Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zellen in extrazellulären Matrizen auf Basis synthetischer Polymere zu bilden, zu strukturieren und zu verkapseln. Diese Methode kann verwendet werden, um kritische biologische Fragen im Zusammenhang mit der Identifizierung von extrazellulären Signalen zu beantworten, die die Zellreaktionen in einer heterogenen Mikroumgebung regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine robuste synthetische Matrix für die Zellverkapselung und -kultur unter Verwendung von Protokollen und zugänglichen Materialien erzeugt wird.

Diese Methode kann für kontrollierte Zellkulturen und zur Untersuchung der Zellantwort in vitro verwendet werden. Es kann auf andere Systeme angewendet werden, einschließlich der Verabreichung von Medikamenten und des Tissue Engineering. Bereiten Sie die Materialien für die Hydrogelbildung vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Befestigen Sie eine Kollimationslinse am Ende des flüssigkeitsgefüllten Lichtleiters, um eine relativ gleichmäßige Lichtintensität über alle Proben zu gewährleisten. Passen Sie den Abstand des Lichtleiters zu den Proben an, um eine Spotgröße zu erzielen, die die interessierenden Proben abdeckt. Um nicht gemusterte Hydrogele herzustellen, bereiten Sie dicke Hydrogele her, die in Spritzenspitzen geformt sind, indem Sie 10 bis 20 Mikroliter der Gelvorläuferlösung in die Spitze einer steril geschnittenen Spritze pipettieren.

Stellen Sie ein einzelnes Gel pro Spritze her, das etwa 0,5 bis 1,5 Millimeter dick ist, basierend auf Volumen und Spritzendurchmesser. Bereiten Sie dünne Hydrogele in Glasobjektträgerformen vor, indem Sie die Gummidichtung um die Ränder des unbeschichteten Objektträgers legen. Als nächstes pipettieren Sie fünf bis 10 Mikroliter der Gelvorläuferlösung auf den unbeschichteten Objektträger.

Und legen Sie den mit Antikleber beschichteten Objektträger auf die Gellösung. Sichern Sie die Objektträger mit kleinen Bindeklammern zur Stabilisierung. Stellen Sie die Lampenintensität so ein, dass 10 Milliwatt pro Quadratzentimeter an der Geloberfläche für Spritzenspitzenformen oder Glasschiebeformen erreicht werden.

Verwendung eines Radiometers zur Erfassung der Intensität. Und stellen Sie die Formen unter die Lampe. Wenden Sie ein bis fünf Minuten lang Licht an, um eine vollständige Polymerisation der Gele zu ermöglichen.

Verwenden Sie eine kürzere Polymerisationszeit für Gele mit höherem Polyethylenglykolterephthalatgehalt. Und eine längere Zeit für Gele mit geringerem Gehalt, um vollständig polymerisierte Hydrogele mit Modulen im Bereich von Weichgeweben herzustellen. Geben Sie die Gele aus den Spritzenspitzenformen in eine sterile, unbehandelte 48-Well-Platte und legen Sie die Objektträger in eine sterile Schale.

Um gemusterte Hydrogele herzustellen, bereiten Sie die Vorläuferlösung wie im Textprotokoll beschrieben vor und pipettieren Sie die Lösung kräftig, um eine gleichmäßige Durchmischung der Lösung zu gewährleisten. Als nächstes bedecken Sie vorgeformte Gele mit einem Pentonpeptid in Lithiumphosphat-Photoinitiatorlösung und inkubieren eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation eine überschüssige Lösung.

Wenn Gele in eine Spritzenspitze eingegossen werden, verwenden Sie einen Spatel, um sie vorsichtig von der 48-Well-Platte auf einen sterilen Glasobjektträger zu übertragen, um sie zu strukturieren. Legen Sie eine Fotomaske mit dem gewünschten Muster direkt auf die Spritze und das Glasobjektträger. Stellen Sie sicher, dass der bedruckte Teil der Maske das Gel berührt, um eine optimale Mustertreue zu gewährleisten.

Legen Sie die Proben unter die Lampe und bestrahlen Sie sie eine Minute lang. Legen Sie nach der Musterung die spritzengeformten Gele in eine sterile 48-Well-Platte, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde. Legen Sie die Glasobjektträger, geformten Gele, die an den Objektträgern haften, in eine sterile Schale.

