Name: Beobachtung und Quantifizierung der Paarungsverhalten in der Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Beobachtung und Quantifizierung des Paarungsverhaltens bei Bursaphelenchus xylophilus. Diese Methode ermöglicht die Gewinnung virginaler Adulte für präzise Verhaltensstudien in der Nematologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Najie Zhu und Liqun Bai trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde durch den Sonderfonds für Forstwirtschaft Wissenschaftliche Forschung in der öffentlichen Wohlfahrt (201204501) und der National Natural Science Foundation of China (31170604, 31270688 und 31570638) unterstützt. Wir danken Dr. Holighaus Gerrit und Dr. Danielle Hickford für ihre hilfreichen Anregungen auf Englisch schreiben.

1. Erwerb von Virgin Adult Nematoden <ol><li> Pinewood Nematoden - Isolat und Kulturbedingungen Hinweis: Um die B. xylophilus isolieren Nxy61 ursprünglich von einem erkrankten Pinus massoniana im Ningbo Gebiet der Provinz Zhejiang in China extrahiert wurde. <ol><li> Bereiten Sie Kartoffel - Dextrose - Agar (PDA, siehe Tabelle der Materialien) Platten für den Anbau von Botrytis cinerea. </li><li> Zur Inokulation ein Stück Pilz-Matte mit einem Durchmesser von 10 mm aus einem B. cinerea Matte Punsch und es in der Mitte eines neuen PDA - Platte setzen. Kultur der B. cinerea für 5 d bei 25 ° C im Dunkeln. </li><li> Kultur die pinewood Nematoden in die vorbereitete Petrischale mit B. cinerea bei 25 ° C im Dunkeln. </li></ol></li><li> Erwerb von B. xylophilus Eier <ol><li> Legen Sie eine geklemmt Gummischlauch unter einen Trichter und halten Sie die vorbereiteten Trichter in einem Rack die zusammenBaermann Trichtervorrichtung. Platzieren zwei Schichten von Filterpapier anstelle von Gaze in den Mund des Trichters. </li><li> Übertragen Sie die Pilzkulturen auf den Trichter Setup und Wasser hinzufügen, bis die Pilzmatte eingetaucht ist. Warten Sie 2 h, und Nematoden aus der Pilzkultur herauskommen wird, kreuzen Sie das Filterpapier, und sich in den untersten Teil des Baermann-Trichter nach unten. </li><li> Sammeln Sie die ersten paar Tropfen Wasser aus dem Boden des Röhrchens in ein 15 ml-Röhrchen und sammeln Nematoden langsam auf dem Rohr die Klemme freigegeben wird. </li><li> Zentrifugieren Sie die oben Sammlungen bei 3000 × g für 2 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die obere Schicht aus Wasser mit einer Pipette und resuspendieren es mit 1 ml sterilem doppelt destilliertem (dd) H 2 O. </li><li> Mit einer Pipette die oben Aufwirbelung auf ein neues Glas-Petrischale (6 cm Durchmesser). 3 ml steriler dd H 2 O in die Petrischale , um sicherzustellen , dass die Nematoden frei schwimmen können. </li><li> Halten Sie die Nematoden im Glass Petri bei 25 ° C im Dunkeln für 10 min Schale. Eier werden von schwangeren Frauen gelegt werden. Aufgrund ihrer Glykoprotein Oberfläche, klebt die Eier an der Unterseite der Glaspetrischale. </li><li> Entfernen Sie das Wasser und Würmer vorsichtig, ohne die Eier zu stören. 3 ml steriler dd H 2 O auf die Glaspetrischale unmittelbar um die Eier zu verhindern , vor dem Austrocknen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2.8 3x zu entfernen Sie alle Larven und Erwachsene, und erhalten die reinen Eier. Fügen Sie eine zusätzliche 2 ml (5 ml insgesamt) steriler dd H 2 O zu der Petrischale. </li></ol></li><li> Der Erwerb der vierten Stufe Jugendlichen (J4 Larven) <ol><li> Hatch die gesammelten Eier für 24 h im Dunkeln bei 25 ° C J2 Larven zu erhalten. </li><li> Übertragen Sie die J2-Larven mit einer Pipette in ein 15 ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 3000 × g für 2 min, und entfernen Sie die obere Wasserschicht. </li><li> Resuspendieren J2 - Larven mit 200 ul steriler dd H 2 O, und dann übertragen zudie PDA - Platte B. cinerea enthält. </li><li> Kultur der J2-Larven für 52 h bei 25 ° C im Dunkeln. Zu diesem Zeitpunkt werden die meisten J2-Larven in der frühen Phase der J4 Larven entwickelt. </li></ol></li><li> Erwerb von nativem erwachsenen Nematoden <ol><li> Bereiten Sie eine Nadel für Nematoden Aufnehmen durch eine Glaskapillare zeichnen, nachdem sie über einen Spiritusbrenner erhitzt wird. HINWEIS: Die Spitze dieses Kapillarnadel benötigt normalerweise 50 &amp; mgr; m im Durchmesser sein, etwa der Körperbreite eines erwachsenen Nematoden, so daß sie als Werkzeug zum Aufnehmen eines einzelnen Nematoden verwendet werden kann. </li><li> Bauen Sie eine Baermann-Trichter und extrahieren Nematoden aus den Pilzkulturen für 2 