Name: Etablierung von Single-Cell-basierten Kokulturen auf deterministischem Weg mit einem mikrofluidischen Chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von mikrofluidischen PDMS-Chips zur effizienten Einzelzell-Einfangung und dynamischen Beobachtung von Zell-Zell-Interaktionen in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht präzise Kokulturen für zellbiologische Studien.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (105-2628-E-400-001-MY2) und des Ph.D. Program in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University und National Health Research Institutes unterstützt.

1. Herstellung einer Waferform durch weiche Lithographie
HINWEIS: Maskenmusterdaten sind in unserer vorherigen Publikation14verfügbar.
<ol><li>Einen 4-Zoll-Siliziumwafer in einem 120 °C-Ofen für 15 min dehydrieren.</li>
	<li>Spin Coat 4 g SU-8 2 negative Photoresist auf einen 4-Zoll-Silizium-Wafer bei 1.000 U/min für 30 s, um eine 5 'm dicke Schicht (Schicht #1) zu schaffen.</li>
	<li>Weiche Backschicht #1 auf einer 65 °C-Kochplatte für 1 min und übertragen Sie die Schicht dann für 3 min auf eine 95 °C-Kochplatte #1.</li>
	<li>Kühle Schicht #1 raumtemperatur, legen Sie sie auf den Halter des halbautomatischen Maskenausrichters und richten Sie sie #1 verchromte Fotomaske (Capture-Site-Layer) aus.</li>
	<li>Schicht #1 mit 365 nm UV-Licht bei einer Dosis von 150 mJ/cm2aussetzen.</li>
	<li>Schicht #1 aus dem Aligner entfernen und auf einer 65 °C-Kochplatte für 1 min nachbacken. Schicht #1 1 min auf eine 95 °C-Kochplatte übertragen.</li>
	<li>Kühlschicht #1 Raumtemperatur. Tauchen Sie in eine Propylenglykol-Monomethyletheracetat-Lösung ein, um den unvernetzten Photoresist für 2 min wegzuwaschen. Sanft mit Stickstoffgas trocknen, um eine Schicht #1 Ausrichtungsmarkierung zu offenbaren.</li>
	<li>Bedecken Sie die Schicht #1 Ausrichtungsmarke mit einem Klebeband, drehen Sie die Schicht 4 g SU-8 10 negativer Photowiderstand auf die Schicht #1 bei 1.230 U/min für 30 s, um eine 25 m dicke Schicht #2 zu erzeugen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Band, weiche Backschicht #2 auf einer 65 °C Kochplatte für 3 min, und übertragen Sie dann Schicht #2 auf eine 95 °C Kochplatte für 7 min.</li>
	<li>Kühlen Sie die #2 auf Raumtemperatur, legen Sie die Schicht #2 auf den Halter des halbautomatischen Maskenausrichters und richten Sie die Schicht #2 verchromten Fotomaske (Bypass-Kanalschicht) auf die #1-Ausrichtungsmarkierung aus.</li>
	<li>Schicht #2 mit 365 nm UV-Licht bei einer Dosis von 200 mJ/cm2aussetzen.</li>
	<li>Schicht #2 aus dem Aligner entfernen und auf einer 65 °C-Kochplatte für 1 min nachbacken und Schicht #2 3 min auf eine 95 °C-Kochplatte übertragen.</li>
	<li>Kühlschicht #2 raumtemperatur und bedecken Sie die Schicht #1 Ausrichtungsmarke mit Klebeband. Spin Coat 4 g SU-8 2050 negativer Photowiderstand auf Schicht #2 bei 1.630 U/min für 30 s, um eine 100 m dicke Schicht #3 zu erzeugen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Band, weiche Backschicht #3 auf einer 65 °C Kochplatte für 5 min, und übertragen Sie dann Schicht #3 auf eine 95 °C Kochplatte für 20 min.</li>
	<li>Kühle Schicht #3 raumtemperatur, legen Sie schicht#3 auf den Halter des halbautomatischen Maskenausrichters und richten Sie die Schicht #3 verchromten Fotomaske (Kulturkammerschicht) auf die #1 Ausrichtungsmarkierung aus.</li>
