Name: Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Lernen Sie die lichtvermittelte Bildung und biochemische Musterung von Hydrogelen für die 3D-Zellkultur. Diese Methode ermöglicht die kontrollierte Zellkapselung in synthetischen Matrizes für biomedizinische Forschung.

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Diese Arbeit wurde von den Delaware COBRE Programme in Drug Discovery und in Advanced Biomaterials von Institutional Development Awards vom National Institute of Medical Sciences Generäle an den National Institutes of Health (P20GM104316 und P30 GM110758-01, jeweils), die Pew Charitable Trusts finanziert unterstützt (00026178), ein National Science Foundation Career Award (DMR-1253906), die Burroughs Wellcome Fund (1.006.787) und der National Science Foundation IGERT SBE2 Programm an der University of Delaware (Stipendium für L. Sawicki). Die Autoren danken dem Delaware Biotechnology Institute BioImaging Center an der University of Delaware für die Ausbildung und den Zugang zu der konfokalen Mikroskopie, Frau Katherine Wiley für die Unterstützung während der Videoaufnahme, Mr. Matthew Rehmann für hMSCs isoliert aus Knochenmark, Prof. Christopher J großzügig Bereitstellung . Kloxin und Herr Stephen Ma für die großzügige Bereitstellung von Photomasken, und für die Verwendung des automatischen Plattenleser Prof. Wilfred Chen. </p&gt;

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier vorgestellte Verfahren zeigt Techniken, die von Thiol-En-Klick-Chemie gebildeten Zellen innerhalb von Hydrogelen photoencapsulate und photopattern anschließend die Gele mit biochemischen Signale. Die Verwendung von Licht, um anfänglich Hydrogele bilden können homogene Vermischung und Suspension der Zellen in der Polymerlösung vor der Polymerisation. Schnelle Polymerisation &quot;Sperren&quot; das Gel in der Form der definierten Form und kapselt Zellen innerhalb des Hydrogels Netzwerk suspendiert. Gele können auch in zahlreiche verschiedene Formen geformt werden (beispielsweise Glasobjektträger oder Spritzenspitzen) in Abhängigkeit von der gewünschten Endanwendung. Beispielsweise für die 3D-Kultur eingekapselten Zellen in Hydrogelen Glasobjektträger angebracht sind besonders nützlich für Bildgebungsanwendungen als Lichtdämpfung innerhalb einer dünnen Probe begrenzt ist. Spritzenformen können für eine schnelle Verkapselung von Zellen verwendet werden, so dass eine größere Anzahl von Proben in kurzer Zeit hergestellt werden (im Vergleich zu Glas-Objektträgers), die für die Experimente verwendet werden können, erfordern eine große Anzahl von Zellen wie Zytometrie oder qPCR fließen. Anschließend kann diese Gele dann mit biochemischen cues gemustert werden , um gewünschte zelluläre Antworten , wie beispielsweise Differenzierung oder Invasion hervorzurufen. 30,31 Assays für die Lebensfähigkeit und die Stoffwechselaktivität zeigen das Überleben von Zellen für das Materialsystem und Strukturieren Bedingungen dargestellt. Beachten Sie, dass die metabolische Aktivität bis zum Tag 3 in nicht abbaubare Gele (RGKGRK Peptid vernetzen) überwacht wurde, um die ersten Auswirkungen der Polymerisation und Musterbedingungen auf die Zellfunktion zu beurteilen. Zusätzlich wird ein Membranintegrität Test (Live / Dead Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Färbung) von hMSCs bei 1 und 6 Tage nach der Einkapselung in Gelen mit einem abbaubaren Peptid vernetzen formuliert (GPQGIWGQ) unterstützt, dass die Zellen lebensfähig bleiben und nach 1 Woche in Kultur zu verbreiten. Die Lebensfähigkeit von zusätzlichen Zelllinien wurde für Photopatterning Bedingungen 32 ähnlich denen berichtetverwendet hier und für das beschriebene Hydrogelsystem ausgewertet werden können Live / Dead-Färbung und die metabolische Aktivität Assays verwendet. Während wir Probleme mit der Lebensfähigkeit der Zellen nicht beobachtet haben, mit diesem Materialsystem und damit verbundene Verfahren (4.2 und 4.3), können einige Zelltypen zu radikalischem und / oder Lichteinwirkung empfindlich sein. In diesem Fall können Benutzer betrachten nicht-photoinitiierte Materialsysteme verwenden, wie beispielsweise Azid-Alkin, 12 FXIII, 31 oder Diels Alder-basierte Hydrogelbildung Chemien. 