h, wie 1.2.1 in den Schritten - 1.2.3. </li><li> Übertragen Sie die J4 mit Wasser in eine saubere Petrischale. </li><li> Beachten Sie die Nematoden unter einem Stereomikroskop und zu unterscheiden zwischen Männern und Frauen von Genitalmorphologie, wie von Mamiya und Kiyohara 8 (Abbildung 1 </strong&gt;). Pick-up eine Nematode des gewünschten Geschlechts mit der vorbereiteten Kapillarnadel und übertragen sie an den entsprechenden Pilz-Kulturplatte für Männer oder Frauen. HINWEIS: Es gibt mehr Frauen als Männer, wobei der Anteil der Frauen bei 60 bis 70%. Die weibliche Vulva ist offensichtlich von dem männlichen spicule. Im Vergleich zu den Erwachsenen ist die spicule oder Vulva in der Frühphase J4 kleiner, aber sie können immer noch leicht zu erkennen und zu unterscheiden. Die Nematoden bewegt sich immer im Wasser, die manchmal die Schwierigkeit erhöht sich bei Männern und Frauen unterscheiden. </li><li> Kultur der J4 Larven für weitere 24 h bei 25 ° C im Dunkeln. Hinweis: Alle Nematoden zu Erwachsenen entwickeln sollte, aber da sie nicht zusammengefügten sind, werden sie als Jungfrau Erwachsene angesehen. </li><li> Montieren Sie zwei Baermann-Trichter und extrahieren Sie die jungfräuliche Erwachsene aus den Pilzkulturen für 2 h, wie in den Schritten 1.2.1 - 1.2.3, und übertragen Sie die Jungfrau erwachsenen Männern und Frauen in zwei getrennte, saubere Petrischalen. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Beobachtung und Videoaufzeichnung von Paarungsverhalten <ol><li> Bereiten Sie mehrere konkave Dias und mit 200 &amp; mgr; l sterilem dd H 2 O zu jedem ihrer Brunnen. </li><li> Pick-up die vorbereitete Jungfrau erwachsenen männlichen oder weiblichen und mit einer Kapillare Nadel und stellen nur eine Nematode in das Wasser jedes konkaven Folie. </li><li> Halten Sie die Jungfrau Erwachsene im Inneren des gut 1 h, damit sie auf die neue wässrige Umgebung anzupassen. </li><li> Paar eine Jungfrau männlich und weiblich von einem von ihnen von einer Vertiefung zur anderen zu übertragen mit einer Pipette. </li><li> Beobachten Sie das Paarungsverhalten der 1♀ + 1♂ Kombination in der konkaven Objektträger unter einem Stereomikroskop. </li><li> Um die Paarungseffizienz von nativem Erwachsene analysieren, berechnen ihre Paarungserfolgsrate (R) und vergleichen Sie es mit dem von zufällig ausgewählten Erwachsenen-Paare. Berechnen R als der Prozentsatz von Replikaten in denen Kopulation beobachtet wurde, verglichen mit der Gesamtzahl der untersuchten Replikaten. </li><li1♀ + 3♂ und 3♀ + 1♂:&gt; Um Paarung Wahl und intra Wettbewerb, Gruppen- und beobachten virgin Nematoden von zwei verschiedenen Kombinationen untersuchen. </li><li> Um Daten für die qualitative und quantitative Analyse zu sammeln, zu filmen das Paarungsverhalten Videomikroskopie. Normalerweise, wenn die ganze Paarungsprozess, von der Zeit, die Nematoden in der Vertiefung des konkaven Schlitten auf den Moment gestellt werden, wenn sie weg nach der Kopulation bewegen, wird innerhalb von 2 h abgeschlossen. Daher nehmen Sie das passende Verfahren kontinuierlich für mindestens 2 h als eine Replikation. Komplette mindestens 30 Wiederholungen insgesamt für jede Kombination. HINWEIS: In steriler dd H 2 O ( in der Regel 50 &amp; mgr; l) alle 0,5 h auf die gut für die Verdampfung während des Aufzeichnungsprozesses zu kompensieren. </li></ol> 3. Datenerfassung <ol><li> Alle Videos sorgfältig auf einem Computer-Bildschirm und zeichnen die Unter Verhaltensweisen qualitativ. </li><li> Messen Sie die Dauer der Paarung mit the Frame-by-Frame-Funktion des Videorecorders. Manuell subtrahieren von dem Endpunkt der Startzeit. </li><li> Für die 1♀ + 1♂ Kombination, analysieren jede Videoaufzeichnung und messen die Dauer der folgenden Ereignisse: <ol><li> Messen Sie die Dauer der Suche (dh die Zeit aus , wenn die weiblichen und männlichen sind in den Brunnen des konkaven Schlitten eingeführt zu dem Moment , sie begegnen und einander berühren). </li><li> Messen der Dauer des In- Kontakt (dh die Zeit vom ersten Kontakt bis zu dem Moment , wenn das männliche genau an der Vulva des Weibchens positioniert ist zum ersten Kopulation). </li><li> Messen der Dauer der Kopulation (dh die Zeit von , wenn das männliche genau an der Vulva des Weibchens positioniert ist , bis er aus dem weiblichen Körper nach der Ejakulation gleitet nach unten). Hinweis: Einige Nematoden mehrmals in 2 h kopulieren können. In solchen Fällen messen die Dauer der Kopulation von der ersten Kopulation bis zum Ende des last ein, einschließlich