	<li>Schicht #3 mit 365 nm UV-Licht bei einer Dosis von 240 mJ/cm2aussetzen.</li>
	<li>Schicht #3 aus dem Aligner entfernen und auf einer 65 °C-Kochplatte für 5 min nachbacken. Schicht #3 10 min auf eine 95 °C-Kochplatte übertragen.</li>
	<li>Kühlschicht #3 raumtemperatur. Tauchen Sie in eine Propylenglykolmonomethyletheracetatlösung ein, um den unvernetzten Photoresist 10 min lang wegzuwaschen und mit Stickstoffgas sanft zu trocknen.</li>
</ol>2. PDMS-Gerätevorbereitung für mehrere Einzelzellen-Erfassungen
<ol><li>Die Waferform und die Wägeschale mit 100 l Trichlorsilan in einen Trockenbaumittel legen (nur zur Silanisierung) und 15 min ein Vakuum (-85 kPa) auftragen. HINWEIS: Silanisieren Sie die Waferoberfläche mit Trichlorosilane, um hydrophobe Oberflächeneigenschaften vor PDMS-Gussso zu erzeugen, dass sie mühelos von der Wafer-PDMS-Form abgeschält werden kann.</li>
	<li>Stoppen Sie das Vakuum, und silanisieren Sie dann die Waferform im Trockenbau (nur zur Silanisierung) bei 37 °C für mindestens 1 h.</li>
	<li>Mischen Sie PDMS-Basis und PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 10:1. Gießen Sie insgesamt 20 g gemischtes PDMS in einer 15 cm Schale auf die Waferform.</li>
	<li>Die 15 cm große Schale in einen Trockentrockner geben und Vakuum (-85 kPa) für 1,5 min auftragen. Dann die 15 cm Schale aus dem Trockener ziehen. Halten Sie für 20 min bei Raumtemperatur. Schließlich entfernen Sie Restluftblasen in PDMS mit Stickstoffgas.</li>
	<li>Legen Sie die 15 cm Schale in einen Ofen bei 65 °C für 2-4 h, um PDMS auszuhärten.</li>
	<li>Entfernen Sie das PDMS-Replikat aus der Waferform, und stanzen Sie dann einen 1,5 mm-Einlass und einen 0,5 mm Auslass auf das PDMS mit einem Innendurchmesser von 1,5 mm und einem Stanzer mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm(Abbildung 1C).</li>
	<li>Reinigen Sie das PDMS-Replikat und die Gleitfläche mit abnehmbarem Klebeband und behandeln Sie die Oberfläche dann mit Sauerstoffplasma (100 W für 14 s).</li>
	<li>Richten Sie die PDMS-Replikate manuell an der Folie aus und bringen Sie sie miteinander in Kontakt.</li>
	<li>Legen Sie das PDMS-Dia 1 Tag lang in einen 65 °C-Ofen. HINWEIS: Eine dauerhafte Verbindung zwischen dem Dia und dem PDMS-Replikat wird erreicht, um das Gerät zu bilden.</li>
	<li>Tauchen Sie das PDMS-Gerät in einen mit Phosphat gepufferten Salzsäure gefüllten Behälter ein und legen Sie es in einen Trockenbau. Dann Vakuum (-85 kPa) für 15 min anwenden, um Luftblasen zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie das PDMS-Gerät in eine Zellkulturhaube und sterilisieren Sie das Gerät 30 min lang mit UV-Licht (Lichtwellenlänge: 254 nm).</li>
	<li>Ersetzen Sie den PDMS-Gerätepuffer durch Medium (DMEM-F12 Basalmedium mit 1% Antibiotikum und 10% fetalem Rinderserum) und inkubieren Sie das PDMS-Gerät bei 4 °C für 1 Tag. Dadurch wird verhindert, dass Zellen an der PDMS-Oberfläche haften.</li>
</ol>3. Herstellung einer einzelzelligen Suspension
HINWEIS: Zu den Zelltypen gehören menschliche lymphatische Endothelzellen (LECs), menschliche OSCC TW2.6-Zellen, die WNT5B-spezifische shRNA (WNT5B sh4) exdrücken, und Vektorkontrolle (pLKO-GFP), die aus unserer vorherigen Studie15gewonnen wurden. Detaillierte Anbauschritte finden Sie in unserer vorherigen Publikation.