33 Facile Techniken Musterungs biochemischer Signale innerhalb Gelen zu detektieren und zu quantifizieren, ebenfalls dargestellt werden (3.1 und 3.2). Ellman-Assay ist von besonderem Interesse , weil die Reagenzien im Handel erhältlich und keine zusätzlichen Verarbeitungsschritte oder synthetischen teurer Reagenzien (beispielsweise fluoreszenzmarkierte Peptid) erforderlich sind. Ellman-Assay kann verwendet werden, um genau die Modifikation von freien Thiolen mit biochemischer Signale unter differe bestimmennt Photostrukturierungs Bedingungen sowie schnell Muster zu visualisieren. Für die Peptid Inkorporation Quantifizieren der Thiolfunktion Konzentration vor und nach der Musterbildung, als quantitatives Maß der Peptid Inkorporation wird direkt mit Ellman-Assay beurteilt. Während diese Art der Quantifizierungs mit fluoreszenzmarkierten Peptiden, 34 bildbasierte Quantifizierung erfordert zeitaufwendige Handhabung und Analyseschritte (beispielsweise die Synthese eines fluoreszenzmarkierten Peptids und die Erzeugung einer Kalibrierungskurve in Beziehung Fluoreszenz Peptidkonzentration durchgeführt werden Verwendung von Bildanalyse). Für die Bildgebung Peptid Einarbeitung kann Ellman-Reagenz direkt auf die Proben und sofort visualisiert angewendet werden. Während auf die x- und y-Ebenen für Modellvisualisierung beschränkt, kann die Technik als einfache Routineverfahren verwendet werden, um zu bestimmen, ob Matrizen freien Thiolgruppen strukturiert worden enthält. Es ist wichtig zu beachten, dass Ellman-Test nicht c istonsidered cytocompatible, also, während sie verwendet werden kann, zu beobachten und zu quantifizieren photopatterns, kann sie nicht in Gegenwart von Zellen durchgeführt werden. Zum Abbilden Strukturierung in drei Dimensionen und in Gegenwart von Zellen, bleibt die Konjugation von fluoreszierenden Peptide innerhalb Hydrogelmatrices ein leistungsfähiges und weit verbreiteter Ansatz. Auflösung der Muster kann in der x- ausgewertet werden, y- und z-Ebenen unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie, und dieses Verfahren ist cytocompatible so dass Zellen in strukturierten Bereichen oder nicht gemusterten Bereiche identifiziert werden kann. Zusammengenommen Ellman-Assay und Imaging-basierte Techniken sind ergänzende Instrumente für Forscher sowohl quantitativ zu beurteilen und qualitativ die Photopatterning biochemischer Signale innerhalb des Materialsystem. Photoclick oder breiter photoinitiiert, Chemien für die Bildung und Modifikation von Hydrogelen in Gegenwart von Zellen, sind zahlreich. Die Form, Kapselung und Strukturierungstechniken präsentiert werden, gehören nicht limITED zu dem Materialsystem beschrieben und können auf alternative lichtbasierte Chemien, wie Thiol-Alkin, 35 Azid-Alkin, 4 und andere Thiol-En - Chemien (beispielsweise Thiol-norbornen), 10,13 als auch angewendet werden , wie mit verschiedene Photoinitiatoren wie Irgacure 2959, Eosin Y und Campherchinon. Hinweis : Benutzer können müssen Prozedurparameter (zB Inkubationszeiten, Polymerisationszeiten, Zelldichte) anpassen , um sicherzustellen , dass die Bedingungen für diese anderen Systeme cytocompatible bleiben. Da der Strukturierungsprozess eine Diffusion des alloc-modifizierten Peptids (s) in das Hydrogel (2.2.3-2.2.5) erfordert, kann dieses Verfahren am nützlichsten für die Zugabe von Integrin-Bindungseinheiten (zB Peptide oder extrazelluläre Matrixprotein nachzuweisen Fragmente) an das Hydrogel, wo Befestigung des Liganden an das Netzwerk zur Erzeugung von Zugkräften durch die Zelle und Voll Integrin - Aktivierung erforderlich ist. 36 Note, für Biomoleküle , die möglicherweisewerden in ähnlicher Weise aktiv in Lösung oder auf Immobilisierung (zB Wachstumsfaktoren oder Zytokine), der Inkubationsschritt für Einheit Diffusion (~ 1 h) in das Hydrogel könnte dazu führen , Ereignisse zu signalisieren , die Strukturierung Ergebnisse Konvolut. Andere Verfahren wurden für die Wachstumsfaktor - Immobilisierung oder lokale Sequestrierung für ihre Strukturierung etabliert. 37-39 Zusätzlich Musterauflösung wird durch die Kontrolle über die Belichtung bestimmt. Hier Photomasken ermöglichen die Erzeugung von Mustern durch das Gel Tiefe und in der x- und y-Ebenen; jedoch größere räumliche Kontrolle über Musterungs biochemischer Signale innerhalb Gele können mit alternativen Verfahren zur Bestrahlung wie beispielsweise die Verwendung eines Zwei-Photonen - konfokalen Mikroskop erreicht werden , zu erzeugen Muster in der x-, y- und z- Ebene. 34,40 Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass, während das Materialsystem in diesem Verfahren verwendet nur anfänglich mit biochemischer Signale modifiziert wird, orthogonal Photoclick Chemien verwendet werden könnte alte zu ermöglichenRationen in Matrixeigenschaften über die Zeit. 12 Das Verfahren und Techniken , die hier vorgestellt für die Erstellung von synthetischen Matrizen mit gut definierten und raum - zeitlich-gesteuerte Eigenschaften Vielfalt an die aktuellen Konzepte. Insbesondere ist die kommerzielle Verfügbarkeit von Reagenzien und Materialien in diesem Verfahren verwendet wird, wird bei der Verwendung von Hydrogel-basierte Biomaterialien für Anwendungen in kontrollierten Zellkultur interessiert zu einer Vielzahl von Forschern nützlich sein.