Spülen Sie dreimal à 15 Minuten mit Kulturmedium oder dem entsprechenden Puffer basierend auf den geplanten Versuchen. Um die Detektion und Quantifizierung von freien Thiolen in photostrukturierten Hydrogelen vorzubereiten, bereiten Sie zunächst die Lösungen vor und führen Sie die Berechnungen durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Dünne Hydrogele für die Strukturierung wie bisher formen.

Stellen Sie insbesondere Gele mit überschüssigen freien Thiolen her und strukturieren Sie die Hälfte dieser Proben mit dem Pentonpeptid unter Verwendung eines durchsichtigen Deckglases, um das gesamte Gel vollständig mit Licht zu belichten. Platzieren Sie gemusterte und nicht gemusterte Gele in Vertiefungen einer 48-Well-Platte. 15 Minuten lang dreimal mit dem Ellman-Reaktionspuffer spülen, damit die endreagierte Spezies aus dem Gel diffundiert und eine Gleichgewichtsschwellung auftreten kann.

Geben Sie zusätzlichen Ellman's Reaktionspuffer zu den Spülgelen, so dass das aufgequollene Gelvolumen mit dem Reaktionspuffer ein Vielfaches von 20 Mikrolitern beträgt. Wenn das vorhergesagte Volumen des geschwollenen Gels beispielsweise 15 Mikroliter beträgt, fügen Sie fünf Mikroliter Reaktionspuffer hinzu. Und wenn das vorhergesagte Volumen des geschwollenen Gels 30 Mikroliter beträgt, fügen Sie 10 Mikroliter Reaktionspuffer hinzu.

Pipettieren Sie die Sixtin-Standards in einzelne Vertiefungen einer 48-Well-Platte in Vielfachen von 20 Mikrolitern. Abhängig von der im vorherigen Schritt verwendeten Lautstärke. Wenn der vorherige Schritt beispielsweise ein geschwollenes Gelvolumen plus zusätzlichen Reaktionspuffer in Höhe von 40 Mikrolitern enthielt, geben Sie 40 Mikroliter jedes Standards in einzelne leere Vertiefungen.

Als nächstes verdünnen Sie das Ellman-Reagenz und den Reaktionspuffer. Geben Sie das verdünnte Ellman-Reagenz in Vertiefungen, die Standards und Proben enthalten. Geben Sie für 20 Mikroliter Proben 183,6 Mikroliter Lösung in jede Vertiefung

Inkubieren oder auf einen Schüttler legen für eine Stunde und dreißig Minuten oder bis die Farbe der Lösung mit der Farbe der Gele durch Sichtprüfung übereinstimmt, um eine ausreichende Diffusion des gelben 2-Nitro-5-thiobenzoesäuredianions sicherzustellen, das bei der Reaktion des Ellman-Reagenzes mit freien Thiolen aus dem Gel erzeugt wird. Entnehmen Sie 100 Mikroliter Lösung aus den Proben und Standards und geben Sie sie in Vertiefungen mit einer 96-Well-Platte. Lesen Sie die Absorptionsfähigkeit bei 405 Nanometern auf einem Plattenlesegerät ab.

Um die Photomuster zu visualisieren, entfernen Sie überschüssigen Reaktionspuffer, indem Sie vorsichtig mit einem Taschentuch über die Ränder des Hydrogels wischen. Pipettieren Sie das Ellman-Reagenz direkt auf die Oberfläche des Gels. Sofortiges Bild auf einem Lichtmikroskop mit 10x oder auf einem Stereomikroskop mit einer Farbkamera.

Sammeln Sie die Zellen und bereiten Sie sie für die Verkapselung vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Unmittelbar nach der Aspiration von PBS werden die pelletierten Zellen in der Vorläuferlösung auf eine Endkonzentration von fünftausend Zellen pro Mikroliter suspendiert. Lassen Sie eine angemessene Konzentration an freien Thiolen für die spätere Reaktion mit dem Penton-Peptid.