<ol><li>Entfernen Sie das Kulturmedium, wenn die Zellen 70-80% Zusammenfluss erreichen. Dann waschen Sie die Zellen mit 5 ml sterilem PBS dreimal vorsichtig.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml DMEM-F12-Medium mit 1 M Fluoreszenzfarbstoff in WNT5B sh4 und pLKO-GFP-Zellen ein (verwenden Sie MV2-Medium für LECs) und inkubieren Sie die Zellen dann 30 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: LECs wurden mit grünem Chlormethylfluorescein-Diacetat (CMFDA) Farbstoff, WNT5B sh4-Zellen mit blauem 7-Amino-4-Chlormethylcoumarin (CMAC) Farbstoff und pLKO-GFP-Zellen mit rotem Dil-Fluoreszenzfarbstoff gefärbt.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 5 ml sterilem PBS dreimal.</li>
	<li>Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 2 ml von 0.25% Trypsin-EDTA (0.05% Trypsin-EDTA für LECs).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen für 4 min bei Raumtemperatur und tippen Sie dann vorsichtig auf die Gewebekulturschale, um die Zellablösung zu fördern.</li>
	<li>Fügen Sie 4 ml DMEM-F12 Medium hinzu, um WNT5B sh4 und pLKO-GFP-Zellen zu dispergieren (Für LECs verwenden Sie 3 ml MV2 Medium und 1 ml Trypsin-Neutralisatorlösung). Dann übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml Rohr, und Zentrifuge bei 300 x g für 3 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml DMEM-F12-Medium vorsichtig wieder auf. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen in einem Hämozytometer mit der standardmäßigen Trypan Blue-Ausschlussmethode16. Bereiten Sie 1 ml Zellsuspension bei 3 x 105 Zellen/ml Konzentration im DMEM-F12-Medium vor und halten Sie die Zellen dann auf Eis, um eine Zellaggregation zu verhindern. HINWEIS: Um die Effizienz der Einzelzellenerfassung zu verbessern, ist eine sorgfältige Vorbereitung der einzelzelligen Suspension mit gut dissoziierten Suspension erforderlich.</li>
</ol>4. Mehrfache einzellige Erfassung und dreifache Einzelzellkultur
<ol><li>Schließen Sie ein Polytetrafluorethen-Rohr (PTFE) zwischen dem Auslass des Geräts und der Spritzenpumpe an. Entfernen Sie das Medium, und fügen Sie dem Einlass des PDMS-Geräts 1 L Zellsuspension mit einer Konzentration von 3 x 105 Zellen/ml hinzu.</li>
	<li>Laden Sie die Zellsuspension mit einer Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 0,3 l/min in das Gerät(Abbildung 2A). Die Strömungsrichtung erfolgt vom Einlass zum Auslass. HINWEIS: Laden Sie sofort nach dem Hinzufügen der Zellsuspension in den Einlass, um eine Zellsedimentation zu verhindern.</li>
	<li>Fügen Sie nach Schritt 4.2 1 L DMEM-F12-Medium in den Einlass des PDMS-Geräts ein(Abbildung 2B). Die Strömungsrichtung floss vom Einlass zum Auslass.</li>
	<li>Mit einer Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 10 l/min(Abbildung 2C)wird 0,3 l DMEM-F12-Medium in das Gerät geladen. Die Strömungsrichtung floss vom Auslass zum Einlass.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.4, um andere Zelltypen in das Gerät zu laden.</li>
	<li>Nachdem Sie die Zellaufnahme abgeschlossen haben, verwenden Sie ein Mikroskop mit 4x Linse, um jede Kulturkammer abzubilden. HINWEIS: Die Fluoreszenzemissionen der Zellen wurden verwendet, um die Anzahl der einzelnen Zellen in jeder Kulturkammer zu identifizieren und zu zählen.</li>
	<li>Entfernen Sie das PTFE-Rohr und versiegeln Sie den Einlass und den Auslass mit Polyolefinband, um ein geschlossenes Kultursystem zu schaffen.</li>
	<li>Verschieben Sie das PDMS-Gerät auf eine 10 cm große Kulturschale und fügen Sie 10 ml sterile PBS um das PDMS-Gerät herum, um eine Verdunstung des Mediums vom Gerät zu vermeiden.</li>
	<li>Übertragen Sie das Kulturgericht in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit) für dreifache einzellige Kultur.</li>
	<li>Mikroskopisch beobachten und fotografieren Sie das Zellwachstum alle 12 h.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die interzellulären Wechselwirkungen verschiedener Zellen in der Tumormikroumgebung spielen eine wichtige Rolle bei der Progression des Tumors17. Um den Mechanismus der Zell-Zell-Wechselwirkungen zu verstehen, werden Co-Kultur-Systeme als gemeinsame analytische Methode verwendet. Mehrere Zelltypen und die Heterogenität der Zellen selbst haben jedoch zu experimenteller Komplexität und analytischen Schwierigkeiten geführt.
