Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, immobilisierte, bioaktive räumliche Proteinmuster herzustellen, die zur Untersuchung zellulärer Reaktionen verwendet werden können. Diese Methode ermöglicht die Rekapitulation von in-vivo-Signalen mithilfe von Biomaterialstrategien. Die Technik erlaubt eine präzise Nachbildung bestimmter Signalisierungsmotive, die mit herkömmlichen Kultivierungsmethoden nicht erzielbar ist, wie beispielsweise sequenzielle Wachstumsfaktoren, Zell-Zell-Signalübertragung und räumlich spezifische biochemische Signale.

Dieses Protokoll ist im Vergleich zu bestehenden Methoden bedeutend, da es ein vereinfachtes Verfahren zur Einstellung der Substratsteifigkeit und zur Proteinmusterung bereitstellt. Während diese Methode die Technologien der Gewebeengineering und regenerativen Medizin voranbringen kann, lässt sie sich auch zur Untersuchung anderer Systeme wie der Gewebeentwicklung und des Stammzellgeschicks anwenden. Zunächst bereiten Sie unter sterilen Bedingungen die Stammlösungen für die Hauptkomponente des Hydrogels, Polyethylenglykol-Diacrylat, den Photoinitiator Lithiumphenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinat und das ECM-Protein Fibronectin gemäß dem begleitenden Textprotokoll vor.

Jede Lösung vor der Verwendung oder Lagerung der einzelnen Aliquote mittels einer 0,22-Mikron-Spritzenfilter steril filtrieren. Anschließend die PEG-DA-Lösung mit Aluminiumfolie umwickeln, um sie vor Licht zu schützen. Die Stammlösung des Photoinitiators ebenfalls in Aluminiumfolie einwickeln, um sie vor Licht zu schützen, und die hergestellte Lösung bei vier Grad Celsius bis zu mehreren Monaten lagern.

Wenn die Fibronectin-Stammlösung eingefroren ist, einen sterilen Aliquot mehrere Stunden lang auf Eis auftauen lassen oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Beginnen Sie damit, ein Polyestersheet für jede Gel-Form zu autoklavieren. Danach zwei Objektträger und drei Kunststoffabstandshalter für jede Gel-Form mindestens zwei Stunden lang in 70 % Ethanol einweichen.

Des Weiteren werden fünf Büroklammern pro Gel-Form für 10 Minuten in 70 %igem Ethanol getränkt. Die Objektträger, Abstandshalter und Büroklammern werden auf ein kleines Autoklavierblatt in der Zellkulturwerkbank gelegt, um sie mehrere Stunden lufttrocknen zu lassen. Danach bereiten Sie die Hydrogel-Formen vor, indem Sie die 0,5 Millimeter dicken Kunststoffabstandshalter um den Rand eines Objektträgers herum platzieren.

Legen Sie die zweite Objektträgerplatte darauf und befestigen Sie die Abstandshalter mit Büroklammern dicht nebeneinander. Sterilisieren Sie schließlich die Oberfläche der Form, indem Sie sie in die Haube stellen und vor der Verwendung 30 Minuten lang das UV-Licht einschalten. Drehen Sie die Form zur Mitte des Sterilisationsvorgangs um, um sicherzustellen, dass beide Oberflächen ausreichend bestrahlt werden.

Erstellen Sie die Gel-Vorläuferlösungen wie in Tabelle eins des begleitenden Textprotokolls beschrieben. Mischen Sie anschließend die Volumina von PEG-DA, Fibronectin und Photoinitiator, um das Hydrogel herzustellen. Pipettieren Sie die Lösung kräftig, um eine homogene Mischung zu gewährleisten, vermeiden Sie dabei jedoch das Entstehen von Blasen.

Pipettieren Sie die Gel-Vorläuferlösung vorsichtig zwischen die beiden Objektträger der Gel-Form. Danach stellen Sie die Form unter eine UV-Lampe und belichten sie ein bis zwei Minuten lang, um das Hydrogel zu bilden. Sobald das Gel gebildet ist, nehmen Sie die Schellen ab und entfernen vorsichtig den oberen Objektträger, indem Sie entgegengesetzten Druck auf die beiden Seitenabstandshalter ausüben.

Danach die Hydrogelsproben mit einer geeignet dimensionierten Biopsiepunch ausschneiden. Mehrere Hydrogels aus dem Gel-Rechteck ausschneiden, um als Replikate und Kontrollproben zu dienen. Die Fotomaske sterilisieren, indem sie 10 Minuten lang in 70 %igem Ethanol getaucht wird.

Anschließend lässt man die Fotomaske in einer Zellkulturhaube lufttrocknen. Danach pipettiert man ein bis zwei Mikroliter pro Quadratzentimeter einer thiolierter Proteingelösung auf die Oberfläche jedes ausgeschnittenen Hydrogels zur Oberflächenmusterung. Es ist wichtig, die Proteingelösung gleichmäßig auf der Oberfläche des Hydrogels zu verteilen, um eine homogene Immobilisierung des Proteins sicherzustellen.

