Name: Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung und Anwendung einer Mikrofluidik-Plattform zur effizienten Einzelzell-Isolierung und Kultur. Diese Methode minimiert Zellschäden durch sanften Fluss und Schwerkraft und ermöglicht Langzeitkulturen für Krebsforschung.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Health Research Institutes (03-A1, BNMP11-014) unterstützt.

Hinweis: Die Fotomasken-Designs für unsere Mikrofluidik-Vorrichtung Fertigung wurden gezeichnet von einem Computer Aided Design (CAD) Software. Die Entwürfe wurden dann verwendet, um Chrom Photomasken herzustellen Kommerzielle Dienst. Die PDMS - Geräte wurden unter Verwendung von weichen Lithographietechniken hergestellt. 11 1. Herstellung von Urformen von Lithography <ol><li> Vor dem photolithographischen Prozeß 12, verwenden , um die 4-Zoll - Siliziumwafer als Substrat und entwässern um die Wafer in einem konventionellen Ofen bei 120 ° C für 10 min. </li><li> Reinigen Sie die dehydriert Silizium-Wafern durch Sauerstoffplasmabehandlung bei 100 Watt für 30 Sekunden in einem Plasma-Reiniger. </li><li> Vorwärmen zwei Kochplatten bei 65 ° C und 95 ° C, jeweils für die nachfolgenden Backvorgang. </li><li> Mantel 5 g negativer Photoresist (PR) auf den gereinigten Siliziumwafer durch eine Schleuderbeschichtungsvorrichtung; Spin bei 1200 Umdrehungen pro Minute (SU-8 50) für 30 Sekunden die Mikrokanalschicht zu erzeugen. </li><li> Legen Sie die PRbeschichteten Wafers auf eine vorgeheizte Heizplatte bei 65 ° C für 12 min und übertragen sie für 33 min bei 95 ° C auf einen anderen vorgewärmte Heizplatte (100 &amp; mgr; m dicken Muster) einen weichen Bake-Verfahren durchzuführen. </li><li> Nach dem Backen, legen Sie die PR beschichteten Silizium-Wafer auf dem Halter eines halbautomatischen Mask Aligner und richten Sie sie auf eine 25.400 dpi Auflösung Transparenz Photomaske. </li><li> Setzen Sie den PR beschichteten Silizium - Wafers mit UV - Licht (365 nm) in einer Dosis von 500 mJ / cm 2 , um die PR - Muster auf dem Silizium - Wafer zu schaffen. </li><li> Entfernen Sie den Wafer von dem Ausrichter und legen Sie es auf einer Heizplatte für die Zeit nach dem Backen bei 95 ° C für 12 min. </li><li> Weichen Sie die Wafer in SU-8-Entwickler (Propylenglykolmonomethylether Acetat, PGMEA) -Lösung nicht vernetzten PR für 12 min zu waschen und sanft mit Stickstoffgas trocken die Ausrichtungsmarken zu belichten. </li><li> Wiederum Mantel 5 g negativen Photoresists auf den Wafern durch eine Schleuderbeschichtungsvorrichtung; Spin bei 700 Umdrehungen pro Minute (SU-8 100) für 30 Sekunden und 1200 Umdrehungen pro Minute (SU-8 10) 30 s für 300 &amp;# 181; m dicke Muster und 27 &amp; mgr; m dicken Muster jeweils die Mikrowell-Schicht zu machen. </li><li> Platzieren Sie den PR beschichtete Wafer auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 4 min und bei 95 ° C für 8 min (27 &amp; mgr; m tief capture-well layer); und bei 65 ° C für 40 min und bei 95 ° C für 110 min (bei 300 &amp; mgr; m tief Kultur-well layer). </li><li> Nach dem Abkühlen legen Sie die PR-beschichteten Silizium-Wafer auf dem Mask Aligner mit UV-Licht ausgestattet. </li><li> Setzen Sie den PR beschichteten Silizium - Wafer mit