Der hydrodynamische Abschaltchip ermöglicht eine ...

Effiziente Erfassung verschiedener Typen von Einzelzellen und Bereitstellung von ausreichend Kulturraum sind für Einzelzell-Kokulturexperimente mehrerer Typen von Einzelzellenerforderlich 1. Die Begrenzung der Verdünnung ist aufgrund der geringen Kosten der erforderlichen Ausrüstung die am häufigsten verwendete Methode, um die einzelnen Zellen auf solche Experimente vorzubereiten. Aufgrund der Poisson-Verteilungsbeschränkung beträgt die maximale Einzelzellerfassungswahrscheinlichkeit jedoch nur 37 %, was die experimentelle Operation mühsam und zeitaufwändig macht2. Im Gegensatz dazu kann die Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) die Poisson-Verteilungsbeschränkung überwinden, um hocheffiziente Einzelzellen vorzubereiten3. FACS ist jedoch aufgrund teurer Instrumentierungs- und Wartungskosten für einige Laboratorien möglicherweise nicht zugänglich. Mikrofabrizierte Geräte wurden vor kurzem für Einzelzellen-Trapping4,Einzelzellen-Kopplung5und Einzelzellen-Kulturanwendungen entwickelt. Diese Geräte sind vorteilhaft aufgrund ihrer Fähigkeit, einzelne Zellen genau zu manipulieren6, durchführen Hochdurchsatzexperimente, oder reduzieren Proben- und Reagenzverbrauch. Die Durchführung einzelliger Kokulturexperimente mit mehreren Zelltypen mit den aktuellen mikrofluidischen Geräten ist jedoch immer noch eine Herausforderung, da die Poisson-Verteilung1,7,8oder die Unfähigkeit die Geräte, um mehr als zwei Arten von einzelnen Zellenzuerfassen 4,5,6,9,10.
Zum Beispiel berichteten Yoon et al. über ein mikrofluidisches Gerät für die Zell-Zell-Interaktionsstudie11. Dieses Gerät verwendet die probabilistische Methode, um Zellen in einer Kammer zu koppeln. Es kann jedoch nur die Kopplung von zwei verschiedenen Zelltypen aufgrund geometrischer Einschränkungen in der Gerätestruktur erreichen. Ein weiterer Bericht von Lee et al. zeigte eine deterministische Methode, einzelne Zellen zu erfassen und zu paaren12. Dieses Gerät erhöht die Kopplungseffizienz durch die deterministische Methode, ist jedoch durch die längere Betriebszeit begrenzt, die zum Koppeln von Zellen erforderlich ist. Insbesondere kann die zweite Zellaufnahme erst durchgeführt werden, nachdem die erste gefangene Zelle nach 24 h an die Oberfläche angeschlossen wurde. Zhao et al. berichteten von einem tropfenbasierten mikrofluidischen Gerät, um zwei Arten einer einzelnen Zelle zu erfassen13. Wir können feststellen, dass das tropfenbasierte mikrofluidische Gerät immer noch auf die Poisson-Verteilung beschränkt ist und nur auf nicht angeschlossenen Zellen verwendet werden kann, und es ist nicht möglich, die Kulturlösung während des Kultivierungsprozesses zu ändern.