Klicken Chemien sind in der Gestaltung von Materialien für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen zunehmend verwendet werden, einschließlich Arzneimittelabgabe, Tissue Engineering und kontrollierte Zellkultur aufgrund ihrer selektiven, effizient und oft cytocompatible Reaktivitäten. 1-3 Photoclick Chemien , die Licht verwenden , um auszulösen oder initiieren Reaktionen (beispielsweise Azid-Alkin, 4 Thiol-en, 5 und Tetrazol-Alken 6) sind von besonderem Interesse für die Bildung oder Modifikation von Biomaterialien. Schnelle Raten unter milden Bedingungen und Kontrolle , wann und wo sie stattfinden , mit Licht , diese Reaktionen machen gut geeignet für Anwender gerichtete Steuerung von Biomaterial Eigenschaften in Gegenwart von Zellen. 7,8 Insbesondere Thiol-En - Photoclick- Chemie verwendet wurden , zu erzeugen Hydrogel-basierte Biomaterialien mit robusten mechanischen Eigenschaften 5,9 und für die Einkapselung von einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich, aber nichtt begrenzt, humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs), Fibroblasten, Chondrozyten und Pankreaszellen mit Versprechen für die Zellkultur und Lieferung. 10,11 Ferner haben diese Chemien für die räumliche Musterung biochemischer Signale verwendet worden Schlüsselaspekte der nachzuahmen nativen Zellmikroumgebungen und entsprechende Zell-Matrix - Interaktionen erleichtern, einschließlich der Haftung, Differenzierung und Invasion. 3,12 Für den Bau von Thiol-En - Hydrogele mit Licht, Peptide Cysteine (Thiol) , die gemeinsam umgesetzt werden , mit funktionalisierten Polymeren mit Acrylaten oder Norbornene ( &#39;en&#39;) für eine schnelle, photoinitierte Polymerisation unter cytocompatible Bedingungen. 13 Der Ausbau dieser Toolbox haben wir versucht zu etablieren Verfahren zur Bildung von Hydrogelen mit neuen vielseitig und leicht zugängliche Bausteine, die eine minimale synthetische Verarbeitung erforderlich oder waren zu ihren breiten Einsatz als synthetische extrazelluläre Matrix im Handel erhältlich.14 Im einzelnen Peptide wurden modifiziert mit Allyloxycarbonyl (Alloc) -geschützten Lysine: eine für Anhänger, Integrin-bindenden Gruppen Zelladhäsion zu fördern [K (Alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] oder zwei für nicht abbaubare oder zell abbaubare Vernetzungen [K ( alloc) RGKGRKGK (alloc) G oder KK (alloc) GGPQGIWGQGK (alloc) K = Pep2Alloc jeweils]. Mit diesen Sequenzen wurden die Bedingungen für eine rasche Reaktion eingestellt (1-5 min) mit vierarmige thiol-modifizierten Poly (ethylenglycol) (PEG4SH) unter Verwendung cytocompatible Dosen von langwelligen UV - Licht (10 mW / cm 2 bei 365 nm) und der Photoinitiator Lithium-phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). Die resultierenden Hydrogele waren stabil unter Zellkulturbedingungen für Wochen. Um Zellgetriebenen Abbau und Umbau, ein enzymatisch spaltbare Peptid innerhalb der Gel - Vernetzungen eingebaut wurde (dh GPQGIWGQ), 15 und Modell Primärzelle, humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) blieb hoch rentabel nach der Verkapselung ermöglichen und during Kultur innerhalb dieser Matrizen. Ferner wurden Peptide räumlich innerhalb dieser Materialien strukturiert und hMSCs lebensfähig bleiben und metabolisch aktiv unter Photopatterning Bedingungen. Alternate pendant Peptidsequenzen, hier nicht dargestellt (zB IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc.), können ebenfalls in Matrices eingearbeitet werden , um weitere Zell - Wechselwirkungen mit der umgebenden Mikroumgebung zu sondieren. Diese Ergebnisse sind vielversprechend für die Anwendung dieser Hydrogel-basierten Materialien für die dreidimensionale (3D) Zellkultur und Lieferung zu studieren und direkten Zell-Matrix-Interaktionen für eine Vielzahl von Zelltypen. Hierin Zellen Methoden photoencapsulate und anschließend photopattern biochemische Signale innerhalb des Hydrogels System vorgeschlagen werden dargestellt (Abbildung 1). Techniken zu beobachten und zu quantifizieren , werden diese photopatterns auch gezeigt: vor allem, i) die quantitative und qualitative Verwendung von Assay Ellman&#39;schen die modifica zu bestimmention von freien Thiolen innerhalb gemusterten Substraten und ii) dem komplementären qualitative Verwendung fluoreszierender Peptide (AF488Pep1Alloc) , diese Muster in drei Dimensionen zu beobachten. Des weiteren Tests zur Rentabilität (Live / Dead Lebensfähigkeit / Zytotoxizität-Färbung) und die metabolische Aktivität bestimmen (MTS, 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-Tetrazolium) vorgestellt, so dass Benutzer die cytocompatibility von photoencapsulation und Photopatterning Bedingungen für verschiedene Zelllinien innerhalb Hydrogelmatrices bestimmen können. Während das Protokoll für eine facile lichtbasierten Photoclick Hydrogelsystem gezeigt wird, können die Techniken auf zahlreiche andere radikalisch initiierte Hydrogelsysteme für photoencapsulation und Photostrukturierungs in Gegenwart von Zellen angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Kundenspezifische Peptide</td><td>Verschiedene Anbieter</td>----<td>Peptide können auch über Standard-SPPS-Techniken mit Materialien von Anbietern wie ChemImpex und ChemPep synthetisiert werden.</td><td></td></tr><tr><td>4-armiges PEG Thiol, MW 20k</td><td>JenKem USA</td><td>4ARM-SH</td><td>Gelistet unter Mehrarmige homofunktionelle PEGs. PEG4SH kann auch wie zuvor referenziert synthetisiert werden.</td></tr><tr><td>Lithium-Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat</td><td>Colorado Photopolymer Solutions</td><td>Li-TPO</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylphenylphosphonit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470</td><td>Vorsicht, verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden. Tragen Sie Schutzhandschuhe, Kleidung und Augenschutz.