Wenn eine Fotomusterung gewünscht ist. Formen, polymerisieren und modellieren Sie Hydrogele wie bisher. Spülen Sie die Gele nach der Musterung dreimal 10 Minuten lang in Wachstumsmedium aus, um nicht umgesetzte Spezies und überschüssige Lithiumphosphat-Photoinitiatoren zu entfernen.

Inkubieren Sie die Gele in Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 bis zum gewünschten Zeitpunkt für die weitere Analyse. Füllen Sie das Medium alle 48 Stunden oder je nach Anwendung auf. Um die Lebensfähigkeit der verkapselten Zellen zu bestimmen, entfernen Sie zuerst das Wachstumsmedium aus den Gelen und spülen Sie es dreimal 15 Minuten lang mit PBS aus, um eine Diffusion des Mediums aus den Gelen zu ermöglichen.

Fügen Sie zwei Mikroliter des aufgetauten zwei millimolaren Ethidium-Homodimers-1 und 0,5 Mikroliter der aufgetauten vier millimolaren Calcium-AN-Lösungen zu einem Milliliter sterilem PBS hinzu. Vortex, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten. Geben Sie 300 Mikroliter stehende Lösung zu jedem Spritzenformgel in den 48-Well-Platten oder genug, um die Oberfläche des Gels auf einem Objektträger in einer sterilen Schale zu bedecken.

Und 45 Minuten inkubieren. Entfernen Sie überschüssige stehende Lösung und spülen Sie sie aus, um überschüssige Farbe von den Gelen zu entfernen. Bilden Sie die Zellen mit einem konfokalen Mikroskop ab.

Oder an einem Epifluoreszenzmikroskop mit einer Kapazität von 10x. Und 488 Nanometer Anregung und 525 Nanometer Emission. Die mit Ellman quantifizierte Konzentration von freien Thiolen in unstrukturierten und gemusterten Hydrogelen zeigte, dass Hydrogele, die zunächst für eine Minute und für fünf Minuten polymer waren, statistisch ähnliche Konzentrationen an freiem Thiol aufweisen, was auf eine schnelle Reaktion und vollständige Gelierung innerhalb einer Minute hinweist.

Die anschließende Bulk-Strukturierung der Gele, die 30 Minuten lang und eine Stunde und 30 Minuten lang mit Pentonpeptiden inkubiert wurden, führt zu einer 60- bis 80-prozentigen Verringerung der freien Thiolkonzentration, was auf eine effiziente Modifikation des überschüssigen Thiols hinweist. Photomuster, die durch das Bestrahlen von Proben gebildet werden, die mit Masken bedeckt sind und hier mit Linien bedruckt sind, können mit Hilfe von Ellmans Reagenz in zwei Dimensionen beobachtet werden. Oder in drei Dimensionen mit dem Einbau von fluoreszierenden Peptiden in die nachfolgende Bildgebung.

Adulte humane Stammzellen, die in Hyrogelen verkapselt waren, wurden mit Viabilitäts- und Hydrotoxizitätsfärbungen behandelt. Und mit konfokaler Mikroskopie abgebildet. Lebensfähige Zellen ohne Membranschädigung werden grün markiert und zeigen das Überleben der Zellen einen Tag nach der Verkapselung an.

Sechs Tage nach der Verkapselung beginnen sich die Zellen innerhalb der Matrix auszubreiten. Wie im eingefügten Bild zu sehen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, sterile und sorgfältige Handhabungsverfahren beizubehalten, um Schäden an den Zellen nach der Verkapselung durch das Einbringen von Verunreinigungen oder mechanischem Scheren zu vermeiden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Immunfärbung, Durchflusszytometrie und Genexpression durchgeführt werden, um die Zellfunktion und das Schicksal als Reaktion auf die extrazelluläre Umgebung zu untersuchen. Diese Technik ebnet Forschern aus den Bereichen Biologie, Bioingenieurwesen und Medizin den Weg zur Untersuchung der Erosion oder des Fortschreitens von Geweberegionen in synthetischen extrazellulären Matrizen mit benutzerdefinierter Eigenschaftskontrolle zur Entwicklung neuer Behandlungsstrategien. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen verkapselt und weiche Matrizen für kontrollierte Zellkulturstudien mustert.