dem UV - Licht (365 nm) in einer Dosis von 250 mJ / cm 2 (27 &amp; mgr; m dicken Muster) und 700 mJ / cm 2 (300 &amp; mgr; m dicken Muster). </li><li> Backen Sie die Wafer bei 95 ° C für 5 min (27 &amp; mgr; m dicken Muster) und 30 min (300 &amp; mgr; m dicken Muster) sind. </li><li> Waschen Sie die nicht vernetzten PR durch die PGMEA für 6 min (27 &amp; mgr; m dicken Muster) und 25 min (300 &amp; mgr; m dicken Muster) ab, bzw., und dann trocknen Sie sie mit Stickstoffgas. </li><li> Messen Sie die Höhe der Muster-Funktionen aufder Wafer mit einem Scanning-Laser-Profilometer, indem der Wafer auf dem XY-Tisch eines abtastenden Laser-Profilometer platzieren. <ol><li> Stellen Sie die Brennebene deutlich das Muster zeigen, auf dem Wafer verfügt mit dem &quot;Kameraansicht&quot; Beobachtungsmodus unter einem 20X Objektiv. </li><li> Schalten Sie den Beobachtungsmodus von &quot;Kameraansicht&quot; auf &quot;Laser-Ansicht&quot;, und stellen Sie die oberen und unteren Positionen der Merkmale. </li><li> Stellen Sie den Messmodus, Bereich, Qualität und z-Pitch bis transparent (oben), 1 Zeile (1.024 x 1), mit hoher Genauigkeit und 0,5 &amp; mgr; m sind, und drücken Sie dann die Start unten, um die Messung zu beginnen. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von PDMS-Geräte für Einzelzell-Isolierung <ol><li> Vor PDMS Gießen, silanisieren die Urformen mit Trichlorsilan eine hydrophobe Oberfläche zu schaffen, die es leichter zu schälen die PDMS Repliken von den Urformen macht. <ol><li> Legen Sie die Urformen und einen Gewichtungs Schiffchen mit200 &amp; mgr; l von Trichlorsilan in einem Exsikkator und gelten Vakuum (-85 kPa) für 15 min. </li><li> Stoppen Sie das Vakuum und dann die Stammformen im Exsikkator verlassen für mindestens 1 Stunde die Urformen bei Raumtemperatur silanisieren. </li><li> Entfernen Sie die Urformen aus dem Exsikkator und platzieren Sie jede Master-Form in einer 10 cm Petrischale. </li></ol></li><li> Mischen Sie eine Gesamtmenge von 17,6 g PDMS-Polymer-Kit eine Basis und einen Härter in einem Verhältnis von 10: 1 enthält, und dann gießen Sie die PDMS auf die Urform in der Petrischale. </li><li> Legen Sie die Petrischale in einem Exsikkator und gelten Vakuum (-85 kPa) für 1 h Luftblasen in den PDMS zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Petrischale aus dem Exsikkator und legen Sie sie in einem herkömmlichen Ofen bei 65 ° C für 3-6 Stunden die PDMS zu heilen. </li><li> Entfernen des ausgehärteten PDMS Replikate aus den Stammformen und Punch zwei Löcher als Einlass und einen Auslass an den beiden Enden des Mikrokanals auf der capture-Well Array PDMS Replik durch eine Stanze mit einem Innendurchmesser von 0.75 mm für den fluidischen Kanal (2A). </li><li> Verwenden Sie Klebeband um die Oberfläche der PDMS-Repliken zu reinigen, und dann die PDMS-Repliken in einem Plasma-Reiniger für kurze Sauerstoffplasmabehandlung (100 Watt für 14 sec). </li><li> Entfernen Sie die PDMS-Repliken aus der Sauerstoffplasma-Maschine. </li><li> Richten Sie eine Top (mit den Capture-Mikrotitervertiefungen) und eine untere PDMS (mit den Kultur Mikrotiterstreifen) Replik von Hand unter einem Stereomikroskop und bringt sie in Kontakt. </li><li> Platzieren der