Etablierung von Single-Cell-basierten Kokulturen auf deterministischem Weg mit einem mikrofluidischen Chip

Es ist wichtig, die Erfassungseffizienz effektiv mit der dynamischen Beobachtung von Live-Zellenbildern zu kombinieren, um die Auswirkungen der Zell-Zell-Interaktion auf das Zellverhalten zu verstehen. Diese Röhre kann sehr effizient mehrere einzelne Zellen in einer größeren Kammer erfassen und eine ausreichende Kulturbasis für die dynamische Verfolgung mehrerer einzelliger Interaktionsverhalten eisern. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des PDMS-Geräts.

Eine Waferform mit 100 Mikroliter Trichlorsilan in einen Trockenbau geben und 15 Minuten lang ein Vakuum auftragen. Stoppen Sie das Vakuum und versalzen Sie die Waferform im Trockenbau bei 37 Grad Celsius für mindestens eine Stunde. Mischen Sie die PDMS-Basis und das PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis von zehn zu eins, dann gießen Sie insgesamt 20 Gramm der Mischung in einer 15-Zentimeter-Schale auf die Waferform.

Die 15-Zentimeter-Schale in einen Trockenbau geben und eineinhalb Minuten lang ein Vakuum auftragen. Dann entfernen Sie die Schale aus dem Trockenturm und beseitigen Restluftblasen im PDMS mit Stickstoffgas. Heilen Sie das PDMS, indem Sie die Schale zwei bis vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius in einen Ofen stellen.

Entfernen Sie nach Fertigstellung das PDMS-Replikat aus der Waferform, und stanzen Sie einen 1,5-Millimeter-Einlass und einen 0,5-Millimeter-Auslass auf das PDMS. Reinigen Sie das PDMS-Replikat und die Folienoberfläche mit Wechselband. Behandeln Sie die Oberfläche mit Sauerstoffplasma.

Richten Sie dann das PDMS-Replikat manuell an der Folie aus und bringen sie miteinander in Kontakt. Lassen Sie die PDMS-Folie einen Tag lang im 65-Grad-Celsius-Ofen. Tauchen Sie am nächsten Tag das PDMS-Gerät in einen mit PBS gefüllten Behälter ein.

Legen Sie es in den Trockenheitor, und vakuumieren für 15 Minuten. Bewegen Sie das Gerät auf eine Zellkulturhaube und sterilisieren Sie es 30 Minuten lang mit UV-Licht. Ersetzen Sie den PDMS-Gerätepuffer durch Medium, und inkubieren Sie ihn einen Tag lang bei vier Grad Celsius.

Wenn die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie es mit fünf MilliliterPBS dreimal. Fügen Sie den WNT5B sh4- und pLKO-GFP-Zellen einen Milliliter DMEM/F-12-Medium mit einem mikromollaren Fluoreszenzfarbstoff hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit fünf Millilitern sterilem PBS, entfernen Sie die PBS und fügen Sie zwei Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen für vier Minuten bei Raumtemperatur, dann tippen Sie vorsichtig auf die Kulturschale, um die Zellablösung zu fördern. Fügen Sie vier Milliliter DMEM/F-12 Medium hinzu, um WNT5B sh4 und pLKO-GFP-Zellen zu dispergieren, die Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr zu übertragen und sie drei Minuten lang bei 300 xg zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet vorsichtig in einem Milliliter DMEM/F-12-Medium wieder auf.

Bereiten Sie einen Milliliter Zellsuspension mit einer Konzentration von dreimal zehn bis fünf Promille pro Milliliter vor und halten Sie sie auf Eis, um eine Zellaggregation zu verhindern. Schließen Sie das Polytetrafluorethylen-Rohr zwischen dem Auslass des Geräts und der Spritzenpumpe an. Entfernen Sie das Medium, und fügen Sie einen Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension in den Einlass des PDMS-Geräts ein.

Als nächstes laden Sie die Zellsuspension mit einer Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 0,3 Mikroliterpro Minute in das Gerät. Fügen Sie einen Mikroliter DMEM/F-12 Medium in den Einlass des Geräts ein, und laden Sie das Medium dann mit einer Spritzenpumpe in das Gerät. Laden Sie 0,3 Mikroliter DMEM/F12 Medium mit der Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 10 Mikroliterpro Minute in das Gerät.

Nachdem die Zellen geladen wurden, entfernen Sie das Rohr und versiegeln Sie den Ein- und Auslass mit Polyolefinband, um ein geschlossenes Kultursystem zu erstellen. Bewegen Sie das PDMS-Gerät auf eine 10-Zentimeter-Kulturschale und fügen Sie 10 Milliliter sterile PBS um das Gerät herum, um eine Verdunstung des Mediums zu vermeiden. Übertragen Sie das Kulturgericht in einen Inkubator für eine dreifache Einzelzellenkultur.

Das PDMS-Gerät verfügt über eine dreischichtige Struktur mit einer Erfassungsstelle, die mit der Kulturkammer und dem Bypasskanal verbunden ist. Der Unterschied im Strömungswiderstand zwischen der Kulturkammer und dem Bypasskanal ermöglicht es der Zelle, in die Erfassungsposition zu fließen, wodurch die folgende Zelle durch den Bypasskanal zum nächsten Erfassungsort gelangt. Der Refluxschritt wird verwendet, um die Zelle von der Aufnahmestelle zu befreien und in die Kulturkammer zu senden.

Die Effizienz der Zellerfassung dieses Protokolls wurde anhand von drei verschiedenen Zelltypen bewertet. Menschliche lymphatische Endothelzellen oder LECs, humane plattenförmige Zellkarzinom T2.6-Zellen, die WNT5B-spezifische kurze Haarnadel-RNA exdrücken, und pLKO-GFP-Vektorkontrollzellen. Die Einzelzellerfassungseffizienz der drei nachgewiesenen Zellen betrug etwa 71 % für die LECs, 74 % für WNT5B sh4-Zellen und 78 % für die pLKO-GFP-Zellen.

Die dreifache einzelzellige Erfassungseffizienz betrug 48%Diese Methode kann für mehrere einzellige Kokulturen von lymphatischen Endothelzellen und Plattenepithelzellen verwendet werden, und die Proliferation und Morphologie der Zelle kann unter dem Mikroskop beobachtet werden. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die vorbereiteten Zellsuspensionen minimale Zellaggregate haben, da Zellaggregate nicht nur die Effizienz der einzelnen Kopplung reduzieren, sondern auch die Mikrokanäle verstopfen können. Die Zell-Zell-Interaktion zwischen einzelnen Zellen spielt eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Zellverhaltens.

Unsere Methode kann ein effizientes Werkzeug bieten, um Forschern dabei zu helfen, die Zell-Zell-Interaktion auf einer einzelnen Zellebene zu untersuchen, was zur Entdeckung neuer Mechanismen führen kann, die nicht ohne weiteres aus populationsbasierten Studien gewonnen werden können.