Platzieren Sie die Fotomaske vorsichtig auf der Oberfläche des Hydrogels. Drücken Sie leicht auf die Maske, um eventuelle Blasen zwischen Maske und Hydrogeloberfläche zu entfernen. Anschließend stellen Sie das Hydrogel unter das UV-Licht und belichten es einer zweiten Runde UV-Licht für 30 bis 60 Sekunden aus.

Spülen Sie die Hydrogele mit PBS, um nicht umgesetzte Spezies zu entfernen, und geben Sie jedes Hydrogel in eine Vertiefung der Mikrotiterplatte, sodass die strukturierte Oberfläche nach oben zeigt. Anschließend spülen Sie die Gele über Nacht bei vier Grad Celsius mit PBS. Entfernen Sie das PBS aus den Vertiefungen und geben Sie 250 Mikroliter basales EGM2 in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Gele fünf bis zehn Minuten bei 37 Grad Celsius.

Während der Inkubation verdauen Trypsin eine Platte mit nahezu konfluenten HUVECs zu einer Einzelzell-Suspension unter Verwendung standardisierter Techniken. Anschließend wird die Zellsuspension zentrifugiert und das Überstand sorgfältig entfernt. Das Zellpellet wird in basalem EGM2 ohne zusätzliche Wachstumsfaktoren resuspendiert, und ein Teil der Zellsuspension wird einem Hämozytometer zugegeben.

Zählen Sie die Zellen, um die Konzentration zu bestimmen. Danach zentrifugieren Sie die Platte mit den Hydrogelen bei 300 x G für drei Minuten, um sicherzustellen, dass sich die Hydrogale am Boden der Vertiefung befinden und nicht schwimmen. Es ist entscheidend, dass die Hydrogale nicht in den Vertiefungen schwimmen.

Schwimmende Hydrogels beeinträchtigen den Erfolg der Zellbesiedlung und verursachen Probleme bei der Bildgebung der Hydrogels. Pipettieren Sie langsam 75.000 Zellen pro Quadratzentimeter vorsichtig in die Mitte jeder Hydrogel-Oberfläche, um die Gele nicht zu stören. Anschließend stellen Sie die Platte in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie die Schale über mehrere Tage hinweg regelmäßig, um die Zellmigration in Reaktion auf das Proteinmuster zu beobachten. Ersetzen Sie alle zwei bis drei Tage 50 % des Mediums. Bei der Bildung der Hydrogelen können verschiedene Vorläuferkonzentrationen von PEG-Diacrylat verwendet werden, um die gewünschte Substratsteifigkeit zu erzielen.

Hier gezeigt, korreliert eine 20 %ige PEG-DA-Lösung mit einer Steifigkeit von über 100 Kilopascal. Es ist ebenfalls wichtig, sowohl die Konzentration des Photoinitiators als auch die UV-Belichtungszeit zu berücksichtigen, da eine Erhöhung einer der beiden Variablen die Bioaktivität der angebundenen Moleküle verringert, was hier durch die Bioaktivität des Lysosoms dargestellt wird. Die Minimierung der UV-Belichtung während der Hydrogelbildung ist entscheidend, um freie Acrylatfunktionsgruppen für nachfolgende Proteinimmobilisierungsreaktionen aufrechtzuerhalten.

Hydrogels, die länger als zwei Minuten UV-Licht ausgesetzt sind, können keine immobilisierten Proteinmuster, die in Rot dargestellt sind, erzeugen. Außerdem reagieren immer mehr Proteine mit der Oberfläche, je länger die UV-Bestrahlung des Proteinmusters andauert. Wenn sie korrekt hergestellt werden, können Zellen auf diesen strukturierten Hydrogel-Substraten kultiviert werden, um ihr Verhalten gezielt zu beeinflussen.

Hier wurden Endothelzellen gleichmäßig auf die Oberfläche von VEGF-Muster-PEG-Hydrogelen ausgesät. Zwei Tage nach der Aussaat zeigte sich, dass die Endothelzellen in die räumlichen Bereiche des Hydrogels wanderten, die das immobilisierte VEGF enthielten. Nach der Entwicklung dieses Protokolls können Forscher es nutzen, um beliebige Proteine oder Peptide zu immobilisieren und so neue bioaktive Plattformen für in-vitro-Zellsysteme zu erforschen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Konzentration des Photoinitiators und die UV-Belichtungszeit so gering wie möglich zu halten, um die Bioaktivität der immobilisierten Moleküle zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bioaktive Proteine und Peptide auf PEG-Hydrogelen mustern, Zellen gleichmäßig auf Hydrogelen ansiedeln und die daraus resultierende Zellreaktion beobachten kann.