Zuvor haben wir einen mikrofluidischen "hydrodynamischen Abschaltchip" entwickelt, der deterministische hydrodynamische Kräfte nutzt, um mehrere Arten von Einzelzellen in die Kulturkammer einzufangen und anschließend ein Zell-Kokulturexperiment durchführen kann, um individuelles Zellmigrationsverhalten unter Zell-Zell-Wechselwirkungen14. Der hydrodynamische Abschaltchip besteht aus einem arrayierten Einheitensatz, der jeweils einen Serpentin-By-Pass-Kanal, einen Capture-Site und eine Kulturkammer enthält. Durch die Verwendung des Differenzwiderstands zwischen dem Serpentin-Umgehungskanal und der Kulturkammer und einem speziell entwickelten Operationsverfahren können verschiedene Arten von Einzelzellen wiederholt in die Kulturkammer eingefangen werden. Insbesondere kann der große Raum der Kulturkammer nicht nur verhindern, dass die Zelle während der Zellaufnahme gespült wird, sondern auch genügend Raum für die Zellausbreitung, Vermehrung und Migration bieten, was die Beobachtung lebender einzelliger Wechselwirkungen ermöglicht. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Produktion dieses Geräts und detaillierte Protokollschritte.

<table><tbody><tr><td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td><td>3M Company</td><td>9795R</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotika</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamin-Penicillin-Streptomycin</td></tr><tr><td>AutoCAD Software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Teile-Nr. 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>CellTracke Blau CMAC Farbstoff</td><td>Invitrogen</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Grün CMFDA Farbstoff</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>Herkömmlicher Ofen</td><td>YEONG-SHIN Firma</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Platzsparender Vakuum-Exsikkator 190 mm weiße Basis</td></tr><tr><td>DiIC12(3) Zellmembranfarbstoff</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Wird als Zelltracker</td></tr><tr><td>verwendet DMEM-F12 Medium</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzellwachstumsmedium MV 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum Hyclone</td><td>Thermo</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 700 Serie Glasspritze ( 0,1 ml )</td><td>Hamilton</td><td>80630</td><td>100 & micro; L, Modell 710 RN SYR, Klein abnehmbar NDL, 22s ga, 2 Zoll, Spitzenausführung 2</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core Stanzer</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15075</td><td>mit 1,5 mm Innendurchmesser</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core Stanzer</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15071</td><td>mit 0,5mm Innendurchmesser</td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>YOTEC Firma</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak Aligner</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoffplasma</td><td>NORDSON MARCH</td><td>AP-300</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Tisch-Plasmabehandlungssystem</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS) Kit</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Polytetrafluorethen (PTFE)</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>Innendurchmesser, 0,51 mm; Außendurchmesser, 0,82 mm</td></tr><tr><td>Abnehmbares Band</td><td>3M Company</td><td>Scotch Abnehmbares Band 811</td><td></td></tr><tr><td>Siliziumwafer</td><td>Eltech corperation</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2" ~ 6"</td><td></td></tr> <tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 10 Negativ-Fotolack</td><td>MicroChem</td><td>Y131259</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2 Negativ-Fotolack</td><td>MicroChem</td><td>Y131240</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050 Negativ-Fotolack</td><td>MicroChem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Entwickler</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Propylenglykolmonomethyletheracetat</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Harvard Apparat 703007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichlorsilan</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Gefährlich. Korrosiv für die Atemwege, reagiert heftig mit Wasser.</td></tr><tr><td>Trypsin-Neutralisator-Lösung</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr></tbody></table>

etablierung von single-cell-basierten kokulturen auf deterministischem weg mit einem mikrofluidischen chip

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Zell-Co-Kultur-Assays wurden häufig für die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen verwendet, um die Biologie von Krankheiten einschließlich Krebs besser zu verstehen. Es ist jedoch schwierig, den komplexen Mechanismus interzellulärer Wechselwirkungen in hochheterogenen Zellpopulationen mithilfe konventioneller Kokultursysteme zu klären, da die Heterogenität der Zellsubpopulation durch die Durchschnittswerte verdeckt wird; die herkömmlichen Co-Kultur-Systeme können nur verwendet werden, um das Populationssignal zu beschreiben, sind aber nicht in der Lage, das Verhalten einzelner Zellen zu verfolgen. Darüber hinaus haben herkömmliche einzellige experimentelle Methoden aufgrund der Poisson-Verteilung eine geringe Effizienz bei der Zellmanipulation. Mikrogefertigte Geräte sind eine neue Technologie für Einzelzellstudien, da sie einzelne Zellen mit hohem Durchsatz genau manipulieren und den Proben- und Reagenzverbrauch reduzieren können. Hier beschreiben wir das Konzept und die Anwendung eines mikrofluidischen Chips für mehrere einzellige Kokulturen. Der Chip kann effizient mehrere Arten von Einzelzellen in einer Kulturkammer erfassen (ca. 46%) und verfügt über einen ausreichenden Kulturraum, der nützlich ist, um das Verhalten der Zellen (z. B. Migration, Proliferation usw.) unter Zell-Zell-Interaktion auf einzelzeller Ebene zu untersuchen. Lymphatische Endothelzellen und orales Plattenepithelkarzinom wurden verwendet, um ein einzelliges Kokulturexperiment auf der mikrofluidischen Plattform für live multiple Einzelzell-Interaktionsstudien durchzuführen.