ausgerichteten PDMS Replikate in einem Ofen bei 65 ° C für 24 h dauerhafte Verbindung zwischen den PDMS Repliken zu erreichen, um die endgültige Vorrichtung zu bilden. </li><li> Genießen Sie die PDMS-Gerät in einem deionisierten (DI) -Wasser gefüllten Behälter und stellen Sie den Behälter in einem Exsikkator unter Vakuum (-85 kPa) für 15 Minuten Luft aus dem Mikrokanal des PDMS-Gerät zu entfernen. </li><li> Legen Sie das DI-Wasser gefüllten PDMS-Gerät in einer Gewebekultur Haube und verwenden UV-Licht (Wellenlänge des Lichts: 254 nm) der Vorrichtung zu sterilisieren 30 min. </li><li> Ersetzen den DI-Wasser in der PDMS-Gerät mit einer 5% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS-Lösung und Inkubation für 30 min bei 37 ° C-Zellen zu verhindern, auf die Oberfläche PDMS kleben. Hinweis: Die BSA-Beschichtung kritisch ist die Übertragungseffizienz von isolierten Zellen von der Aufnahme-gut zu kultur gut zu verbessern. </li><li> Ersetzen Sie die 5% BSA-Lösung in der PDMS-Gerät mit sterilisiertem 1x PBS-Lösung. </li></ol> 3. Herstellung von Einzelzellsuspension <ol><li> Kultur neurale Stammzelle KT98 und menschliche Karzinomzell A549 und MDA-MB-435 wir in Petrischale in konventionellen Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit) Zellen für die PDMS Vorrichtungszelle Experiment vorzubereiten . </li><li> Entfernen und entsorgen Sie die verbrauchte Kulturmedium (DMEM Basismedium versorgt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Antibiotika) aus der Kulturschale mit Zellen auf 70 gewachsen - 80% Konfluenz. </li><li> Waschen Sie sich leicht die Zellen mit sterilisiertem PBS dreimal. &lt;/ Li&gt; <li> Entfernen und entsorgen Sie die PBS und 2 ml eines rekombinanten Enzymmischung mit proteolytischen, kollagenolytischer und DNase Aktivitäten (bitte die Materialliste für die detaillierte Informationen). </li><li> Inkubieren der Kulturschale bei Raumtemperatur für 5 min und dann auf die Kulturschale Abgriffzelle Ablösung zu erleichtern. </li><li> 4 ml sterilisiertem PBS Zellen zu dispergieren, und dann übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g für 3 Minuten und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren vorsichtig das Zellpellet in 1 ml sterilisiertem PBS und zählen Sie die Live - Zellzahl 13 den Standard Trypanblau Ausschlussverfahren. Hinweis: Dieser Aufwirbelung Schritt zur Herstellung von gut distanzierte Einzelzellsuspension kritisch ist es, die Einzelzellisolierung Effizienz zu verbessern. </li></ol> 4. Single-Zell-Isolierung und Geklonte Kultur <ol><li> Last 50 ul Zellsuspension in einer Konzentration von 2,2 bis 2,5 x10 <sup&gt; 6 Zellen / ml in den Mikrokanal des PDMS - Gerät über die Austrittsöffnung des Gerätes mit einer Handpipette. Hinweis: Die Zellsuspension Lade Pipette werden muss angehalten und an der ersten Stoppposition gehalten zu vermeiden Luftblasen in den Mikrokanal eingeführt wird. </li><li> Laden Sie weitere 50 ul Zellsuspension durch das Einlassloch gleichmäßig den gesamten Mikrokanal mit Zellen füllen. </li><li> Verschließen Sie die Austrittsöffnung mit einem Stopfen (3 mm lang, 1 mm Durchmesser geschnitten Nylon Angelschnur) um den Fluss zu vermeiden, induziert durch hydrostatischen Druck aus