der Zeit dazwischen. </li><li> Messen Sie die Dauer des Verweilens (dh die Zeit nach der Kopulation , bis die männlichen und weiblichen Bad voneinander entfernt und sind durch einen Abstand von mehr als der Nematoden Körperlänge ( in der Regel 1 mm) getrennt). </li></ol></li><li> Zählen Sie die Kopulation Häufigkeit und Dauer jeder Kopulation und die durchschnittliche Dauer aller Paarungen in 2 h für jede der verschiedenen Kombinationen (dh 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ und 1♀ + 3♂). </li><li> Berechne den Paarungserfolgsrate für den ersten Kontakt (P) für die verschiedenen Kombinationen als die Erfolgsrate der Paarung nach dem ersten Kontakt, der unmittelbar und ohne Unterbrechung durchgeführt wird. In der Kontaktphase kann mehrere Kontakte vor der eigentlichen Kopulation beobachtet werden. <ol><li> Wenn der Abstand zwischen zwei Individuen mehr als die Körperlänge ist, sollten einen Kontakt über sein. Für ein Replikat, Rekord P als 100%, wenn der Kopulation is beobachtet unmittelbar nach dem ersten Kontakt, ohne Pause, oder 0,00%, wenn keine Kopulation beobachtet wurde oder wenn es Kopulation aber nach zwei oder mehrere Kontakte. HINWEIS: Es wurden 30 Wiederholungen für jede Kombination hier beschrieben. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jap.+For.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li>
<li>Sun, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus+was+discovered+in+Sun+Yet-sen%27s+mausoleum+in+Nanjing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jiangsu+Fore.+Sci.+Tech.+%28in+Chinese%29%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing.</a> J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47(1982).</li>
<li>Mota, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+Portugal+and+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe.</a> Nematology. 1, 727-734 (1999).</li>
<li>Robertson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+the+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophlius+Steiner+%26+Buhrer%2C+1934+%28Nickle%2C+1970%29+in+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain.</a> Nematology. 13, 755-757 (2011).</li>
<li>Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pine+wilt+disease%3A+a+threat+to+European+forestry%5BTitle%5D)+AND+%22Euro.+J.+Plant+Path%22%5BJournal%5D)">Pine wilt disease: a threat to European forestry.</a> Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).</li>
<li>Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus%3A+opportunities+in+comparative+genomics+and+molecular+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant.+Path%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions.</a> Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).</li>
<li>Mamiya, Y., Furukawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecundity+and+reproduction+of+Bursaphelenchus+lignicolus%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Nemat%22%5BJournal%5D)">Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus.</a> Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).</li>
<li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Aphelenchoididae%29+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li>
<li>Liu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+features+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+the+mating+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process.</a> Nematology. 16, 895-902 (2014).</li>
<li>Simon, J. M., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+mate+finding+cue+in+the+hermaphrodite+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).</li>
<li>Barr, M. M., Garcia, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+mating+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22The+C.+elegans+Research+Community+Wormbook%22%5BJournal%5D)">Male mating behaviour.</a> The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).</li>
<li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nematol%22%5BJournal%5D)">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Verhaltenstests sind ein grundlegender Aspekt der chemischen Ökologie, Neurobiologie, Molekularbiologie und Genetik. Nematoden und insbesondere C. elegans, sind für ein Studium in diesen Bereichen intensiv genutzt. Das Paarungsverhalten von C. elegans wurde zuvor 10-11 untersucht. Allerdings ist B. xylophilus gonochoristic und unterscheidet sich von den Zwitter C. elegans und seine Paarung hat verschiedene Verhaltensmerkmale 9. Vor kurzem wurde das Paarungsverhal...

