Hochdurchsatz-robotically Assisted Isolation von temperaturempfindlichen Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Das übergeordnete Ziel des Verfahrens ist es, mithilfe von Robotik und standardisierten Assays die Isolierung temperaturempfindlicher letaler Mutationen in Chlamydomonas zu rationalisieren und so essentielle Gene und Signalwege in diesem Organismus zu bestimmen. Wir interessieren uns sowohl für die Erhaltung als auch für die Divergenz essentieller zellulärer Funktionen in Eukaryoten. Und die Art und Weise, wie wir das gerne untersuchen, ist mit Mutationen, die essentielle Gene in diesen Prozessen stören.

Damit das gut funktioniert, braucht man eine wirklich umfassende Sammlung von Mutanten, und die Methoden, von denen Sie hören werden, sind unsere Art, eine solche Sammlung zu erstellen. Wir arbeiten mit der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii als Vertreter des Pflanzenreichs. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass temperaturempfindliche letale Mutationen wahrscheinlich in jedem essentiellen Signalweg zu finden sind.

Die Methode erfordert keine Vorkenntnisse oder gezielte Mutagenese. Die molekulare Funktion des mutierten Gens deutet unmittelbar auf den letalen Phänotyp hin. Dies hilft uns, interessante Mutationen auszuwählen, die verschiedene Siala-Signalwege über die Zellzykluskontrolle hinaus stören.

Zur Durchführung der UV-Mutagenese werden Chlamydomonas-Zellen bis zu einem OD 750 von 0,2 bis 0,5 in 100 Millilitern Tris-Acetat-Phosphat oder TAP unter Licht bei 25 Grad Celsius und Schütteln bei 100 U/min hergestellt. Die UV-Mutagenese wird unabhängig voneinander in zwei genetischen Hintergründen gemäß dem Textprotokoll durchgeführt. Überprüfen Sie eine Probe jeder Kultur unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen lebensfähig und ohne Kontamination sind.

Verdünnen Sie dann die Kultur auf einen OD 750 von 0,003 und wickeln Sie die Flasche dann mit Aluminiumfolie ein, um eine homogene Dichte zu gewährleisten, da der Stamm modal ist und als Reaktion auf Licht in Richtung schwimmt. Nachdem Sie die Dichte der Suspension gemäß dem Textprotokoll eingestellt haben, bringen Sie eine kleine Röhrchenkassette an, die in einen Flüssigkeitsspender passt, und führen Sie eine Reihe von Waschgängen zur Sterilisation gemäß den Anweisungen des Herstellers durch, um eine Kontamination zu vermeiden. Geben Sie mit einer Flüssigkeitsspenderkassette mit acht Spritzen vier mal 96 Tropfen von je zwei Mikrolitern Kultur auf trockene rechteckige Platten ab.

Klopfen Sie vorsichtig auf den Rand der Platte, um sicherzustellen, dass alle Tropfen zu einer dünnen Flüssigkeitsschicht verschmelzen, und decken Sie die Platten sofort ab, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Nach dem Trocknen werden die Platten für empirisch bestimmte Zeiträume unter eine keimtötende UV-Lampe gelegt, um eine optimale Ausbeute an ts-Mutanten unter den Überlebenden zu erzielen. Stellen Sie die Platten anschließend für acht bis 24 Stunden bei Raumtemperatur ins Dunkel.

Legen Sie die Platten dann in einen 21 Grad Celsius heißen Inkubator mit Beleuchtung. Nach etwa 10 Tagen, wenn die Völker gewachsen, aber nicht zusammengeführt sind, laden Sie die Platten in den entsprechenden Stapel als Quellen für die robotergestützte Koloniekommissionierung. Wählen Sie dann Kolonien für 384 Arrays auf rechteckigen Platten aus und züchten Sie sie bei 21 Grad Celsius und Beleuchtung für etwa eine Woche.

Verdichten Sie die 384 Arrays mit einem nachgebauten Beschichtungsroboter zu einem 1536 Array und lassen Sie die Platten etwa drei Tage lang im 21 Grad Celsius heißen Inkubator wachsen. Replizieren Sie die 1536 Arrays auf jeweils zwei Platten und platzieren Sie eine in den 21-Grad-Celsius-Inkubator und die andere in einen 33-Grad-Celsius-Inkubator. Nach 24 Stunden bei 33 Grad Celsius replizieren Sie die Platten aus dem 33 Grad Celsius Inkubator auf einen neuen Satz vorgewärmter Platten und legen Sie sie in den 33 Grad Celsius Inkubator.

Nach drei Tagen Wachstum bei 33 Grad Celsius und fünf Tagen Wachstum bei 21 Grad Celsius fotografieren Sie mit einer Digitalkamera eine Rasterplatte, die mit neun Ausrichtungsindikatoren markiert ist. Fotografieren Sie dann die Platten, abwechselnd 21 Grad Celsius Platten, gefolgt von den entsprechenden 33 Grad Celsius Platten, wobei alle Platten in einem festen Rahmen platziert sind, um die genaue Ausrichtung zu wahren. Verarbeiten Sie die gepaarten 21 und 33 Plattenbilder mit einer benutzerdefinierten Matte-Lab-Bildanalysesoftware, um den Hintergrund zu eliminieren und die Bilder in ein 1536-Array zu segmentieren.

Das Programm bestimmt die detektierte Biomasse als Gesamtpixelintensität in jeder Position. Laden Sie die von der Software generierte Liste der ausgewählten Kolonien als Anweisungsdatei für die Einzelkolonie-Kommissionierrobotik. Bereiten Sie dann die Quell- und Zielplatten gemäß den Roboteranweisungen vor und lassen Sie den Roboter die ausgewählten Kolonien in ein Array aufnehmen.

