Ein Mimic des Tumor-Microenvironment: Eine einfache Methode für Enriched Zellpopulationen Generierung und Untersuchung der interzellulären Kommunikation
September 20th, 2016
Wir haben einen durchlässigen mikroporösen Membraneinsatz angepasst, um die Tumormikroumgebung (TME) nachzuahmen. Das Modell besteht aus einer gemischten Zellkultur, ermöglicht die vereinfachte Generierung hochangereicherter individueller Zellpopulationen ohne Verwendung von Fluoreszenzmarkierung oder Zellsortierung und ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Kommunikation innerhalb der TME unter Normal- oder Stressbedingungen.
Das übergeordnete Ziel dieses einfachen in vitro Kokulturmodells ist es, die Eigenschaften einer in vivo Tumormikroumgebung nachzuahmen, einzelne Zellpopulationen anzureichern und verschiedene Arten der interzellulären Kommunikation zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Krebs und Strahlenbiologie zu beantworten, insbesondere in Bezug auf die Faktoren, die der Entstehung von krebsassoziierten Fibroblasten und den Reaktionen auf Therapeutika zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Generierung einzelner Zellpopulationen aus einer gemischten Zellkultur ohne stressinduzierendes Fluoreszenz-Tagging oder Zellsortierung ermöglicht.
Beginnen Sie damit, die gewünschte Zellkultur zweimal mit fünf Millilitern PBS zu waschen. Nach der zweiten Wäsche lösen Sie die Zellen mit einem Milliliter Trypsin-EDTA bei Raumtemperatur für zwei Minuten bei Raumtemperatur ab. Dann wird die Reaktion mit neun Millilitern vollständigem Wachstumsmedium gestillt, wobei das Medium 10 Mal vorsichtig über die Oberfläche des Kolbens pipettiert wird, um die Zellen zu dissoziieren.
Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellen auf eine 2,5-fache Konzentration von 10 bis fünf Zellen pro Milliliter in frischem Medium und überführen Sie die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Schleudern Sie die Zellen durch Zentrifugation herunter und resuspendieren Sie das Pellet in frischem Wachstumsmedium, das mit 50 % fötalem Rinderserum in 2,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro 70 Mikroliter mittlerer Konzentration ergänzt wird. Als nächstes werden Einsätze mit der entsprechenden experimentellen Porengröße aus ihrer Verpackung in einzelne Vertiefungen einer Multi-Well-Schale übertragen und die Schale abgedeckt.
Halten Sie dann die Schüssel mit beiden Händen fest und drehen Sie die Schüssel vorsichtig um, bis die Einsatzböden nach oben zeigen. Den Boden der Form entfernen. Halten Sie mit einer sterilen Pinzette in einer Hand einen Einsatz an Ort und Stelle und saugen Sie mit der anderen Hand langsam 70 Mikroliter Zellen in eine Mikropipettenspitze ab.
Geben Sie dann die Zellen langsam über die Oberfläche der heutigen Oberseite des Einsatzes. Nachdem Sie jeden der Einsätze ausgesät haben, setzen Sie den Boden der Schale vorsichtig wieder auf und inkubieren Sie die umgedrehte Schale bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid mit Feuchtigkeit für 30 bis 45 Minuten. Am Ende der Inkubation wird die Schale in einer Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank vorsichtig so umgedreht, dass die Böden der Einsätze nun nach unten zeigen.
Tauchen Sie dann den Boden jedes Einsatzes langsam und vorsichtig in zwei Milliliter vorgewärmtes Vollmedium und stellen Sie die Schale wieder in den befeuchteten Inkubator. Ersetzen Sie nach 48 Stunden das Medium am Boden jeder Vertiefung durch zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium. Wenn das gesamte Medium aufgefrischt wurde, säen Sie 2,5 mal 10 bis die fünften Zellen der zweiten interessierenden Population in einem Milliliter frischem Medium auf die Oberseite der Einsätze und stellen Sie die Schale wieder in den Inkubator.
Ersetzen Sie 24, 48 und 96 Stunden später das Medium oben auf jeder Einlage durch einen Milliliter frisches, vollständiges Medium. Und das Medium am Boden jeder Vertiefung mit zwei Millilitern frischem Komplettmedium. Nach 120 Stunden Kokultur wird jeweils ein Einsatz in einzelne 35-Millimeter-Zellkulturschalen mit einem Milliliter PBS überführt.