Der Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner und Bührer) Nickelle, ist eine der zerstörerischsten invasiven Arten, die das Welken und schließlich den Tod von Kiefern verursacht. Es wird angenommen, dass dieser pathogene Nematode in den USA beheimatet ist, aber er wurde in mehrere Länder transportiert, darunter China, Japan, Südkorea und Portugal. Kürzlich wurde es auch in Spanien gemeldet, das Millionen von Kiefern mit enormen wirtschaftlichen Verlusten tötete und die Waldproduktion und die ökologische Stabilität bedrohte1-5.
Sobald eine Wirtskiefer von Kiefernfadenwürmern befallen ist, vermehren sich Tausende von Millionen Nachkommen schnell im Stamm. Dies führt zu einer Xylemdysfunktion, die zum Welken und schließlich zum Absterben des Wirtsbaumsführt 6. Derzeit gibt es jedoch keine wirksame Möglichkeit, diese Krankheit zu kontrollieren. Das Paarungsverhalten könnte eine wichtige Rolle für die hohe Fruchtbarkeit dieses Fadenwurms spielen7. Wir untersuchten daher das Paarungsverhalten von B. xylophilus im Labor und versuchten, einen effektiven Weg zu finden, um seine Paarung zu stören und seine Fruchtbarkeit zu verringern. 
Dieses Protokoll soll die detaillierten Methoden vorstellen, wie man die jungfräulichen adulten Tiere von B. xylophilus erhält und wie man das Paarungsverhalten mit einem Videorekorder und einem Stereomikroskop beobachtet und analysiert. Dieses Protokoll kann auch als Referenz für Verhaltensstudien an anderen Nematoden verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>B. xylophilusIsolat Nxy61</td><td></td><td></td><td>Extrahiert aus Pinus massoniana in der Gegend von Ningbo in China</td></tr><tr><td>Grauschimmelstamm</td><td></td><td></td><td>Gewonnen von der Forestry Academy of China</td></tr><tr><td>Baermann-Trichter Sengong-Falkenröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Sengong-Zentrifuge <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>steril dd H2O</td><td></td><td></td><td>Sterilisiert durch hohen Dampfdruck bei 121 > C für 30 Min.</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDA medium</td><td>Huankai Bio.</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillare</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica</td><td>LED5000 RL</td><td></td></tr><tr><td>inverses Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>konkave Objektträger</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