Legen Sie die Zielplatten für etwa fünf Tage in den 21 Grad Celsius Inkubator, um eine Vorratsplatte zu züchten. Nach Durchführung eines zweiten Biomasseakkumulationsassays und der Replikation von 100 Blockplatten gemäß dem Textprotokoll replizieren Sie die frische Kopie der 100 Blockplatten auf drei Kopien. Nach dem Aufstellen der dritten Platte im Roboter und dem Spottieren der Kolonien machen Sie mikroskopische Fotoaufnahmen eines Bereichs jedes Flecks der Screening-Platten zu Zeiten Null und platzieren Sie die Platten bei 33 Grad Celsius für die Inkubation.

Machen Sie zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Entnahme der Screening-Platten aus dem 33-Grad-Inkubator schnell Mikroaufnahmen und stellen Sie sicher, dass der Plattenhalter und der Tischregler genau kalibriert sind, um zu jedem Zeitpunkt Bilder derselben Zellen zu erhalten. Analysieren Sie mikroskopische Bilder und wählen Sie Mutanten anhand der gewünschten Kriterien aus. Erkennen Sie das endgültig ausgewählte Set in einer Agarplatte mit 96 Arrays und stellen Sie sicher, dass jede Platte Mutanten des gleichen Paarungstyps und der gleichen Arzneimittelresistenz enthält.

Übertragen Sie große Mengen der angeordneten Kolonien auf stickstofffreies Gameten-Induktionsmedium auf 96-Well-Mikroplatten. Inkubieren Sie die Platten etwa fünf Stunden lang unter Licht, um die Gametogenese zu ermöglichen. Unterbrechen Sie Abfragen mit den entgegengesetzten Paarungstypen, die die alternativen Widerstandskassetten in Röhrchen mit stickstofffreiem Gameten-Induktionsmedium für die Gametogenese beherbergen.

Mischen Sie die Proben von einer Zielplatte in einem Gegenmischungsvolumen von 20 Mikrolitern. Nach etwa 10 Minuten unter dem Licht entkernen Sie zweimal fünf Mikroliter aus jeder Vertiefung. Einmal auf einer TAP-Platte für Verbindungstests und einmal auf einer TAP plus fünf Mikromol Paro plus neun Mikromol Hygro für Komplementationstests.

Nach der Inkubation der Komplementationstestplatten replizieren Sie die Platten in zwei Kopien zur Identifizierung des ts-Phänotyps. Testen Sie die Kolonien auf den ts-Phänotyp gemäß dem Textprotokoll. Nach der Bestrahlung einzelner Zellen von Chlamydomonas werden die Zellen zehn Tage lang bei einer durchlässigen Temperatur wachsen gelassen und dann in einem Array-Format gepflückt, wie hier zu sehen.

Die resultierenden Platten im Format 384 werden zu einem 1536-Array zusammengeführt. Es wurden drei UV-Expositionszeiten getestet, um Chlamydomonas ts-Mutanten zu erzeugen. Empirisch ergab die Expositionszeit von 1,5 Minuten die meisten ts-Mutanten.

Die einminütige Expositionszeit ergab jedoch bei weitem die meisten Zellzykluskandidaten. In diesem Experiment wurden zwei sequentielle ts-Phänotyp-Assays durchgeführt und etwa 3000 ts-Mutanten isoliert und durch Zeitraffermikroskopie phänotypisch charakterisiert. Um hochrezensive Gene aus der Downstream-Pipeline zu entfernen, wurden Komplementations- und Kopplungstests mit bereits charakterisierten Genen mit mehr als zwei Allelen an neu gesammelten Kandidaten durchgeführt.

Diese Kolonien zeigen keine Komplementation mit der Abfrage und sind daher ein neues ts-Allel für das abgefragte Gen. Diese sind in der Regel von einer weiteren Charakterisierung ausgeschlossen. Einmal gemeistert, kann diese Technik mit hohem Durchsatz durchgeführt werden.

Tausende von ts-Mutanten können in nur zwei oder drei Mutagenese-Runden isoliert werden. Ein wichtiger Schritt nach der Isolierung der ts-Mutanten ist die Auswahl einer Untergruppe für weitere Studien, und es ist sehr interessant, die Bandbreite der letalen Phänotypen zu sehen. Die Phänotypisierung gibt Hinweise auf die molekulare Funktion und hilft uns auch, Mutanten für weitere Studien zu priorisieren.

Denken Sie daran, dass die Mutanten Hunderte oder Tausende von Mutationen in ihrem Genom haben können. In der Regel ist nur eine ursächlich, manchmal sind jedoch zwei Mutationen für den ts-Phänotyp erforderlich, die durch Tetra-Analyse bestimmt werden können. Nach diesem Verfahren können ursächliche Mutationen durch Next-Generation-Sequencing-Analyse von gepoolten Mutationen identifiziert werden. Die identifizierten Gene weisen manchmal Mutationen auf, die auf eine Funktion hindeuten, oder es kann sich um neue, unbekannte Sequenzen handeln, was interessant und aufregend ist.

Chlamydomonas ist ein hervorragendes Modellsystem für die Erforschung der Zellbiologie im Pflanzenreich. Die Verfahren, von denen Sie gehört haben, sollten die Erforschung dieses Organismus für wesentliche Prozesse eröffnen, die bisher relativ unerforscht waren, und wir hoffen, dass die Ergebnisse auch für das breitere Pflanzenreich relevant sein werden.