Und waschen Sie die Unter- und Oberseite der Einsätze mit einem Milliliter PBS. Um die am Boden des Einsatzes gewachsenen Zellen zu sammeln, legen Sie die Einsätze mit der Unterseite nach unten in 200 Mikroliter Trypsin-EDTA bei Raumtemperatur. Nach zwei Minuten bei Raumtemperatur stoppen Sie die Reaktion mit 800 Mikrolitern vollständigem Wachstumsmedium.
Halten Sie dann den Einsatz in einem leichten Winkel, pipettieren Sie den Überstand 10 Mal vorsichtig über die Oberfläche der Zellen und sammeln Sie die Zellen in der Schale. Wenn alle Inserts entfernt wurden, resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von zweimal 10 bis zur fünften Zellen pro Milliliter Wachstumsmedium. Und geben Sie 250 Mikroliter Zellen auf sterile individuelle Glasdeckgläser.
Legen Sie die Deckgläser für eine Stunde in den befeuchteten Inkubator. Am Ende der Inkubation geben Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit laminarer Strömung vorsichtig zwei Milliliter vollständiges Wachstumsmedium in die Schale und inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid mit Feuchtigkeit für 48 Stunden. Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit PBS.
Nach der dritten Wäsche fixieren Sie die Zellen zehn Minuten lang bei Raumtemperatur in 4%igem Formaldehyd in PBS, gefolgt von fünf Wäschen mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung. Nach der letzten Wäsche permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,25 % Triton X-100, ergänzt mit 0,1 Saponin für fünf Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von einer einstündigen Inkubation in Blockierungslösung bei Raumtemperatur. Als nächstes markieren Sie die Proben mit dem primären Antikörper von Interesse in der Blocklösung bei vier Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Morgen wird der ungebundene Antikörper durch dreiminütiges Waschen in Waschlösung entfernt, gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur mit dem entsprechenden Sekundärantikörper in Blockierungslösung. Am Ende der Inkubation waschen Sie den ungebundenen Sekundärantikörper wie gerade gezeigt und montieren Sie die Deckgläser mit DAPI-haltigem Antifa-Einbettmedium auf die einzelnen Objektträger. Versiegeln Sie die Deckglaskanten mit klarem Nagellack.
Bilden Sie dann die Zellen unter 63-facher Ölvergrößerung an einem inversen Mikroskop ab, das mit einer externen Lichtquelle zur Fluoreszenzanregung ausgestattet ist. Dieses System ermöglicht es, zwei verschiedene Zellpopulationen auf beiden Seiten der porösen Membranen von Zellkultureinsätzen für mindestens 120 Stunden zu züchten, wobei eine Reinheit von mehr als 99 % in den Zellpopulationen auf beiden Seiten der Membran erhalten bleibt, wenn Einsätze mit 0,4 oder einem Mikrometer Poren verwendet werden. Inserts mit drei Mikrometern Poren sind jedoch groß genug, um den Zellen zu ermöglichen, durch die Membran zu wandern, wie in diesem Experiment mit einer GFP-positiven menschlichen Brustkrebszelllinie beobachtet.
0,4-Mikron-Poreninsertionen begrenzen auch die Bildung von funktionellen Gap Junctions zwischen den Zellkulturen auf beiden Seiten des Inserts und schränken die Kommunikation mit sezernierten Faktoren ein. Inserts mit einer und drei Mikrometern Poren ermöglichen jedoch die funktionelle Kopplung von Zellen durch die Gap Junctions, was durch die Übertragung der Fluoreszenzmarkierung über die Membran in diesen Kokulturen angezeigt wird. Wichtig ist, dass dieses System effektiv verwendet werden kann, um krebsassoziierte Fibroblasten aus normalen menschlichen diploiden Fibroblasten nach ihrer Kokultur mit Brustkrebszellen zu erzeugen, wie die verminderte Expression von Caveolin-1 auf den Fibroblasten zeigt, die mit den menschlichen Brustkrebszellen kokultiviert wurden.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, Einsätze mit einer Porengröße auszuwählen, die für die zu untersuchende Frage geeignet ist. Und die erste Zellpopulation auf der Unterseite des Einsatzes in Medium zu sehen, das ihre Anheftung erleichtert. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Immunblotting, in-situ-Immunfluoreszenz oder die meisten anderen zellbasierten Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu Veränderungen der Proteinexpression, Veränderungen der Invasion und Migration oder Unterschieden im Ansprechen auf Therapeutika zu beantworten.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsbiologie und Strahlenbiologie, um die Faktoren zu erforschen, die zur Entwicklung, zur Evolution der Tumormikroumgebung und in unserem Fall zur Ausbreitung der schädlichen Auswirkungen ionisierender Strahlung von Zielzellen mit Strahlung auf die umstehenden Zellen in der Nähe beitragen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine gemischtzellige Kokultur vorbereiten, die Kokultur aufrechterhalten und hochreine, angereicherte Zellpopulationen aus der Kokultur für die weitere Analyse ernten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellstämmen oder Zelllinien gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens die geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen und die entsprechenden Biosicherheitsvorschriften eingehalten werden sollten.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Überblick
Diese Studie präsentiert ein einfaches in-vitro-Cokulturmodell, das entwickelt wurde, um die Tumormikroumgebung (TME) nachzubilden. Das Modell ermöglicht die Anreicherung einzelner Zellpopulationen und erlaubt die Untersuchung der zellulären Kommunikation unter verschiedenen Bedingungen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Krebsbiologie
- Radiobiologie
- Zellkulturtechniken
Hintergrund
- Die Tumormikroumgebung spielt eine entscheidende Rolle bei der Krebsprogression.