Das Gerät hat eine dreilagige Struktur, wie das Querschnittsfoto eines geschnittenen PDMS-Geräts zeigt (Abbildung 1A). Die erste Schicht enthält eine Erfassungsstelle (6,0 m in der Breite und 4,6 m in der Höhe), die die Kulturkammer mit dem Umgehungskanal verbindet. Der Unterschied im Strömungswiderstand zwischen der Kulturkammer und dem Umgehungskanal bewirkt, dass die Zellen in die Erfassungsposition fließen und den Eingang des kleinen Pfad...

Dieser Bericht beschreibt eine mikrofluidische Chip-basierte Methode zum Einrichten eines Einzelzellkulturexperiments, bei dem eine hocheffiziente Kopplung und mikroskopische Analyse mehrerer Einzelzellen erreicht werden kann.

Etablierung von Single-Cell-basierten Kokulturen auf deterministischem Weg mit einem mikrofluidischen Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Es ist wichtig, die Erfassungseffizienz effektiv mit der dynamischen Beobachtung von Live-Zellenbildern zu kombinieren, um die Auswirkungen der Zell-Zell-Interaktion auf das Zellverhalten zu verstehen. Diese Röhre kann sehr effizient mehrere einzelne Zellen in einer größeren Kammer erfassen und eine ausreichende Kulturbasis für die dynamische Verfolgung mehrerer einzelliger Interaktionsverhalten eisern. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des PDMS-Geräts.Eine Waferform mit 100 Mikroliter Trichlorsilan in einen Trockenbau geben und 15 Minuten lang ein Vakuum auftragen. Stoppen Sie das Vakuum und versalzen Sie die Waferform im Trockenbau bei 37 Grad Celsius für mindestens eine Stunde. Mischen Sie die PDMS-Basis und das PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis von zehn zu eins, dann gießen Sie insgesamt 20 Gramm der Mischung in einer 15-Zentimeter-Schale auf die Waferform.Die 15-Zentimeter-Schale in einen Trockenbau geben und eineinhalb Minuten lang ein Vakuum auftragen. Dann entfernen Sie die Schale aus dem Trockenturm und beseitigen Restluftblasen im PDMS mit Stickstoffgas. Heilen Sie das PDMS, indem Sie die Schale zwei bis vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius in einen Ofen stellen.Entfernen Sie nach Fertigstellung das PDMS-Replikat aus der Waferform, und stanzen Sie einen 1,5-Millimeter-Einlass und einen 0,5-Millimeter-Auslass auf das PDMS. Reinigen Sie das PDMS-Replikat und die Folienoberfläche mit Wechselband. Behandeln Sie die Oberfläche mit Sauerstoffplasma.Richten Sie dann das PDMS-Replikat manuell an der Folie aus und bringen sie miteinander in Kontakt. Lassen Sie die PDMS-Folie einen Tag lang im 65-Grad-Celsius-Ofen. Tauchen Sie am nächsten Tag das PDMS-Gerät in einen mit PBS gefüllten Behälter ein.Legen Sie es in den Trockenheitor, und vakuumieren für 15 Minuten. Bewegen Sie das Gerät auf eine Zellkulturhaube und sterilisieren Sie es 30 Minuten lang mit UV-Licht. Ersetzen Sie den PDMS-Gerätepuffer durch Medium, und inkubieren Sie ihn einen Tag lang bei vier Grad Celsius.Wenn die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie es mit fünf MilliliterPBS dreimal. Fügen Sie den WNT5B sh4- und pLKO-GFP-Zellen einen Milliliter DMEM/F-12-Medium mit einem mikromollaren Fluoreszenzfarbstoff hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit fünf Millilitern sterilem PBS, entfernen Sie die PBS und fügen Sie zwei Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA hinzu.Inkubieren Sie die Zellen für vier Minuten bei Raumtemperatur, dann tippen Sie vorsichtig auf die Kulturschale, um die Zellablösung zu fördern. Fügen Sie vier Milliliter DMEM/F-12 Medium hinzu, um WNT5B sh4 und pLKO-GFP-Zellen zu dispergieren, die Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr zu übertragen und