</td></tr><tr><td>2,4,6-Trimethylbenzoylchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>682519</td><td>Vorsicht, verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden. Tragen Sie Schutzhandschuhe, Kleidung und Augenschutz.</td></tr><tr><td>Lithiumbromid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>2-Butanon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360473</td><td></td></tr><tr><td>Kolben, runder Boden, 100&nbsp; ml</td><td>Chemglass</td><td>CG-1506-05</td><td></td></tr><tr><td>80 ml Filtertrichter, Buchner, Medium Fritte</td><td>Chemglass</td><td>CG-1402-L-02</td><td>Auf Wunsch kann Filterpapier in einem normalen Glastrichter verwendet werden.</td></tr><tr><td>Magnetrührstäbchen</td><td>Verschiedene Hersteller</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer und Heizplatte</td><td>Verschiedene Hersteller</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumexsikatoren</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxid</td><td>Acros Organics</td><td>16630</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5%), kein Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Wählen Sie je nach Zelltyp das geeignete Medium und Trypsin.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>verschiedener Hersteller</td><td>----</td><td>Größen 1,5 oder 2 ml, steril.</td></tr><tr><td>BD Spritze mit Slip (Luer) Spitzen (ohne Nadel)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td>Die hier aufgeführte Artikelnummer gilt für eine 1 ml Spritze (16H), Es sind verschiedene Größen erhältlich (14-823-XX).</td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Plain Glass Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>hochreiner Silikonkautschuk, 0,010" dick, 6" x 8" Blatt, 55A Durometer (Dichtung)</td><td>McMaster Carr</td><td>87315K62</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>RainX, Original</td><td>Amazon</td><td></td><td>800002243 Kann bei anderen Händlern gekauft werden.</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>Photomasks</td><td>Advance Reproductions Corporation</td><td>----</td><td>Photomask Division, verschiedene Designs können nach Wunsch gedruckt werden.</td></tr><tr><td>DTNB; Ellman-Reagenz; 5,5-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PI-22582</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasig</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid, Pellets/zertifiziert ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Orthophosphorsäure</td><td>Alfa Aesar</td><td>33266</td><td></td></tr><tr><td>Cysteinhydrochlorid-Monohydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, für Säugetierzellen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 Wässriger Ein-Lösungs-Assay</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td>----</td><td>Geeignet für Geschwindigkeiten bei 90-110 x g.</td></tr><tr><td>Multiwell-Plattenleser</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td>----</td><td>Kann die Absorption bei 405 nm in einer 96-Well-Platte lesen.</td></tr><tr><td>Epifluoreszierendes oder konfokales Mikroskop</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td>----</td><td>Zur Visualisierung von Peptidmustern und Zellen in Hydrogelen.</td></tr><tr><td>Omnicure Exfo Series 2000</td><td>Excelitas Technologies</td><td>----</td><td>Alternative Lichtsysteme können zur Polymerisation von Hydrogelen verwendet werden.</td></tr><tr><td>Zeiss Zen Lite Software</td><td>Zeiss</td><td>----</td><td>Erhältlich ab zeiss.com; kompatibel mit Bildern, die mit Zeiss-Mikroskopen aufgenommen wurden</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td>----<td>Erhältlich bei imagej.nih.gov; anwendbar für die allgemeine Bildanalyse</td></tr></tbody></table>

licht-vermittelte bildung und musterung von hydrogelen für zellkulturanwendungen

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Klicken Chemien wurden für die Verwendung in zahlreichen Biomaterialien Anwendungen, einschließlich der Arzneimittelabgabe, Tissue Engineering und Zellkultur untersucht. Insbesondere Licht vermittelte Klick-Reaktionen, wie photoinitiierte Thiol-En und Thiol-Alkin-Reaktionen, leisten räumlich-zeitliche Kontrolle über Materialeigenschaften und die Konstruktion von Anlagen mit einem hohen Maß an Benutzer gerichtet Eigenschaft Kontrolle ermöglichen. Herstellung und Modifizierung der Hydrogel-basierte Biomaterialien die Präzision durch Licht und der Vielseitigkeit von diesen Thiol-X Photoclick Chemien angeboten lieferte verwenden, sind von wachsendem Interesse, insbesondere für die Kultur von Zellen in gut definierten, biomimetische Mikroumgebungen. Hier beschreiben wir Methoden zur photoencapsulation von Zellen und die anschließende Photopatterning biochemischer Signale innerhalb Hydrogelmatrices mit vielseitig und modularen Bausteinen polymerisiert durch eine Thiol-En-Photoclick-Reaktion. Insbesondere wird ein Ansatz für die Zusammenarbeit vorgestelltnstructing Hydrogele aus Allyloxycarbonyl (Alloc) -funktionalisierten Peptid Vernetzungen und anhängenden Peptideinheiten und Thiol-funktionalisierten Poly (ethylenglycol) (PEG), die in Gegenwart von Lithium acylphosphinate Photoinitiator und cytocompatible Dosen von langwelligen ultravioletten (UV) Licht rasch polymerisieren. Facile Techniken Photostrukturierungs zu visualisieren und die Konzentration von Peptiden hinzugefügt quantifizieren beschrieben. Darüber hinaus werden Methoden zur Einkapselung von Zellen etabliert, insbesondere humanen mesenchymalen Stammzellen und ihre Lebensfähigkeit und Aktivität zu bestimmen. Während die Bildung und die anfängliche Strukturierung von Thiol-alloc Hydrogele hier gezeigt sind, können diese Techniken allgemein auf eine Reihe von anderen Licht und radikalisch initiierte Materialsysteme gemusterten Substraten zu erzeugen (beispielsweise Thiol-norbornen, Thiol-acrylat) angewendet werden.