den Tröpfchen auf Eintritts- und Austrittslöcher. Hinweis: Die Stecker UV in einer Gewebekultur Haube sterilisiert waren vor der Verwendung. </li><li> Füllen Sie eine 1 ml sterile Spritze mit Kulturmedium nach oben, werfen Luftblasen aus es und setzte es auf eine Spritzenpumpe auf. </li><li> Schließen Sie das Medium geladen Spritze mit dem Einlassloch des PDMS-Gerät über einen 23 G stumpfe Nadel und einem Poly-tetrafluorethen (PTFE) Schläuche. </li><li> Ziehen Sie den Stecker aus der Steckdose Loch und alleow eine 2-Minuten Zeitintervall, damit die Zellen in die Single-Cell-Capture-Brunnen durch die Schwerkraft zu regeln. </li><li> Waschen der nicht erfaßten Zellen mit 300 &amp; mgr; l Kulturmedium mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 600 ul / min entfernt von der Spritzenpumpe angetrieben. </li><li> Warten für 2 min um das Gerät zu stabilisieren, und Abdichten der Eintritts- und Austrittsöffnungen mit Stopfen einen geschlossenen Kultursystem zu bilden. </li><li> Drehen Sie das Gerät mit der Hand die aufgenommenen Einzelzellen auf die Kultur Mikrotitervertiefungen zu übertragen. </li><li> Legen Sie die PDMS-Gerät in einem 100-mm-Gewebekulturschale, und dann werden 10 ml sterilisiertem PBS um das Gerät Kulturmedium Verdampfen aus dem Mikrokanal zu vermeiden. </li><li> Bewegen der Kulturschale mit einem herkömmlichen Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit) für klonale Kultur der einzelnen Zellen. </li></ol> 5. Kulturmedium Replenishment <ol><li> Nach 1 d der Kultur, ersetzen Sie das Kulturmedium in der PDMS-Gerät mit frischem Medium Zelle pr zu verbessernoliferation. </li><li> Platzieren zwei Tröpfchen von Kulturmedium auf der Oberseite des PDMS-Gerät in der Nähe der Eintritts- und Austrittsöffnungen Bereiche Einführen von Luftblasen in den Mikrokanal zu vermeiden, während der nächste Schritt durchgeführt wird. </li><li> Stanzen zwei Löcher von der Oberseite der PDMS Vorrichtung in der Nähe der beiden Enden des Mikrokanals als Einlass und einem Auslass für den Mikrokanal. Hinweis: Verwenden Sie nicht durch die ganze zwei Schichten des PDMS Gerät Punch; statt, Punsch nur durch die oberste Schicht des PDMS. </li><li> Schließen Sie eine 1-ml-Plastikspritze mit frischem Medium mit dem Einlass über eine 23 G stumpfe Nadel und PTFE-Schlauch. </li><li> Strom 120 &amp; mgr; l frisches Medium in das Gerät für 5 min das alte Medium zu ersetzen. </li><li> Legen Sie zwei Stecker den Ein- und Austrittslöcher abzudichten, und schicken Sie das Gerät an die Zellkultur-Inkubator. </li><li> Aktualisieren das Kulturmedium alle 2 d während der Dauer der Kultur durch die Verschlussstopfen zu entfernen, gefolgt von den Schritten von 5,4 bis 5,5 zu wiederholen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Mikrowell-basierten Gerätesysteme 6,14 wurden für die Einzelzell - Manipulation und Analyse, wie beispielsweise großflächige Einzelzelle verwendet und 6 einzigen hämatopoetischen Stammzellproliferation Trapping 15. Obwohl gut Größe, Anzahl und Form können für spezifische Anwendungen angepasst werden, die Einzelzellisolierung Effizienz wird immer gefährdet , wenn die Größe des Bohrlochs erhöht. 9,15 Um diese Einschränkung zu überwinden, Park et ...