beobachtung und quantifizierung der paarungsverhalten in der pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Ein Verfahren zur Beobachtung und das Paarungsverhalten des Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus Quantifizierung wurde unter einem Stereomikroskop etabliert. Um die Paarungseffizienz von B. Xylophilus verbessern und die Chancen der Paarung Beobachtung zu erhöhen, waren virgin Erwachsene kultiviert und verwendet für die Untersuchung. Die Eier wurden, indem sie die Nematoden in Wasser erhalten und damit die Weibchen für 10 min Eier zu legen. Die zweite Stufe Jugendliche (J2) wurden im Dunkeln, und die frühe J4 erhalten wurden bei 25 ° C für 24 h durch Inkubation der Eier synchronisiert durch die J2 Kultivierung mit Grauschimmel Botrytis cinerea, für eine weitere 52 h. Zu diesem Zeitpunkt konnten die meisten J4 Nematoden klar unterschieden werden als männlich oder weiblich ist, ihre Genital Morphologie verwendet wird. Die männlichen und weiblichen J4 wurden gesammelt und kultiviert getrennt in zwei verschiedenen Petrischalen für 24 h virgin erwachsenen Nematoden zu bekommen. Eine Jungfrau männliche und eine jungfräuliche Weibchen wurden in einem Tropfen wat gepaarter in die Vertiefung einer konkaven Folie. Das Paarungsverhalten wurde mit einem Videorecorder unter einem Stereomikroskop gefilmt. Die ganze Periode des Paarungsprozesses war 82,8 ± 3,91 min (Mittelwert ± SE) und konnte in 4 verschiedene Phasen unterteilt werden: die Suche, Kontaktaufnahme, Kopulation und lang anhaltend. Die mittleren Minuten Dauer waren 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 und 7,2 ± 0,5. Elf Unter Verhaltensweisen wurden beschrieben: kreuzen, nähern, begegnen, berühren, hooping, Ortung, Befestigung, ejakulieren, trennen, quiescence und Roaming. Interessanterweise offensichtlich intra sexuellen Wettbewerb wurde beobachtet, wenn ein Weibchen mit 3 Männchen oder ein Männchen mit drei Frauen gruppiert wurde. Dieses Protokoll ist nützlich und wertvoll, nicht nur das Paarungsverhalten von B. xylophilus bei der Untersuchung, sondern auch als Referenz für ethologischer Studien anderer Nematoden in wirken.

