Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Herstellung und den Betrieb eines mikrofluidischen Chips zu demonstrieren, der eine hocheffiziente Einzelzellisolierung und -kultur ermöglicht. Diese Methode bietet ein nützliches Werkzeug für alle Bereiche, die von einer Einzelzellisolierung und -kultur profitieren würden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie beim Laden einzelner Zellen in große Mikrotiter-Arrays hocheffizient ist.

Darüber hinaus wird nur eine sanfte Strömung und die Schwerkraft für den Betrieb des Geräts verwendet, wodurch die Zellschädigung minimiert wird. Die Implikation dieser Technik richtet sich auf die Enddiagnose menschlicher Krankheiten wie Krebs, bei denen die zelluläre Heterogenität die Reaktion der Zelle beeinflusst, daher kamen wir auf die Idee, diese Methode zu entwickeln, als wir eine Mikrotiterzelllinie etablierten, da die Methode der Grenzverdünnung sehr zeitaufwändig und ineffizient war. Nun kann diese Methode einen Einblick in die Analyse einzelner Zellen geben.

Es kann auch auf andere Anwendungen angewendet werden, wie z. B. die Feststellung und den Zeitpunkt der Beobachtung des individuellen Zellverlaufs und -verhaltens. Zu Beginn stellen Sie silanisierte Master-Shapes sowohl für die Einzelzellisolationsschicht als auch für die Mikrotiterkulturschicht her, wobei Sie die Standard-Photolithographie verwenden, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie für jede Urform 16 Gramm PDMS-Basis mit 1,6 Gramm eines Härters in einem Einwegbecher und rühren Sie die Mischungen, bis sie sich vermischt haben.

Legen Sie dann die Masterformen in 150-Millimeter-Petrischalen und gießen Sie das PDMS auf die Formen. Legen Sie die Petrischalen in einen Exsikkator und vakuumieren Sie eine Stunde lang, um Luftblasen aus dem PDMS zu entfernen. Nach einer Stunde nehmen Sie das Geschirr aus dem Exsikkator und stellen Sie es für drei bis sechs Stunden bei 65 Grad Celsius in einen herkömmlichen Ofen, um das PDMS auszuhärten.

Nehmen Sie dann die Formen aus dem Ofen und lassen Sie sie auf Zimmertemperatur abkühlen. Nach dem Abkühlen schälen Sie das ausgehärtete PDMS-Capture-Well-Array und das Mikrotiterkultur-Array aus den Master-Formen und schneiden Sie die Geräte mit einer Rasierklinge aus. Erstellen Sie anschließend mit einer 0,75-Millimeter-Stanze ein Loch an jedem Ende des Mikrokanals auf der Capture-Well-Array-Schicht.

Reinigen Sie mit Klebeband die innere Oberfläche des Geräts, und legen Sie dann die einzelnen Schichten mit den Innenflächen nach oben in einen Plasmareiniger für eine kurze Sauerstoffplasmabehandlung. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die PDMS-Schichten aus dem Plasmareiniger und verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die obere und untere Schicht des Geräts auszurichten und zu verbinden. Stellen Sie das ausgerichtete Gerät für 24 Stunden bei 65 Grad Celsius in einen Ofen, um eine dauerhafte Verbindung zwischen den PDMS-Schichten herzustellen.

Legen Sie anschließend das geklebte PDMS-Gerät in entionisiertes Wasser und stellen Sie den Behälter 15 Minuten lang unter Vakuum in einen Exsikkator, um die Luft aus dem Mikrokanal des Geräts zu entfernen. Nachdem nun die gesamte Luft aus dem Gerät entfernt wurde, legen Sie das PDMS-Gerät in eine Gewebekulturhaube und sterilisieren Sie die Oberfläche des Geräts 30 Minuten lang mit UV-Licht. Ersetzen Sie anschließend das deionisierte Wasser im Gerät durch 5 % Rinderserumalbumin in PBS und inkubieren Sie das Gerät 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Dadurch wird die Oberfläche blockiert und die Transfereffizienz isolierter Zellen von den Capture-Wells zu den Kulturwells verbessert. Ersetzen Sie nach 30 Minuten die Blockierungslösung im Gerät durch steriles PBS. Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension mit 2,5 Millionen Zellen pro Milliliter vor und beladen Sie eine Pipette mit 50 Mikrolitern der Suspension.