- Das Verständnis der zellulären Kommunikation ist für therapeutische Fortschritte von entscheidender Bedeutung.
- Traditionelle Methoden beinhalten oft stressauslösende Techniken.
- Diese Studie zielt darauf ab, den Prozess der Untersuchung von Zellinteraktionen zu vereinfachen.
Ziel der Studie
- Nachbildung der in-vivo-Charakteristika der TME.
- Anreicherung einzelner Zellpopulationen aus gemischten Kulturen.
- Untersuchung der Modi der zellulären Kommunikation.
Verwendete Methoden
- Nutzung eines durchlässigen mikroporösen Membraneinsatzes.
- Gemischter Zellkulturansatz.
- Ablösung von Zellen mittels Trypsin-EDTA.
- Abbruch der Reaktion mit komplettem Wachstumsmedium.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Generierung angereicherter einzelner Zellpopulationen.
- Erleichterung der Untersuchung der zellulären Kommunikation.
- Reduzierung des mit fluoreszierenden Markierungen verbundenen Stresses.
- Einblicke in das Verhalten von krebsassoziierten Fibroblasten.
Schlussfolgerungen
- Das Modell ahmt die TME effektiv nach.
- Es bietet ein wertvolles Werkzeug für die Krebsforschung.
- Die Methode verbessert das Verständnis von Zellinteraktionen bei Krebs.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This in vitro tumor microenvironment model enables biopharma R&D teams to study early cancer-stroma interactions without perturbing cell physiology, supporting mechanistic de-risking in target validation. By generating highly enriched cancer-associated fibroblast populations and controlling intercellular communication modes, the method provides quantitative insights into stromal modulation of tumor behavior and therapeutic response. It addresses a critical gap in preclinical models by allowing isolation of viable, functional cell populations for downstream analysis, thereby improving predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by elucidating heterotypic signaling between carcinoma cells and stromal precursors.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of stromal targets without fluorescent tagging or cell sorting artifacts.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by identifying stromal mediators that influence cancer cell responses to therapeutic agents.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by maintaining physiologically relevant co-culture conditions over extended periods.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled pore-size selection that defines communication modes (secreted factors vs. gap-junction).
- Scalability: Enables platform reuse across multiple cancer-stroma pairings for consistent intercellular communication studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling early TME evolution using human breast carcinoma and normal diploid fibroblasts.
- Operational Value: Provides continuity from discovery to preclinical validation by yielding harvestable, high-purity cell populations for protein expression, migration, and drug response assays.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement criteria by quantifying stromal impact on tumor cell behavior under therapeutic pressure.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for stroma-modulating therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled co-culture of cancer and stromal cells to isolate communication-dependent phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via enriched cell populations suitable for immunoblotting, immunofluorescence, and functional assays after 120-hour co-culture.
- Analytics: Generates measurable readouts such as caveolin-1 downregulation in fibroblasts, enabling statistical comparison of stromal activation states.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing stromal cells that reflect in vivo-like activation states for drug response studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular platform adaptable to various cancer types and stromal lineages, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cancer-stroma signaling.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability through defined pore-size parameters and stress-free cell harvesting.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing stromal-mediated resistance or sensitivity early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their modulation by tumor-associated stroma.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell culture techniques and microporous membrane handling.
- Depends on access to multi-well dishes, cell culture inserts with defined pore sizes (0.4, 1, 3 μm), and standard incubation equipment.
- Necessitates cross-team standardization of co-culture duration, medium composition, and insert orientation for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to non-fibroblastic stromal cells or alternative cancer models.
- Limited by the inability to study direct cell migration unless using inserts with pore sizes ≥3 μm, as smaller pores restrict physical cell movement.