Die Einrichtung und Verfahren photoencapsulate Zellen und anschließend photopattern Gelen eingekapselten Zellen enthält , die in Abbildung 1 dargestellt ist, und ein Beispiel für die Stammlösungen Herstellung einer 10 Gew% Gel zu bilden , in Tabelle 1 bereitgestellt. Unter Verwendung der Tabelle 1, die Menge an Monomeren (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) und Photoinitiator (LAP) erforderlichen Hydrogele polymerisiert wird berechnet. Auf der Grundlage dieser Berechnungen wurden Stammlösungen von PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc und LAP hergestellt und gemischt mit und ohne Pep1Alloc zur Bildung und Photopatterning Gele, bzw. (1A). Anschließend werden die Zellen von den Platten, gezählt und zentrifugiert , in geeigneten Mengen für die Verkapselung (1B) gesammelt. Das Zellpellet wird in gelbildende Lösung (Peptid / Polymer / LAP in PBS), und die Zelle / Monomer-Mischungen werden auf Glas oder Spritze mol übertragen resuspendiertds. Die Zellen werden innerhalb des Hydrogels bei Anwendung von Licht (1-5 Minuten von 10 mW / cm 2 bei 365 nm) (1C) eingekapselt. Für Photostrukturierungs (1D) werden Gele mit Pep1Alloc und LAP für 30 min bis 1 h und 30 min, wodurch die Diffusion des Peptids und Initiator in die polymerisierte Matrix getränkt. Diese Peptid-beladenen Gele werden mit Photomasken mit gewünschten Mustern bedeckt und auf eine zweite Dosis von Licht ausgesetzt (1 min), die die Peptide auf freie Thiole in der Matrix zu konjugieren. Anhänger Anbindehaltung sind nur kovalent in Regionen an das Gel gebunden Licht ausgesetzt, entsprechende Zell-Matrix - Interaktionen zu erleichtern und imitiert wichtigsten mechanischen und biochemischen Eigenschaften der nativen Zelle Mikroumgebung in Richtung Zellfunktion und Schicksal in - vitro - Untersuchung. Ellman-Test bietet eine einfache und kostengünstige Methode Gel Modifikation und Peptid Einarbeitung innerhalb von photopatte zu quantifizierenrned Substrate. Gemusterte und nicht strukturierte Gele (dh Gele mit oder ohne Peptid - Modifikation) werden in Ellman-Reaktionspuffer nach der Polymerisation durchtränkt. Als nächstes Cystein - Standards , und die in Puffer getränkte Gele werden in 48-Well - Platten gegeben und mit Ellman-Reagens (2A, links) inkubiert. Nach 1 Stunde und 30 Minuten wurden Aliquots von Proben werden in einzelnen Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, und die Extinktion wird bei 405 nm aufgezeichnet. Eine Kalibrierungskurve (2A, rechts) von den Cystein - Standards aufgetragen (Absorption vs Konzentration, linear fit), und die Menge der freien Thiole in Gele können auf der Grundlage ihrer Verdünnungsfaktor bestimmt werden. Diese freien Thiol - Konzentrationen für verschiedene Polymerisation und Photostrukturierungs Bedingungen einer 10 Gew% igen Gels sind in 2B gezeigt. Gele polymerisiert 1 oder 5 min ohne Pep1Alloc (blaue Balken, I = 1 min und II = 5 min) haben statistisch ähnlich frei Thiolkonzentrationen, was darauf hinweist tHut eine schnelle Reaktion auftritt und Gelieren ist innerhalb von 1 min (two-tailed t-Test, p&gt; 0,05). Somit zusätzliche Belichtung (2-5 Minuten) nicht zu einer weiteren Umwandlung von funktionellen Gruppen. Gele polymerisiert für 1 min ohne Pep1Alloc wurden mit Pep1Alloc (3 mg / ml) und LAP (2,2 mM) für 30 und 90 min (grüne Balken, II = 30 min und IV = 90 min) und ausgesetzt auf eine zweite Dosis von Licht durchtränkt für 1 min. Die Abnahme der freien Thiole (60-80% in Bezug auf die 1 min Zustand) zeigt effiziente Modifizierung von Gelen mit anhänge cues unter diesen Bedingungen. Wenn höhere Änderung gewünscht wird, erhöhte Konzentrationen von Pep1Alloc Lösung kann in die Zugänglichkeit von Pep1Alloc zu freien Thiolen verwendet werden stärker verdünnten Peptidlösungen Umwandlung begrenzen können; So haben wir, dass Konzentrationen von bis zu 20 mg / ml Pep1Alloc produzieren&gt; 90% Umwandlung von freien Thiolen gefunden. Einzigartig ist, können Muster von Peptiden an das Hydrogel hinzugefügtwerden schnell mit Ellman-Reagenz (3A, unter 5 min) abgebildet. Jedoch Visualisierung des Musters wird im Laufe der Zeit verloren (größer als 5 min) durch Diffusion des gelben TNB 2- Dianion durch das Gel. Zur Abbildungsauflösung und beobachten Muster in drei Dimensionen (x-, y-, und z-Ebenen) und in Gegenwart von Zellen, fluoreszierenden Peptidaddition (AF488Pep1Alloc) verbessern, können verwendet werden. In 3B x-, y- und z sind-Projektionen von Bildstapeln mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen gezeigt, was zeigt Musterauflösung (&amp; mgr; m - Skala). Ungefähr (94 ± 2)% und (94 ± 1)% der hMSCs innerhalb abbaubare Gele eingekapselt (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) lebensfähig bleiben (grüne Zellkörper) 1 und 6 Tage nach der Verkapselung jeweils mit wenigen toten Zellen (rot Kerne ) beobachtet (4A). Ferner wird bei 6 Tage nach der Einkapselung beobachtet hMSC Spreizung ( <st<html> rong&gt; 4A, Einschub), was darauf hinweist , dass die Zellen mit Integrin-bindenden RGDS modifiziert mit diesen MMP-abbaubaren Matrizen umzubauen und zu interagieren. Metabolischer Aktivitätstests an Zellen in nicht abbaubaren Gelen gekapselt ausgeführt (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 und 3 Tage nach der Einkapselung (4B) ein zweites Maß für die Lebensfähigkeit der Zellen liefern und zeigen , dass Zellen aktiv bleiben für die verschiedenen photoencapsulation und Photostrukturierungs Bedingungen getestet mit Ellman-Test (2B). Insbesondere gibt es keinen signifikanten Unterschied in der metabolischen Aktivität zwischen 30 min und 90 min Inkubationen mit Pep1Alloc + LAP (Bedingungen III und IV) und die anfängliche Verkapselung (Bedingungen I und II), was darauf hinweist, dass das Verfahren für den Einsatz von Photostrukturierungs geeignet ist, in das Vorhandensein von verkapselten Zellen (t-Test, p&gt; 0,05 two-tailed). 2fig1.jpg &quot;/&gt; Abb . 1: Einrichtung für Zellen innerhalb von Hydrogelen und anschließend Photopatterning mit biochemischen Cue (A) Stammlösungen von Makromeren und Photoinitiator hergestellt und gemischt (PEG4SH = Rückgrat, Pep2Alloc = vernetzen, Pep1Alloc = Anhänger Kleberest (RGDS) einzuschliessen LAP = Photoinitiator ). (B) Die Zellen werden für die Verkapselung gesammelt. (C) Die Zellen werden mit Makromer Lösungen gemischt , ohne oder mit Integrin-bindenden Peptide (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP oder PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP bezeichnet) und sind bei der Einwirkung von Licht verkapselt. (D) Die Gele überschüssigen Thiolgruppen während der Gelbildung enthält (hier PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, gebildet mit 2 mM überschüssigem Thiol) mit einer einzigen Alloc - Gruppe (Pep1Alloc beispiels funktionalisierten mit biochemischer Signale durch die anschließende Zugabe von Peptiden strukturiert werden, RGDS, IKVAV, etc.) Zelladhäsion zu förderninnerhalb spezifischer Regionen des Gels. Hier Strukturierung von Gelen mit fluoreszenzmarkierten RGDS angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" /> Fig . 2: Quantitative Ellman-Assay - Einrichtung und Ergebnisse Modifikation von gemusterten Hydrogele zu bewerten (A) Gele und Cystein Standards werden in 48-Well - Platten mit Ellman-Reagenz inkubiert. Eine lineare Standardkurve aufgetragen Cysteinkonzentration in Gel-Proben zu bestimmen. (B) überschüssige freie Thiole werden innerhalb Hydrogele während der Gelbildung inkorporiert und verbraucht bei der Musterbildung mit einem Anhänger alloc-Peptid (I = 1 min Polymerisation; II = 5 min Polymerisation; III = 30 min Inkubation mit Pep1Alloc; IV = 90 min Inkubation wi<html> th Pep1Alloc; sowohl III und IV polymerisiert und mit Licht für 1 min gemustert). Die dargestellten Daten zeigen den Mittelwert (n = 3) mit Fehlerbalken den Standardfehler zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" /> Fig . 3: Ellman-Assay und Fluoreszenzbilder photostrukturierten Hydrogele zu visualisieren (A) Reagenz des Ellman kann schnell erkannt werden , Muster (Linien) in der x- und y-Ebenen (gelb = unstrukturierte Region, Maßstabsbalken = 1 mm). (; 200 &amp; mgr; m Maßstab; 10X Wasser-Tauchziel, Ex / Em 488/525 nm grün = gemusterten Region) (B) Fluoreszierende Peptide können in der x-, y- und z-Ebenen zu beobachten Muster verwendet werden.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" /> . Abbildung 4: Viability und die metabolische Aktivität von Zellen in nicht abbaubaren photostrukturiert Hydrogele (A) Beispiel konfokalen Z-Stapel (z-Projektion; 10X Wasser-Tauchziel) der lebensfähigen (grün; Ex / Em 488/525 nm) und tot hMSCs (rot; Ex / Em 543/580 nm) eingekapselt Hydrogele 24 Stunden nach der Verkapselung (Maßstabsbalken = 200 &amp; mgr; m). Die Zellen verteilt innerhalb dieser Hydrogele 6 Tage nach der Verkapselung (kleines Bild Bild, Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m). (B) Zellen sind metabolisch aktiv 1 und 3 Tage (dunkle und helle Stäbe, beziehungsweise) post-Verkapselung für die verschiedenen Polymerisation (I = 1 min Polymerisation; II = 5 min Polymerisation) und Musterbedingungen (III = 30 min Inkubation mit Pep1Alloc ; IV = 90 min incubation mit Pep1Alloc; beide polymerisiert und für 1 min mit Licht strukturiert). Die dargestellten Daten zeigen den Mittelwert (n = 3) mit Fehlerbalken den Standardfehler zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" /> Tabelle 1: Beispiel - Setup Volumen der Stammlösungen berechnen für Hydrogele Herstellung Zellen in der Tabelle , die blau markiert sind , zeigen benutzerdefinierte Parameter;. die übrigen Mengen werden auf der Grundlage dieser Einstellungen berechnet. Die endgültigen Volumen für jede Stammlösung ein Gel zu machen sind orange markiert. Die weißen Zellen enthalten Formeln verwendet, um die endgültige Volumen auf den benutzerdefinierten Parametern zu berechnen. Beachten Sie, dass eine Konzentration von 2,2 mM LAP bis 0,067 Gew% entspricht.

