Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, immobilisierte bioaktive räumliche Proteinmuster zu erzeugen, die zur Untersuchung zellulärer Reaktionen verwendet werden können. Diese Methode ermöglicht die Rekapitulation von in-vivo-Signalen mit Hilfe von Biomaterialstrategien. Diese Technik ermöglicht die genaue Nachahmung bestimmter Signalmotive, die mit Standard-Kultivierungsmethoden nicht erreicht werden können, wie z. B. sequentielle Wachstumsfaktoren, Zellsignale und räumliche spezifische biochemische Hinweise.

Dieses Protokoll ist für bestehende Methoden von Bedeutung, da es eine vereinfachte Methode zur Anpassung der Substratsteifigkeit und der Proteinstrukturierung bietet. Während diese Methode das Tissue Engineering und die regenerativen Medizintechnologien voranbringen kann, kann sie auch zur Untersuchung anderer Systeme wie der Gewebeentwicklung und des Schicksals von Stammzellen eingesetzt werden. Zu Beginn bereiten Sie Stammlösungen für die Haupthydrogelkomponente, Polyethylenglykoldiacrylat, den Photoinitiator, Lithiumphenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinat und das EZM-Protein, Fibronektin, unter sterilen Bedingungen vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Filter: Sterilisieren Sie jede Lösung mit einem 0,22-Mikron-Spritzenvorsatzfilter, bevor Sie die einzelnen Aliquote verwenden oder lagern. Wickeln Sie dann die PEG-DA-Lösung mit Folie ein, um sie vor Licht zu schützen. Wickeln Sie die Fotoinitiator-Stammlösung zum Lichtschutz in Folie ein und lagern Sie die vorbereitete Lösung bis zu mehreren Monaten bei vier Grad Celsius.

Wenn die Fibronektin-Stammlösung eingefroren ist, lassen Sie das sterile Aliquot mehrere Stunden lang auf Eis oder über Nacht bei vier Grad Celsius auftauen. Beginnen Sie damit, eine Polyesterplatte für jede Gelform zu autoklavieren. Weichen Sie dann zwei Objektträger in drei Kunststoffabstandshaltern für jede Gelform mindestens zwei Stunden lang in 70 % Ethanol ein.

Tränken Sie zusätzlich fünf Bindemittelclips für jede Gelform 10 Minuten lang in 70 % Ethanol. Legen Sie die Objektträger, Abstandshalter und Bindeklammern auf ein kleines Autoklavenblatt in der Zellkulturhaube, um sie mehrere Stunden an der Luft trocknen zu lassen. Bereiten Sie anschließend die Hydrogelformen vor, indem Sie die 0,5 Millimeter dicken Kunststoffabstandshalter um den Rand eines Objektträgers legen.

Setzen Sie den zweiten Objektträger darauf und befestigen Sie dann die Abstandshalter mit Binderklammern fest nebeneinander. Zum Schluss sterilisieren Sie die Form an der Oberfläche, indem Sie sie in die Haube legen und das UV-Licht vor der Verwendung 30 Minuten lang einschalten. Drehen Sie die Form nach der Hälfte des Sterilisationsprozesses um, um sie sicherer zu machen und beide Oberflächen freizulegen.

Erstellen Sie die Gelvorläuferlösungen, wie in Tabelle eins des beigefügten Textprotokolls beschrieben. Mischen Sie dann das PEG-DA-, das Fibronektin- und das Photoinitiatorvolumen, um das Hydrogel herzustellen. Pipettieren Sie die Lösung kräftig, um eine homogene Lösung zu erhalten, aber vermeiden Sie die Bildung von Blasen.

Pipettieren Sie die Gelvorläuferlösung vorsichtig zwischen den beiden Objektträgern der Gelform. Legen Sie dann die Form unter ein UV-Licht und setzen Sie sie ein bis zwei Minuten lang aus, um das Hydrogel zu bilden. Nehmen Sie nach dem Gelieren die Bindeklammern ab und entfernen Sie vorsichtig den oberen Glasobjektträger, indem Sie entgegengesetzten Druck auf die beiden seitlichen Abstandshalter ausüben.

Schneiden Sie dann mit einem Biopsiestanzer in geeigneter Größe die Hydrogelproben aus. Stanzen Sie mehrere Hydrogele aus dem Gelrechteck aus, die als Repliken und Kontrollproben dienen. Sterilisieren Sie die Fotomaske, indem Sie sie 10 Minuten lang in 70%igem Ethanol einweichen.