Derzeit Einzelzellen einzeln in einem Kulturraum platziert wird üblicherweise durch Verwendung limitierende Verdünnung oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) erzielt. Für viele Laboratorien limitierende Verdünnung ist ein zweckmßiges Verfahren, da es nur eine Pipette und Gewebekulturplatten benötigt, die leicht verfügbar sind. In diesem Fall wird eine Zellsuspension zu einer geeigneten Zelldichte seriell verdünnt und dann in Kulturvertiefungen gegeben durch eine manuelle Pipette. Diese abgeteilten Einzelzellen werden dann für die Zellanalyse verwendet werden, wie genetische Heterogenität Screenen 1 und Koloniebildung 2. Jedoch ist dieses Verfahren mit niedrigem Durchsatz und arbeitsintensiv, ohne einen Roboterarm zur Unterstützung verwendet wird , weil die Poisson - Verteilung der Natur des Verfahrens limitierende Verdünnungseinzelzellereignisse bis zu einer maximalen Wahrscheinlichkeit von 37% 3 einschränkt. FACS-Maschinen mit einem integrierten Roboterarm kann die Begrenzung der Poisson-Verteilung zu überwinden, indem genau placing einer Einzelzelle in einer Kultur auch in einer Zeit 4. Die hohe mechanische Scherspannung jedoch (so senkte die Lebensfähigkeit der Zellen) 5 und Maschinenkauf und Betriebskosten haben seine Verwendung in vielen Labors beschränkt. Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, mikroskaligen Geräte wurden entwickelt , um sehr effizient einzelne Zellen in Mikrovertiefungen 6 laden. Jedoch bieten die Mikrotitervertiefungen nicht ausreichend Platz für die beladenen Zellen zu proliferieren, aufgrund der Notwendigkeit der Herstellung der Größe jedes der von einer einzigen Zelle schließen Mikrotiterplatten-Einzelzelllade Wahrscheinlichkeit zu maximieren. Als Kulturassays in vielen zellbasierten Anwendungen erforderlich sind (zB Klonogentest 7), größere Kavitäten (90 bis 650 &amp; mgr; m im Durchmesser oder in Seitenlänge) wurden ebenfalls verwendet worden , für längere Zellkulturen zu ermöglichen. Jedoch, wie das Grenzverdünnungsverfahren, sie besitzen auch eine niedrige einzelne Zelle Ladewirkungsgrade im Bereich von 10 -. 30% 89 Zuvor haben wir ein Hochdurchsatz - mikrofluidischen Plattform zu isolieren Einzelzellen in den einzelnen Kavitäten entwickelt und zeigen ihre Anwendung in klonogenen Assay der isolierten Zellen. Die Vorrichtung 10 mit poly-dimethylsiloxan (PDMS) hergestellt wurde, und weist zwei Sätze von Mikrovertiefungsarrays mit verschiedenen Mikrovertiefungsgrößen, was die Effizienz in dem Laden einer einzelnen Zelle in einer Mikrovertiefung, deren Größe wesentlich größer als die Zelle weitgehend verbessern. Bemerkenswert ist, ermöglicht diese &quot;dual-well&quot; -Konzept die Größe des Kulturbereich flexibel, ohne dass die Einzelzellen-Abscheidungseffizienz zu beeinflussen eingestellt werden, so dass es einfach, die Konstruktion der Vorrichtung zur Einstellung verschiedener Zelltypen und Anwendungen anzupassen. Diese hocheffiziente Methode sollte für die langfristige Zellkulturexperimente für die Zell Heterogenität Studien und monoklonale Zelllinie Einrichtung nützlich sein.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD-Software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Teile-Nr. 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Siliziumwafer&nbsp;</td><td>Eltech corperation SPE0039</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konventioneller Ofen</td><td>YEONG-SHIN Firma</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Bench-Top Plasmabehandlungssystem</td></tr><tr><td>SU-8 50 Negativ-Fotolack</td><td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 Negativ-Fotolack</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Synrex Co., GmbH.</td><td>SC-HMI 2" ~ 6"</td><td></td></tr> <tr><td>Heizplatte</td><td>YOTEC Firma</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak Aligner</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Entwickler</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Propylenglykolmonomethyletheracetat</td></tr><tr><td>Scanning-Laser-Profilometer</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorsilan</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Gefährlich. Korrosiv für die Atemwege, reagiert heftig mit Wasser.