdifferenzierung behebt einen zentralen Engpass in der Produktion von aus hPSCs abgeleiteten Kardiomyozyten: die Kulturgegensätzlichkeit, die zu variablen Ausbeuten führt. Durch die Erzwingung einer einheitlichen Aggregatbildung mittels Mikrotröchentechnologie verbessert dieses Verfahren die Vorhersagbarkeit der Differenzierungsergebnisse und unterstützt die Erzeugung skalierbarer und reproduzierbarer präklinischer Modelle. Dadurch stellt der Ansatz ein strategisches Werkzeug dar, um das Risiko der Hermlinien-Differenzierung in frühen Entdeckungs- und translationsmedizinischen Arbeitsabläufen zu verringern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung größenabhängiger Signalwege bei der Herzdifferenzierung und klärt die mechanistischen Treiber der Zelllinienspezifikation.
- Operativer Wert: Verringert die Variabilität bei der Aggregatbildung und verbessert die Reproduzierbarkeit über Experimente und Arbeitsgruppen hinweg.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Dosis-Wirkungs-Modellierung der Morphogenexposition, indem die Aggregatgeometrie als kontrollierte Variable standardisiert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Eignung: Erzeugt homogene Mikrogewebe, die für die bildbasierte Hochdurchsatzanalyse und die quantitativen zytometrischen Analysen von Kardiomyozyten geeignet sind.
- Skalierbarkeit: Das Mikrolochplattenformat ermöglicht die parallele Bearbeitung mehrerer Bedingungen oder genetischer Hintergründe für vergleichende Untersuchungen.
- Quantifizierbare Ergebnisse: Ermöglicht eine konsistente Messung von Zellen, die kardiales Troponin T exprimieren, als funktionellen Endpunkt für Studien zu Wirkstoffanwendungen oder genetischen Modifikationen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevante Systematik: Erzeugt skalierbare, homogene kardiale Aggregate zur Modellierung vererbter Kardiomyopathien oder arzneimittelinduzierter Kardialtoxizität.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Entdeckungsphase der Differenzierung mit der präklinischen Validierung, indem sie zellulares Material mit konsistenter Qualität von Charge zu Charge bereitstellt.
- Mechanistische Risikominimierung: Verringert störende Variablen durch Heterogenität der Aggregatgröße und erhöht so die Zuverlässigkeit von Phänotyp-zu-Genotyp-Zuordnungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein, indem sie eine standardisierte Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen (hPSC) ermöglicht, die in nachgeschaltete Anwendungen wie Krankheitsmodellierung, Sicherheitspharmakologie und die Bewertung von Kandidaten für die regenerative Medizin einfließt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zu biophysikalischen Signalen bei der Herzzelllinienspezifizierung durch präzise Kontrolle der Größe und Form von Aggregaten.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare Mikrogewebeanordnungen für das Screening von Substanzbibliotheken mit reduziertem Rauschen durch geringere Variabilität der Aggregation.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Durchflusszytometrie und bildbasierte Messungen (z. B. kardiales Troponin T) mit verbesserter Signaldetektion aufgrund der Populationshomogenität.
- Translationale Forschung: Stellt eine skalierbare Quelle von Kardiomyozyten für präklinische Funktionstests bereit, einschließlich Kontraktilität und Elektrophysiologie.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Mikrolochplatten können in verschiedenen Projekten und mit unterschiedlichen Zelllinien wiederverwendet werden und unterstützen so die Plattform-basierte Standardisierung von Stammzell-Differenzierungsabläufen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich der Differenzierungsergebnisse, indem biologisches Rauschen durch Variationen der Aggregatgröße minimiert wird.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Durchsatzleistung durch standardisierte, skalierbare Aggregatbildung.
- Strategischer Wert: Steigert die Sicherheit bei Go/No-Go-Entscheidungen in frühen kardialen Programmen, indem falsch-negative Ergebnisse aufgrund ineffizienter Differenzierung reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Ressourcenallokation basierend auf verlässlichen Metriken zum Kardiomyozyten-Ertrag.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur humaner pluripotenter Stammzellen (hPSC), im Umgang mit Aggregaten und in hypoxischen Inkubationssystemen.
- Setzt den Zugang zu Mikroplatten mit definierten Vertiefungsabmessungen und nicht-anziehenden Oberflächen voraus.
- Benötigt standardisierte Protokolle für den Mediumwechsel, um eine Störung der Aggregate während der Waschschritte zu vermeiden.
- Erfordert eine Validierung über verschiedene hPSC-Linien hinweg, um sicherzustellen, dass die Beziehung zwischen Aggregatgröße und Differenzierungseffizienz konsistent ist.
- Eingeschränkt durch den Bedarf an spezieller Ausrüstung (hypoxische Inkubatoren, nicht-anziehende Platten) sowie optimierten Zytokinwaschschritten, um eine unerwünschte Differenzierung zu verhindern.