sie drei Minuten lang bei 300 xg zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet vorsichtig in einem Milliliter DMEM/F-12-Medium wieder auf.Bereiten Sie einen Milliliter Zellsuspension mit einer Konzentration von dreimal zehn bis fünf Promille pro Milliliter vor und halten Sie sie auf Eis, um eine Zellaggregation zu verhindern. Schließen Sie das Polytetrafluorethylen-Rohr zwischen dem Auslass des Geräts und der Spritzenpumpe an. Entfernen Sie das Medium, und fügen Sie einen Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension in den Einlass des PDMS-Geräts ein.Als nächstes laden Sie die Zellsuspension mit einer Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 0,3 Mikroliterpro Minute in das Gerät. Fügen Sie einen Mikroliter DMEM/F-12 Medium in den Einlass des Geräts ein, und laden Sie das Medium dann mit einer Spritzenpumpe in das Gerät. Laden Sie 0,3 Mikroliter DMEM/F12 Medium mit der Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 10 Mikroliterpro Minute in das Gerät.Nachdem die Zellen geladen wurden, entfernen Sie das Rohr und versiegeln Sie den Ein- und Auslass mit Polyolefinband, um ein geschlossenes Kultursystem zu erstellen. Bewegen Sie das PDMS-Gerät auf eine 10-Zentimeter-Kulturschale und fügen Sie 10 Milliliter sterile PBS um das Gerät herum, um eine Verdunstung des Mediums zu vermeiden. Übertragen Sie das Kulturgericht in einen Inkubator für eine dreifache Einzelzellenkultur.Das PDMS-Gerät verfügt über eine dreischichtige Struktur mit einer Erfassungsstelle, die mit der Kulturkammer und dem Bypasskanal verbunden ist. Der Unterschied im Strömungswiderstand zwischen der Kulturkammer und dem Bypasskanal ermöglicht es der Zelle, in die Erfassungsposition zu fließen, wodurch die folgende Zelle durch den Bypasskanal zum nächsten Erfassungsort gelangt. Der Refluxschritt wird verwendet, um die Zelle von der Aufnahmestelle zu befreien und in die Kulturkammer zu senden.Die Effizienz der Zellerfassung dieses Protokolls wurde anhand von drei verschiedenen Zelltypen bewertet. Menschliche lymphatische Endothelzellen oder LECs, humane plattenförmige Zellkarzinom T2.6-Zellen, die WNT5B-spezifische kurze Haarnadel-RNA exdrücken, und pLKO-GFP-Vektorkontrollzellen. Die Einzelzellerfassungseffizienz der drei nachgewiesenen Zellen betrug etwa 71 % für die LECs, 74 % für WNT5B sh4-Zellen und 78 % für die pLKO-GFP-Zellen.Die dreifache einzelzellige Erfassungseffizienz betrug 48%Diese Methode kann für mehrere einzellige Kokulturen von lymphatischen Endothelzellen und Plattenepithelzellen verwendet werden, und die Proliferation und Morphologie der Zelle kann unter dem Mikroskop beobachtet werden. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die vorbereiteten Zellsuspensionen minimale Zellaggregate haben, da Zellaggregate nicht nur die Effizienz der einzelnen Kopplung reduzieren, sondern auch die Mikrokanäle verstopfen können. Die Zell-Zell-Interaktion zwischen einzelnen Zellen spielt eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Zellverhaltens.Unsere Methode kann ein effizientes Werkzeug bieten, um Forschern dabei zu helfen, die Zell-Zell-Interaktion auf einer einzelnen Zellebene zu untersuchen, was zur Entdeckung neuer Mechanismen führen kann, die nicht ohne weiteres aus populationsbasierten Studien gewonnen werden können.

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Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

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Etablierung von Single-Cell-basierten Kokulturen auf deterministischem Weg mit einem mikrofluidischen Chip

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