</td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Platzsparender Vakuum-Exsikkator 190&nbsp; mm weißer Boden</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS) Kit</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core Stanzer</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td><td>mit 0,75 mm Innendurchmesser</td></tr><tr><td>Ablösbares Klebeband</td><td>3M Company</td><td>Scotch Ablösbares Klebeband 811</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Bersing Technology</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Basalmedium</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotika</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamin-Penicillin-Streptomycin</td></tr><tr><td>Rekombinantes Enzymgemisch</td><td>Innovative Zelltechnologie</td><td>AM-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12(3) Zellmembranfarbstoff</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Wird als Zelltracker verwendet</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Harvard Gerät</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff Spritze (1 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>23 Gauge stumpfe Nadeln</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TD21</td><td></td></tr><tr><td>Schlauch aus Polytetrafluorethen (PTFE)</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>Innendurchmesser, 0,51&nbsp; Mm; Außendurchmesser, 0,82&nbsp; Mm</td></tr></tbody></table>

ein mikrofluidik-plattform für hochdurchsatz-einzelzell-isolierung und kultur

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Die Untersuchung der Heterogenität einzelner Zellen ist für viele biologische Fragen entscheidend, aber technisch schwierig. Daher besteht ein Bedarf an einer einfachen, aber dennoch hochdurchsatzstarken Methode, um Einzelzellkulturexperimente durchzuführen. Hier berichten wir über eine mikrofluidische Chip-basierte Strategie für die hocheffiziente Einzelzellisolierung (~77%) und demonstrieren ihre Fähigkeit, langfristige Einzelzellkulturen (bis zu 7 Tage) und zelluläre Heterogenitätsanalysen mit klonogenen Assays durchzuführen. Diese Anwendungen wurden mit KT98 neuralen Stammzellen der Maus und A549 und MDA-MB-435 menschlichen Krebszellen demonstriert. Eine hohe Effizienz der Einzelzellisolierung und eine langfristige Kulturfähigkeit werden durch die Verwendung von Mikrovertiefs unterschiedlicher Größe an der Ober- und Unterseite des mikrofluidischen Kanals erreicht. Das kleine Mikrotiter-Array ist für die präzise Isolierung von Einzelzellen ausgelegt, und das große Mikrotiter-Array wird für die klonale Einzelzellkultur im mikrofluidischen Chip verwendet. Diese mikrofluidische Plattform stellt einen attraktiven Ansatz für Einzelzellkulturanwendungen dar, da sie flexibel anpassbare Zellkulturräume für verschiedene Kulturstrategien bietet, ohne die Isolationseffizienz zu verringern.

Die mikrofluidische Plattform für Einzelzellisolierung und Kultur umfasst einen Mikrokanal (200 &amp; mgr; m in der Höhe) mit zwei Sätzen von Mikrovertiefungsanordnungen (2A). Die zwei Sätze von Mikrovertiefungsarrays werden als capture-Well (25 um Durchmesser und 27 um Tiefe) und Kultur-Well (285 &amp; mgr; m im Durchmesser und 300 &amp; mgr; m in der Tiefe) bezeichnet für die Einzelzell-Isolierung und Kultur sind und jeweils Capture-gut ist in der Mitte einer Kultur gu...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung einzelner Zellen mit einer mikrofluidischen Plattform, die ein neues Mikrotiter-Designkonzept verwendet, um eine hocheffiziente Einzelzellisolierung und eine langfristige klonale Kultur zu ermöglichen.