Übertragen Sie dann die Zellen durch das Auslassloch des Geräts in das Gerät. Laden Sie weitere 50 Mikroliter der Zellsuspension und übertragen Sie sie durch das Einlassloch in das Gerät, um den gesamten Mikrokanal gleichmäßig mit Zellen zu füllen. Verwenden Sie nach dem Laden einen sterilen Stopfen aus Nylonschnur mit einem Durchmesser von einem Millimeter, um das Auslassloch des Geräts abzudichten.

Füllen Sie dann eine sterile Ein-Milliliter-Spritze mit Nährmedium, werfen Sie alle Restluftblasen aus und setzen Sie sie in die Spritzenpumpe ein. Schließen Sie eine stumpfe 23-Gauge-Nadel an die Spritze an und verwenden Sie einen Polytetrafluorethylenschlauch, um die Nadel mit dem Einlass des Geräts zu verbinden. Entfernen Sie nach dem Anschließen des Schlauchs den Stopfen aus dem Auslassloch und warten Sie zwei Minuten, während sich die Zellen durch die Schwerkraft in den einzelnen Zell-Capture-Wells absetzen.

Stellen Sie anschließend die Spritzenpumpe auf 600 Mikroliter pro Minute ein. Entfernen Sie den Stecker und waschen Sie die nicht eingefangenen Zellen 30 Sekunden lang weg. Warten Sie zwei Minuten, bis sich der Druck stabilisiert hat.

Entfernen Sie dann den Schlauch aus dem Einlass des Geräts und verschließen Sie sowohl die Einlass- als auch die Auslassöffnungen mit Stopfen, um ein geschlossenes Kultursystem zu bilden. Drehen Sie nun das Gerät von Hand um, um die eingefangenen Einzelzellen in die Kultur-Mikrovertiefungen auf der anderen Seite des Geräts zu übertragen. Legen Sie dann das Gerät in eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale, fügen Sie 10 Milliliter sterilisiertes PBS um das Gerät herum hinzu und stellen Sie die Schale in einen Inkubator.

Um das Kulturmedium auszutauschen, legen Sie zuerst zwei Tröpfchen Kulturmedium auf das PDMS-Gerät in der Nähe des Einlasses und des Auslasses, um das Einbringen von Luftblasen in den Mikrokanal zu vermeiden. Stanzen Sie dann mit einem 0,75-Millimeter-Biopsiestanzer zwei Löcher von der Oberseite des PDMS-Geräts in der Nähe der Enden des Mikrokanals. Achten Sie darauf, nur die oberste Schicht des Geräts zu durchschlagen.

Füllen Sie als Nächstes eine Ein-Milliliter-Kunststoffspritze mit frischem, vorgewärmtem Medium und verwenden Sie eine stumpfe 23-Gauge-Nadel und einen PTFE-Schlauch, um sie mit der neu geschaffenen Einlassöffnung zu verbinden. Lassen Sie etwa 120 Mikroliter frisches Medium über einen Zeitraum von fünf Minuten langsam in das Gerät fließen, um das alte Medium zu ersetzen. Wenn Sie fertig sind, verschließen Sie die Einlass- und Auslassöffnungen mit zwei Steckern und stellen Sie das Gerät wieder in den Zellkultur-Inkubator.

Die Anzahl der Zellen, die in den Capture-Wells landen, liegt je nach Zelltyp zwischen etwa 68 % und 85 %. Darüber hinaus enthalten die meisten Capture-Wells nur eine einzige Zelle für alle drei Zelltypen. Nach dem Transfer der gefangenen KT98-Zellen in die Kulturvertiefungen hatten etwa 77 % der Vertiefungen nur eine einzelne Zelle, 16 % hatten keine Zellen, 6 % hatten zwei Zellen und weniger als 1 % der Vertiefungen hatten drei oder mehr Zellen.

Im Laufe von sieben Tagen zeigten isolierte Einzelzellen heterogene Wachstumsmuster. Während sich einige der Zellen vermehrten, taten dies andere nicht. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 20 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese endokrine Kulturplattform für die Einzelzellisolierung mit hohem Durchsatz verwenden können, um die Produktivität Ihrer Einzelzellexperimente zu steigern. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass keine Luftblasen in den Mikrokanal gelangen und dass sich die Zellen im Laufe der Zeit nicht zusammenballen.