Die Paarungserfolgsrate (R) von nativem Erwachsenen war 86,67% im Durchschnitt, was die deutlich höher war als der zufällig ausgewählten Erwachsenen: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, p = 0,0001) (Abbildung 2). Dieser Befund legt nahe , dass es einfacher ist , das Paarungsverhalten von B. xylophilus mit nativem Erwachsenen als bei zufällig ausgewählten Erwachsenen zu beobachten. We...

Ein Protokoll zur Untersuchung des Paarungsverhaltens des Kiefernfadenwurms, Bursaphelenchus xylophilus, wird vorgestellt. Verhaltensmerkmale von B. xylophilus werden im Paarungsprozess beschrieben.

Beobachtung und Quantifizierung der Paarungsverhalten in der Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Paarungsverhalten des Kiefernfadenwurms, Bursaphelenchus xylophilus, zu beobachten. Diese Methode kann dazu beitragen, psychologische Studien über den Fadenwurm voranzutreiben. Sie befasst sich speziell mit der Beobachtung des Paarungsverhaltens des Kiefernfadenwurms.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass jungfräuliche adulte Tiere gewonnen werden können, was es viel einfacher macht, das Paarungsverhalten der adulten Tiere zu beobachten. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich ausschließlich auf die breitere Untersuchung von Nematoden, da sie ein ähnliches Verhalten im Lebenszyklus aufweisen. Denn die Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Erwerb von jungfräulichen adulten Nematoden schwierig ist, da die Einschränkungen durch Entwicklungsnematoden Übung erfordern und es nicht einfach ist, Männchen von Weibchen in jungen Jungtieren im frühen ersten Stadium genau zu unterscheiden.Um Kiefern-Nematoden zu züchten, bereiten Sie zuerst Kartoffel-Dextrose-Agar-Platten vor. Um eine Platte zu impfen, stanzen Sie ein Stück Pilzmatte mit einem Durchmesser von 10 Millimetern aus einer Betritus senaria-Matte und legen Sie es in die Mitte einer neuen PDA-Platte. Kultivieren Sie die Pilzmatte fünf Tage lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln.Nach fünf Tagen geben Sie die Kiefernnematoden in die vorbereitete Petrischale und kultivieren sie drei Tage lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln. Um die Nematoden vom Pilz zu isolieren, bereiten Sie zunächst ein Sammelwerkzeug vor. Legen Sie einen eingespannten Gummischlauch unter einen Trichter und halten Sie den vorbereiteten Trichter in ein Gestell, um das Baermann-Trichtergerät zusammenzubauen.Legen Sie dann zwei Schichten Filterpapier anstelle von Gaze in die Öffnung des Trichters. Übertragen Sie nun die Pilzkulturen in die Trichtereinrichtung und fügen Sie Wasser hinzu, bis die Pilzmatte eingetaucht ist. Nach zwei Stunden kommen die Nematoden aus der Pilzkultur, durchqueren das Filterpapier und setzen sich im untersten Teil des Bärmann-Trichters ab.Sammle die Nematoden, indem du ein 15-Milliliter-Röhrchen unter den Trichter legst und dann langsam die Klemme loslässt, um ein paar Tropfen Wasser zu sammeln, das die Nematoden enthält. Die Nematodensammlungen werden bei 3.000 g zwei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Asparate dann die obere Wasserschicht und suspendiere die Würmer wieder in einem Milliliter Wasser.Füllen Sie die Suspension der Nematoden in eine sechs Zentimeter große Glasschale und fügen Sie drei Milliliter Wasser hinzu, damit die Nematoden frei schwimmen können. Sammle nun Eier, um jungfräuliche Vorräte herzustellen. Stellen Sie das Gericht in einen dunklen Brutkasten und lassen Sie die trächtigen Weibchen 10 Minuten lang Eier legen.Aufgrund ihrer Glykoproteinoberfläche kleben die Eier am Glas. Als nächstes das Wasser mit den Würmern vorsichtig entfernen, um die an der Schüssel haften gebliebenen Eier nicht zu stören. Gib dann schnell wieder 3 Milliliter Wasser in die Schüssel, damit die Eier nicht austrocknen.Wiederholen Sie diesen Vorgang der Reinigung der Eier mindestens dreimal, um alle Larven und erwachsenen Tiere zu entfernen und die reinen Eier zu erhalten. Zu der Sammlung gewaschener reiner Eier fügen Sie fünf Milliliter Wasser hinzu und fahren Sie mit der Entwicklung der Eier im Dunkeln bei 25 Grad Celsius fort. 24 Stunden nach dem Start der Eikultur die geschlüpften J2-Larven einsammeln.Füllen Sie die J2-Larven vorsichtig in ein 15-Milliliter-Röhrchen um. Dann zentrifugieren Sie die Sammlung bei 3.000 g für zwei Minuten. Asparate die obere Wasserschicht und füge 200 Mikroliter Wasser hinzu.Kultivieren Sie dann die J2-Larven auf einer PDA-Platte, die mit einer Pilzmatte vorbereitet ist. Nach 52 Stunden haben sich die