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Herstellung und Anwendung eines mikrofluidischen Chips zu demonstrieren, der eine hochgradig effiziente Einzelzell-Isolierung und -Kultur ermöglicht. Diese Methode stellt ein nützliches Werkzeug für jeden Bereich dar, der von der Isolierung und Kultur einzelner Zellen profitieren kann. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie äußerst effizient einzelne Zellen in große Mikrotöpfe-Arrays einführt.Des Weiteren werden zur Bedienung des Geräts lediglich sanfter Fluss und die Schwerkraft genutzt, wodurch Zellschäden minimiert werden. Die Anwendung dieses Verfahrens zielt auf die abschließende Diagnose menschlicher Erkrankungen wie Krebs ab, bei denen die zelluläre Heterogenität die Zellreaktion beeinflusst. Wir entwickelten die Idee zur Etablierung dieser Methode, als wir eine Mikrloch-Zelllinie etablierten, da die Grenzverdünnungsmethode sehr zeitaufwendig und ineffizient war. Mittlerweile kann diese Methode Einblicke in die Einzelzellanalyse ermöglichen.Es kann auch auf andere Anwendungen angewendet werden, wie beispielsweise die Erfassung und zeitliche Beobachtung des Verlaufs und Verhaltens einzelner Zellen. Stellen Sie zunächst silanisierte Urformen sowohl für die Einzelzellisolationsschicht als auch für die Mikrowellkulturschicht her, und zwar mittels Standard-Photolithographie, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie für jede Urform 16 Gramm PDMS-Basis mit 1,6 Gramm eines Härtermittels in einem Einwegbecher und rühren Sie die Mischung, bis sie homogen ist.Danach die Urformen in 150 Millimeter große Petrischalen geben und die PDMS auf die Formen gießen. Die Petrischalen in einen Trocknungsschrank stellen und eine Stunde lang ein Vakuum anlegen, um Luftblasen aus der PDMS zu entfernen. Nach einer Stunde die Schalen aus dem Trocknungsschrank nehmen und für drei bis sechs Stunden in einen konventionellen Ofen bei 65 Grad Celsius stellen, um die PDMS aushärten zu lassen.Entfernen Sie dann die Schalen aus dem Ofen und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen. Sobald sie abgekühlt sind, lösen Sie das ausgehärtete PDMS-Erfassungs-Array und das Mikrotröpfchen-Kultur-Array von den Negativformen und schneiden die Bauteile mit einer Rasierklinge aus. Verwenden Sie anschließend einen 0,75-Millimeter-Lochstecher, um an jedem Ende des Mikrokanals in der Erfassungs-Array-Schicht jeweils ein Loch zu stanzen.Verwenden Sie Klebeband, um die spätere innere Oberfläche des Geräts zu reinigen, und legen Sie anschließend die einzelnen Schichten mit den inneren Oberflächen nach oben in einen Plasma-Reiniger für eine kurze Sauerstoff-Plasmabehandlung. Entfernen Sie danach die PDMS-Schichten aus dem Plasma-Reiniger und richten Sie mithilfe eines Stereomikroskops die oberen und unteren Schichten des Geräts aus und verbinden Sie sie. Stellen Sie das ausgerichtete Gerät 24 Stunden lang bei 65 Grad Celsius in einen Ofen, um eine dauerhafte Verbindung zwischen den PDMS-Schichten herzustellen.Als Nächstes das verbundene PDMS-Gerät in entionisiertes Wasser geben und den Behälter 15 Minuten lang im Vakuum des Exsikkators platzieren, um die Luft aus dem Mikrokanal des Geräts zu entfernen. Nachdem nun sämtliche Luft aus dem Gerät entfernt wurde, das PDMS-Gerät in eine Zellkulturhaube geben und die Oberfläche des Geräts 30 Minuten lang mit UV-Licht sterilisieren. Danach das entionisierte Wasser im Gerät durch 5 % Rinderserumalbumin in PBS ersetzen und das Gerät 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.Dies blockiert die Oberfläche und verbessert die Transfereffizienz isolierter Zellen von den Erfassungslöchern zu den Kulturlöchern. Nach 30 Minuten ersetzen Sie die Blockierungslösung im Gerät durch sterile PBS. Bereiten Sie eine Einzelzell-Suspension mit 2,5 Millionen Zellen pro Milliliter vor und befüllen Sie eine Pipette mit 50 Mikrolitern der Suspension.