Wir beschreiben einen sequentiellen Prozess zur lichtvermittelten Bildung und anschließenden biochemischen Strukturierung von synthetischen Hydrogelmatrizen für dreidimensionale Zellkulturanwendungen. Die Konstruktion und Modifikation von Hydrogelen mit zytokompatibler Photoclick-Chemie wird demonstriert. Darüber hinaus werden einfache Techniken zur Quantifizierung und Beobachtung von Mustern und zur Bestimmung der Zellviabilität innerhalb dieser Hydrogele vorgestellt.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellen in synthetischen, polymerbasierten extrazellulären Matrizen zu bilden, zu strukturieren und einzuschließen. Diese Methode kann verwendet werden, um entscheidende biologische Fragestellungen bezüglich der Identifizierung extrazellulärer Signale zu bearbeiten, die Zellantworten in heterogenen Mikroumgebungen regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass eine stabile synthetische Matrix für die Zelleinschließung und -kultur mithilfe etablierter Protokolle und leicht zugänglicher Materialien erzeugt wird.Diese Methode kann für die kontrollierte Zellkultur und die Untersuchung der Zellantwort in vitro verwendet werden. Sie ist auf andere Systeme wie die Arzneimittelabgabe und das Gewebeengineering anwendbar. Bereiten Sie die Materialien für die Hydrogelbildung gemäß dem schriftlichen Protokoll vor.Befestigen Sie eine kollimierende Linse an der Endseite des flüssigkeitsgefüllten Lichtwellenleiters, um eine relativ gleichmäßige Lichtintensität über alle Proben zu gewährleisten. Stellen Sie den Abstand des Lichtwellenleiters zu den Proben so ein, dass eine Fleckgröße erzielt wird, die die betreffenden Proben abdeckt. Um nicht strukturierte Hydrogele herzustellen, bereiten Sie dicke Hydrogele vor, die in Spritzenkappen geformt werden, indem Sie 10 bis 20 Mikroliter der Gelvorläuferlösung in die Spitze einer sterilen abgeschnittenen Spritze pipettieren.Stellen Sie pro Spritze ein einzelnes Gel her, sodass es je nach Volumen und Spritzendurchmesser etwa 0,5 bis 1,5 Millimeter dick ist. Bereiten Sie dünne Hydrogels in Formen aus Objektträgern vor, indem Sie die Gummidichtung um die Ränder des nicht beschichteten Objektträgers legen. Geben Sie anschließend fünf bis zehn Mikroliter der Gelvorläuferlösung mittels Pipette auf den nicht beschichteten Objektträger.Und legen Sie den mit Antihaftbeschichtung versehenen Objektträger auf die Gel-Lösung. Sichern Sie die Objektträger mit kleinen Büroklammern, um sie zu stabilisieren. Stellen Sie die Lampenintensität so ein, dass am Gel-Oberfläche 10 Milliwatt pro Quadratzentimeter für Spritzenformen oder Objektträgerformen erreicht werden.Unter Verwendung eines Radiometers zur Intensitätsmessung. Stellen Sie die Formen unter die Lampe. Bestrahlen Sie sie ein bis fünf Minuten lang, um eine vollständige Polymerisation der Gele zu ermöglichen.Verwenden Sie eine kürzere Polymerisationszeit für Gele mit höherem Polyethylenterephthalat-Gehalt und eine längere Zeit für Gele mit niedrigerem Gehalt, um vollständig polymerisierte Hydrogele mit Moduln im Bereich weicher Gewebe herzustellen. Geben Sie die Gele aus den Spritzenformspitzen in eine sterile, unbehandelte 48-Well-Platte und legen Sie Glasobjektträger in eine sterile Schale.Um strukturierte Hydrogele herzustellen, bereiten Sie die Vorläuferlösung gemäß dem schriftlichen Protokoll vor und pipettieren Sie die Lösung kräftig, um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten. Danach bedecken Sie vorgeformte Gele mit Penton-Peptid mit einer Lithiumphosphat-Photoinitiator-Lösung und inkubieren eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation entfernen Sie die überschüssige Lösung.Wenn Gele in einer Spritzenkanüle geformt werden, mit einem Spatel vorsichtig aus der 48-Loch-Platte auf einen sterilen Objektträger zur Musterung übertragen. Eine Fotomaske mit dem gewünschten Muster direkt auf die Gele in Spritzenkanüle und auf dem Objektträger legen. Sicherstellen, dass der bedruckte Teil der Maske das Gel berührt, um eine optimale Mustergenauigkeit zu gewährleisten.Platzieren Sie die Proben unter der Lampe und bestrahlen Sie sie eine Minute lang. Nach der Musterung bringen Sie die mit der Spritze geformten Gele in eine sterile 48-Well-Platte mit Nicht-Gewebekultur-Behandlung. Platzieren Sie die auf Objektträgern haftenden, mit dem Objektträger geformten Gele in eine sterile Schale.Dreimal 15 Minuten mit Kulturmedium oder dem geeigneten Puffer entsprechend den geplanten Experimenten spülen. Um die Detektion und Quantifizierung freier Thiole in photomustergestalteten Hydrogelen durchzuführen, bereiten Sie zunächst die Lösungen vor und führen Sie die Berechnungen gemäß dem schriftlichen Protokoll durch. Dünne Hydrogele zur Mustergestaltung wie zuvor beschrieben herstellen.Stellen Sie speziell Gele mit überschüssigen freien Thiolgruppen her und mustern Sie die Hälfte dieser Proben mit dem Penton-Peptid, wobei ein durchsichtiger Deckel verwendet wird, um das gesamte Gel vollständig dem Licht auszusetzen. Legen Sie gemusterte und ungemusterte Gele in die Vertiefungen einer 48-Loch-Platte. Waschen Sie dreimal für jeweils 15 Minuten mit Ellman-Puffer, um die Diffusion der endständig reagierten Spezies aus dem Gel zu ermöglichen und eine Gleichgewichtsschwellung einzustellen.Fügen Sie zusätzliches Ellman-Reaktionspuffer zu den Spülgelen hinzu, sodass das geschwollene Gellvolumen mit dem Reaktionspuffer ein Vielfaches von 20 Mikrolitern beträgt. Wenn beispielsweise das vorhergesagte geschwollene Gellvolumen 15 Mikroliter beträgt, geben Sie fünf Mikroliter Reaktionspuffer hinzu. Und wenn das vorhergesagte geschwollene Gellvolumen 30 Mikroliter beträgt, fügen Sie 10 Mikroliter Reaktionspuffer hinzu.Pipettieren Sie die Cystein-Standards in Einzelmulden einer 48-Mulden-Platte in Vielfachen von 20 Mikrolitern. Die genaue Menge hängt vom Volumen des vorherigen Arbeitsschritts