meisten J2-Larven zu J4-Larven im Frühstadium entwickelt. Bauen Sie einen Baermann-Trichter zusammen und extrahieren Sie die Nematoden aus den Pilzkulturen für zwei Stunden, wie zuvor beschrieben.Während du wartest, bereite eine Nadel vor, um die Würmer zu pflücken. Ziehe eine Spitze aus einer Glaskapillare, die über einem Alkoholbrenner erhitzt wird. Die Spitze muss einen Durchmesser von etwa 50 Mikrometern haben, was in etwa der Körperbreite eines erwachsenen Fadenwurms entspricht.Nach zwei Stunden werden die J4-Larven wie zuvor beschrieben in eine saubere Petrischale umgefüllt. Bestimmen Sie nun das Geschlecht der Nematoden unter einem Stereomikroskop. Etwa zwei Drittel der Larven sind in der Regel weiblich.Die Vulva des Weibchens unterscheidet sich offensichtlich von der Anatomie des Männchens, aber da die Würmer sehr aktiv sind, erfordert die Geschlechtsbestimmung Übung. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die genaue Unterscheidung und Trennung von Männchen und Weibchen im frühen ersten Stadium. Andernfalls wird es gemischt und schlecht sein, sobald sie erwachsen sind.Und das macht es schwierig, die Paarung zu beobachten. Pflücken Sie nach und nach die Würmer und übertragen Sie sie in einen Wassertropfen auf einer Rutsche für Männchen oder Weibchen. Um den Erfolg zu gewährleisten, sollten zwei verschiedene Personen die Geschlechterzuordnung noch einmal überprüfen.Übertragen Sie nun den Wassertropfen mit den gesexten Würmern auf eine geeignete Pilzkulturplatte. Kultivieren Sie die Jungfrauen dann weitere 24 Stunden, bevor Sie ihr Paarungsverhalten untersuchen. Um das Paarungsverhalten von Kiefernfadenwürmern zu beobachten, bereiten Sie zunächst mehrere konkave Objektträger vor, indem Sie 200 Mikroliter Wasser in jeden ihrer Vertiefungen geben.Wählen Sie als Nächstes einen einzelnen vorbereiteten jungfräulichen Erwachsenen aus und übertragen Sie ihn auf eine vorbereitete Folie. Lassen Sie die jungfräulichen Erwachsenen eine Stunde lang im Schacht, damit sie sich an die neue wässrige Umgebung gewöhnen können. Geben Sie nach einer Stunde mit einer Pipette einen einzelnen jungfräulichen Erwachsenen des anderen Geschlechts in die Vertiefung.Beobachten Sie dann das Paarungsverhalten unter einem Stereomikroskop und filmen Sie das Verhalten für die quantitative Analyse. Der gesamte Paarungsprozess ist in der Regel in zwei Stunden abgeschlossen. Füge alle 30 Minuten 50 Mikroliter Wasser hinzu, um die Verdunstung auszugleichen.Um die Paarungswahl und die intersexuelle Konkurrenz zu untersuchen, gruppieren und beobachten Sie jungfräuliche Nematoden in zwei verschiedenen Kombinationen. Die Paarungserfolgsrate der jungfräulichen Erwachsenen lag bei etwa 87 % und war damit deutlich höher als die der zufällig ausgewählten Erwachsenen. Die Paare brauchten durchschnittlich 83 Minuten, um den gesamten Paarungsprozess abzuschließen, der aus vier verschiedenen Phasen besteht.Suchen, Kontaktieren, Kopulieren und Verweilen. Innerhalb dieser Phasen lassen sich viele spezifische Verhaltensmuster beobachten. Als ein Weibchen auf mehrere Männchen traf, ergab sich eine naheliegende Paarungswahl.Das Weibchen benutzt normalerweise seinen Kopf, um ein Männchen zu berühren, normalerweise am Kopf, am Körper, am Schwanz und im Genitalbereich. Das Weibchen kopulierte dann mit dem Männchen oder verließ es schnell und schwamm zu einem anderen Männchen. Die Paarungserfolgsraten wurden nach dem ersten Kontakt für die verschiedenen Nematodenkombinationen gemessen.Es kam auch zu intersexueller Konkurrenz. Wenn ein jungfräuliches Weibchen mit drei jungfräulichen Männchen vermischt wurde, versuchten die Männchen, sich dem Weibchen so weit wie möglich zu nähern und Kontakt aufzunehmen, um die Chance zu haben, sich mit ihm zu paaren. Wenn die Vulva besetzt war, versuchten die anderen Männchen, den Paarungsprozess durch heftige Körperschwünge oder Schleppen zu stören, um sie zu trennen.Es wurde festgestellt, dass die intersexuelle Konkurrenz der Frauen mehr oder weniger der intersexuellen Konkurrenz der Männer ähnelt. Aufgrund der intersexuellen Konkurrenz waren die Kopulationsfrequenzen mit den verschiedenen Kombinationen signifikant unterschiedlich. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Erforschung der Verhaltensökologie bei Nematoden.Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in 12 Tagen abgeschlossen werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Männchen von Weibchen, den frühen Jungtieren im vierten Stadium, genau zu trennen, um jungfräuliche Erwachsene zu erhalten.