Lassen Sie die Fotomaske dann in einer Zellkulturhaube an der Luft trocknen. Als nächstes pipettieren Sie ein bis zwei Mikroliter pro Quadratzentimeter einer thiolierten Proteinlösung auf die Oberfläche jedes ausgeschnittenen Hydrogels zur Oberflächenstrukturierung. Es ist wichtig, die Proteinlösung gleichmäßig über die Oberfläche des Hydrogels zu verteilen, um eine gleichmäßige Immobilisierung des Proteins zu gewährleisten.

Legen Sie die Fotomaske vorsichtig auf die Oberfläche des Hydrogels. Drücken Sie vorsichtig auf die Maske, um alle Blasen zu entfernen, die sich zwischen der Maske und der Hydrogeloberfläche bilden. Legen Sie anschließend das Hydrogel unter das UV-Licht und setzen Sie es 30 bis 60 Sekunden lang einer zweiten Runde UV-Licht aus.

Waschen Sie die Hydrogele mit PBS, um nicht umgesetzte Spezies zu entfernen, und platzieren Sie jedes Hydrogel so in der Well-Platte, dass die Musteroberfläche nach oben zeigt. Waschen Sie die Gele dann über Nacht in PBS bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie PBS aus den Vertiefungen, geben Sie dann 250 Mikroliter basales EGM2 in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Gele fünf bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Während der Inkubation verdaut Trypsin eine Platte mit nahezu konfluenten HUVECs unter Verwendung von Standardtechniken in eine Einzelzellsuspension. Schleudern Sie dann die Zellsuspension herunter und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Suspendieren Sie das Zellpellet und das basale EGM2 ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren erneut und geben Sie einen Teil der Zellsuspension in ein Hämozytometer.

Zählen Sie die Zellen, um die Konzentration zu bestimmen. Drehen Sie anschließend die Platte mit den Hydrogelen drei Minuten lang bei 300 x G herunter, um sicherzustellen, dass sich die Hydrogele am Boden der Vertiefung befinden und nicht schwimmen. Es ist wichtig, dass die Hydrogele nicht in den Bohrlöchern schwimmen.

Schwimmende Hydrogele schränken den Erfolg bei der Zellaussaat ein und verursachen Probleme bei der Hydrogel-Bildgebung. Pipettieren Sie langsam 75.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf die Mitte jeder Hydrogeloberfläche, um die Gele nicht zu stören. Stellen Sie die Platte dann in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie die Schale mehrere Tage lang regelmäßig, um die Zellmigration als Reaktion auf das Proteinmuster zu beobachten. Tauschen Sie 50 % der Medien alle zwei bis drei Tage aus. Bei der Bildung der Hydrogele können verschiedene Vorläufer-PEG-Diacrylat-Konzentrationen verwendet werden, um die gewünschte Substratsteifigkeit zu erzielen.

Die hier gezeigte 20%ige PEG-DA-Lösung korreliert mit einer Steifigkeit von über 100 Kilopascal. Es ist auch wichtig, sowohl die Photoinitiator-Konzentration als auch die UV-Expositionszeit zu berücksichtigen, da eine Erhöhung einer der beiden Variablen die Bioaktivität der angehängten Moleküle verringert, die hier durch die Bioaktivität des Lysosoms dargestellt wird. Die Minimierung der UV-Exposition während der Hydrogelbildung ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der funktionellen Gruppen des freien Acrylats für nachfolgende Proteinimmobilisierungsreaktionen.

Hydrogele, die länger als zwei Minuten UV-Licht ausgesetzt sind, sind nicht in der Lage, immobilisierte Proteinmuster zu erzeugen, die rot dargestellt sind. Darüber hinaus reagieren mit zunehmender UV-Exposition gegenüber dem Proteinmuster mehr Proteine mit der Oberfläche. Bei korrekter Vorbereitung können Zellen auf diesen gemusterten Hydrogelsubstraten kultiviert werden, um ihr Verhalten zu manipulieren.

Hier wurden Endothelzellen gleichmäßig auf die Oberfläche von VEGF-Muster-PEG-Hydrogelen ausgesät. Zwei Tage nach der Aussaat wurde beobachtet, dass die Endothelzellen in Richtung der räumlichen Regionen des Hydrogels wanderten, die das immobilisierte VEGF enthielten. Nach der Entwicklung dieses Protokolls können Forscher es verwenden, um jedes Protein oder Peptid zu immobilisieren, um neue bioaktive Plattformen für In-vitro-Zellsysteme zu erforschen.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Konzentration des Photoinitiators und die UV-Belichtungszeit zu minimieren, um die Bioaktivität der immobilisierten Moleküle zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bioaktive Proteine und Peptide auf PEG-Hydrogele aufträgt, Zellen gleichmäßig auf Hydrogele sät und die daraus resultierende Zellreaktion beobachtet.