ab. Wenn beispielsweise im vorherigen Schritt das Volumen des aufgequollenen Gels zusammen mit zusätzlichem Reaktionspuffer 40 Mikroliter betrug, geben Sie 40 Mikroliter jedes Standards in separate leere Mulden.Als Nächstes verdünnen Sie das Reagenz von Ellman und den Reaktionspuffer. Geben Sie das verdünnte Reagenz von Ellman in die Vertiefungen mit den Standards und Proben. Für 20-Mikroliter-Proben fügen Sie 183,6 Mikroliter der Lösung zu jeder Vertiefung hinzu.Inkubieren Sie die Probe oder stellen Sie sie eine Stunde und dreißig Minuten lang auf einen Schüttler, oder bis die Farbe der Lösung visuell mit der Farbe der Gele übereinstimmt, um eine ausreichende Diffusion des gelben 2-Nitro-5-thiobenzoesäure-Dianions sicherzustellen, das bei der Reaktion des Ellman-Reagens mit freien Thiolgruppen aus dem Gel entsteht. Entnehmen Sie 100 Mikroliter der Lösung aus den Proben und Standards und geben Sie sie in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Messen Sie die Extinktion bei 405 Nanometern mit einem Plattenreader.Um die Lichtmuster sichtbar zu machen, entfernen Sie den überschüssigen Reaktionspuffer, indem Sie vorsichtig mit einem Tuch um die Ränder des Hydrogels wischen. Geben Sie Ellman-Reagenz direkt auf die Oberfläche des Gels. Nehmen Sie sofort ein Bild mit einem Lichtmikroskop bei 10x oder mit einem Stereomikroskop mit Farbkamera auf.Sammeln Sie die Zellen und bereiten Sie sie gemäß dem Textprotokoll für die Einschließung vor. Suspendieren Sie die pelletierten Zellen unmittelbar nach dem Absaugen von PBS in der Vorläuferlösung, um eine Endkonzentration von fünftausend Zellen pro Mikroliter zu erreichen. Lassen Sie eine geeignete Konzentration freier Thiole für die spätere Reaktion mit dem Penton-Peptid zurück.Wenn eine Fotomusterung gewünscht ist, Form herstellen, Hydrogele wie zuvor polymerisieren und strukturieren. Nach der Strukturierung die Gele dreimal für jeweils 10 Minuten in Wachstumsmedium spülen, um nicht umgesetzte Spezies und überschüssigen Lithiumphosphat-Photoinitiator zu entfernen.Die Gele in Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 bis zum gewünschten Zeitpunkt für die weitere Analyse inkubieren. Das Medium alle 48 Stunden oder entsprechend den Anwendungsanforderungen erneuern. Um die Lebensfähigkeit der eingekapselten Zellen zu bestimmen, zuerst das Wachstumsmedium von den Gele entfernen und diese dreimal für jeweils 15 Minuten mit PBS spülen, um die Diffusion des Mediums aus den Gele zu ermöglichen.Geben Sie zwei Mikroliter der aufgetauten zweimillimolaren Ethidiumhomodimer-1-Lösung und 0,5 Mikroliter der aufgetauten viermillimolaren Calcium-AN-Lösungen zu einem Milliliter steriler PBS. Vortexen Sie die Mischung, um eine vollständige Durchmischung sicherzustellen. Geben Sie 300 Mikroliter der stehenden Lösung in jede Spritzformgel in den 48-Loch-Platten oder eine ausreichende Menge, um die Oberfläche des Gels auf einem Objektträger in einer sterilen Schale zu bedecken.Anschießend 45 Minuten inkubieren. Überschüssige Flüssigkeit abnehmen und spülen, um überschüssige Farbstoffe von den Gele zu entfernen. Die Zellen mittels konfokalem Mikroskop abbilden.Oder an einem Epifluoreszenzmikroskop mit einer Vergrößerung von 10x sowie einer Anregung bei 488 Nanometern und einer Emission bei 525 Nanometern. Die mit der Ellman-Methode bestimmte Konzentration freier Thiolgruppen in nicht strukturierten und strukturierten Hydrogelen zeigte, dass Hydrogele, die ursprünglich eine Minute beziehungsweise fünf Minuten lang polymerisiert wurden, statistisch ähnliche Konzentrationen freier Thiolgruppen aufweisen, was auf eine schnelle Reaktion und eine vollständige Gelierung innerhalb einer Minute hindeutet.Die anschließende makroskopische Strukturierung der Gele, die 30 Minuten sowie eine Stunde und 30 Minuten mit Penton-Peptiden inkubiert wurden, zeigt eine Verringerung der freien Thiolkonzentration um 60 bis 80 Prozent, was auf eine effiziente Modifizierung des überschüssigen Thiols hinweist. Durch Bestrahlung von mit Masken bedeckten Proben, die hier mit Linien bedruckt sind, entstehende Lichthärtungsmuster können zweidimensional durch Zugabe des Ellman-Reagens sichtbar gemacht werden. Alternativ lassen sie sich dreidimensional darstellen, indem fluoreszierende Peptide in nachfolgende Abbildungsverfahren integriert werden.Adulte humane Stammzellen, die in Hydrogelen eingeschlossen waren, wurden mit Vitalitäts- und Hydrotoxizitätsfarbstoffen behandelt und mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet. Lebende Zellen ohne Membranschäden sind grün markiert und weisen auf das Überleben der Zellen einen Tag nach der Einschließung hin.Die Zellen beginnen sechs Tage nach der Einbettung, sich in der Matrix auszubreiten. Wie im vergrößerten Bild dargestellt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sterile und sorgfältige Handhabungsverfahren beizubehalten, um eine Schädigung der Zellen nach der Einbettung durch Kontamination oder mechanische Scherkräfte zu verhindern.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie Immunfärbung, Durchflusszytometrie und Genexpressionsanalysen durchgeführt werden, um die Zellfunktion und Zellschicksale in Reaktion auf die extrazelluläre Umgebung zu untersuchen. Diese Technik eröffnet Forschern in den Bereichen Biologie, Bioingenieurwesen und Medizin die Möglichkeit, Gewebebereichsabtragung oder Krankheitsprogression in synthetischen extrazellulären Matrizen mit benutzerdefinierter Eigenschaftskontrolle zu untersuchen, um neue Behandlungsstrategien zu entwickeln. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Zellen eingekapselt und weiche Matrizen für kontrollierte Zellkulturstudien strukturiert werden können.

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Research

Forschung

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Bioengineering

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