observation-quantification-mating-behavior-pinewood-nematode

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nematoden sind Bodenbewohner-Rundwürmer, die eine Vielzahl von Insekten parasitieren. Wir zeigen, Stichprobenverfahren zur Isolierung dieser Nematoden aus dem Boden mit zwei Techniken: das Insekt Hetze und die modifizierte Weiß Falle, für die Gewinnung von Nematoden aus Bodenproben und infizierten Insektenkadaver auf.

Bodenproben und Isolierung von Nematoden (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Verhaltensassays bieten leistungsstarke Werkzeuge zum Verständnis der neuronalen Funktion. Hier stellen wir mehrere Protokolle zur Quantifizierung des räuberischen Fressverhaltens vor, die beim Modellnematoden Pristionchus pacificus und seinen Verwandten gefunden wurden. Darüber hinaus stellen wir Methoden zur Analyse von räuberischen Fressanpassungen einschließlich Mundstrukturen und Zähnen zur Verfügung.

Die Untersuchung Räuberische Fütterung Behaviors in<em&gt; Pristionchus</em&gt; Und andere Nematoden

Wir zeigen einen Assay, um die ökologischen und genetischen Cues zu analysieren, die das Paarungsverhalten in der Fruchtfliege beeinflussen Drosophila melanogaster .

Eine Methode, um die Wirkung von Umwelteinflüssen auf das Paarungsverhalten zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Die Verwendung eines angepassten "olfaktorischen Chips" für die effiziente Kalzium Imaging von C. Elegans Männchen ist hier beschrieben. Studien über männliche Einwirkung von Glycerin und ein Pheromon werden ebenfalls angezeigt.

Verwenden einen angepasste mikrofluidischen olfaktorische Chip für die Bildgebung neuronaler Aktivität als Reaktion auf Pheromone in männlichen C. Elegans Kopf Neuronen

Mate-Bewachung Verhalten spielt eine wichtige Rolle bei der Fortpflanzung der Gezeitenzone ruderfußkrebsen der Gattung Tigriopus. Methoden für das Studium dieses Verhalten wurden jedoch nicht gut beschrieben. Hier beschreiben wir Methoden für: (1) einzelne Kultur der Jungfrau Tigriopus Tiere und (2) Quantitative Analyse ihres Verhaltens Mate-Bewachung.

Individuelle Kultivierung von Copepoden Tigriopus und Quantitative Analyse ihres Verhaltens Mate-Bewachung

In diesem Protokoll werden Methoden für die Durchführung von Inzucht Kreuze und zur Beurteilung des Erfolgs eines dieser Kreuze, die Ameise Vollenhovia Emeryibeschrieben. Diese Protokolle sind wichtig für Experimente zur Verständnis der genetischen Grundlagen von Geschlecht Bestimmung Systeme in Hymenoptera.

Induktion und Bewertung von Inzucht Kreuze mit Ant, Vollenhovia Emeryi

Sperma muss erfolgreich durch den ovidukt navigieren, um eine Eizelle zu düngen. Hier beschreiben wir einen Test zur Messung der Spermienwanderung innerhalb der C. elegans Hermaphrodite uterus. Dieser Test kann quantitative Daten über die Spermienverteilung innerhalb der Gebärmutter nach der Paarung sowie über Geschwindigkeit, Richtgeschwindigkeit und Umkehrfrequenz liefern.

Messung der Spermienführung und-beweglichkeit innerhalb der Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Hier stellen wir eine detaillierte Einweichmethode der RNA-Interferenz in Bursaphelenchus xylophilus vor, um die Untersuchung von Genfunktionen zu erleichtern.

Anwendung von RNA-Interferenz im Kiefernnematoden, Bursaphelenchus xylophilus

Dieses Protokoll etabliert Methoden zur Extraktion und Quantifizierung von Reaktionen auf das flüchtige Sexualpheromon in C. elegans und stellt Werkzeuge zur Untersuchung der chemischen Kommunikation und Navigationsbahn zur Verfügung.

Extraktion von flüchtigen Sexualpheromonen und Chemoattraction-Assay bei Caenorhabditis elegans

Das Protokoll beschreibt die in vivo und in vitro Kiefernholznematodeninfektion von Pinus pinaster und deren Volatilomanalyse mittels Gaschromatographie (GC) und GC gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS).

Infektion von In vivo und In Vitro Kiefern mit dem Kiefernfadenwurm Bursaphelenchus xylophilus und Isolierung von induzierten flüchtigen Bestandteilen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion der Ausbreitung von Jungtieren im dritten Stadium (Prädauer-Jungtiere, JIII.) von Bursaphelenchus xylophilus in die Kryptobiose durch osmotische Regulation von Kaliumchlorid (KCl)-Ionen. Diese Methode kann die Erforschung der Stressresistenzmechanismen von B. xylophilus technisch unterstützen.

Induktion des Eintritts von Jungtieren aus Bursaphelenchus xylophilus im dritten Stadium der Ausbreitung in die Kryptobiose durch osmotische Regulation

Erfahren Sie die Beobachtung und Quantifizierung des Paarungsverhaltens bei Bursaphelenchus xylophilus. Diese Methode ermöglicht die Gewinnung virginaler Adulte für präzise Verhaltensstudien in der Nematologie.

Beobachtung und Quantifizierung der Paarungsverhalten in der Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Weitere Videos entdecken