Überführen Sie anschließend die Zellen über das Auslassloch des Geräts in das Gerät. Geben Sie weitere 50 Mikroliter der Zellsuspension zu und überführen Sie diese über das Einlassloch in das Gerät, um den gesamten Mikrokanal gleichmäßig mit Zellen zu füllen. Verschließen Sie nach dem Befüllen das Auslassloch des Geräts mit einem sterilen Stopfen, der aus Nylon-Angelschnur mit einem Durchmesser von einem Millimeter hergestellt ist.Füllen Sie anschließend eine sterile Ein-Milliliter-Spritze mit Kulturmedium, entlassen Sie eventuelle restliche Luftblasen und setzen Sie sie in die Spritzenpumpe ein. Verbinden Sie eine stumpfe 23-Gauge-Nadel mit der Spritze und verwenden Sie Polytetrafluorethylen-Schlauch, um die Nadel mit dem Einlass des Geräts zu verbinden. Nachdem der Schlauch angeschlossen ist, entfernen Sie den Stopfen aus dem Auslassloch und warten Sie zwei Minuten, während sich die Zellen durch Schwerkraft in die Einzelzell-Einfangmulden absetzen.Als Nächstes die Spritzenpumpe auf 600 Mikroliter pro Minute einstellen. Den Auslassstopfen entfernen und die nicht gebundenen Zellen 30 Sekunden lang abwaschen. Zwei Minuten warten, bis sich der Druck stabilisiert hat.Entfernen Sie dann das Gefäß vom Eingang des Geräts und verschließen Sie sowohl die Einlass- als auch die Auslassöffnungen mit Stopfen, um ein geschlossenes Kultursystem zu bilden. Drehen Sie das Gerät nun manuell um, um die erfassten Einzelzellen auf die Kulturmikrogefäße auf der anderen Seite des Geräts zu übertragen. Stellen Sie danach das Gerät in eine 100 Millimeter große Zellkulturschale, geben Sie 10 Milliliter sterilisiertes PBS um das Gerät herum hinzu und stellen Sie die Schale in einen Inkubator.Um das Kulturmedium zu wechseln, geben Sie zunächst zwei Tropfen Kulturmedium auf die PDMS-Vorrichtung in der Nähe des Einlasses und des Auslasses, um die Bildung von Luftblasen im Mikrokanal zu vermeiden. Anschließend verwenden Sie einen 0,75-Millimeter-Biopsiestanzer, um zwei Löcher von der Oberseite der PDMS-Vorrichtung in der Nähe der Enden des Mikrokanals auszustanzen. Achten Sie darauf, nur durch die obere Schicht der Vorrichtung zu stanzen.Füllen Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Kunststoffspritze mit frischem, vorgewärmtem Medium und verbinden Sie sie mit dem neu angelegten Einlassanschluss unter Verwendung einer stumpfen 23-Gauge-Nadel und PTFE-Schlauch. Leiten Sie langsam etwa 120 Mikroliter frisches Medium über einen Zeitraum von fünf Minuten in das Gerät, um das alte Medium zu ersetzen. Verschließen Sie nach Beendigung des Vorgangs Ein- und Auslassanschlüsse mit zwei Stopfen und stellen Sie das Gerät zurück in den Zellkultur-Inkubator.Die Anzahl der Zellen, die in den Erfassungsgefäßen landen, liegt je nach Zelltyp zwischen etwa 68 % und 85 %. Außerdem enthalten die meisten Erfassungsgefäße für alle drei Zelltypen nur eine einzige Zelle. Nach der Übertragung der erfassten KT98-Zellen in die Kulturgefäße enthielten etwa 77 % der Gefäße nur eine einzelne Zelle, 16 % hatten keine Zellen, 6 % enthielten zwei Zellen und weniger als 1 % der Gefäße wiesen drei oder mehr Zellen auf.Über einen Zeitraum von sieben Tagen zeigten isolierte Einzelzellen heterogene Wachstumsmuster. Während sich einige Zellen vermehrten, taten andere dies nicht. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa 20 Minuten durchgeführt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese Hochdurchsatz-Einzelzellisolations- und endokrine Kulturplattform nutzen können, um die Produktivität Ihrer Einzelzell-Experimente zu steigern. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass keine Luftblasen in den Mikrokanal gelangen, und zu verhindern, dass sich die Zellen im Laufe der Zeit zusammenlagern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Mikrofluidik-basierte Hochdurchsatz-Sortierung von zirkulierenden Tumorzellen und Einzelzellsequenzierungstechnologie

Erfahren Sie die Herstellung und Anwendung einer Mikrofluidik-Plattform zur effizienten Einzelzell-Isolierung und Kultur. Diese Methode minimiert Zellschäden durch sanften Fluss und Schwerkraft und ermöglicht Langzeitkulturen für Krebsforschung.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

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