Beobachtung und Quantifizierung der Paarungsverhalten in der Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Paarungsverhalten des Kiefernfadenwurms, Bursaphelenchus xylophilus, zu beobachten. Diese Methode kann dazu beitragen, psychologische Studien über den Fadenwurm voranzutreiben. Sie befasst sich speziell mit der Beobachtung des Paarungsverhaltens des Kiefernfadenwurms.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass jungfräuliche adulte Tiere gewonnen werden können, was es viel einfacher macht, das Paarungsverhalten der adulten Tiere zu beobachten. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich ausschließlich auf die breitere Untersuchung von Nematoden, da sie ein ähnliches Verhalten im Lebenszyklus aufweisen. Denn die Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Erwerb von jungfräulichen adulten Nematoden schwierig ist, da die Einschränkungen durch Entwicklungsnematoden Übung erfordern und es nicht einfach ist, Männchen von Weibchen in jungen Jungtieren im frühen ersten Stadium genau zu unterscheiden.

Um Kiefern-Nematoden zu züchten, bereiten Sie zuerst Kartoffel-Dextrose-Agar-Platten vor. Um eine Platte zu impfen, stanzen Sie ein Stück Pilzmatte mit einem Durchmesser von 10 Millimetern aus einer Betritus senaria-Matte und legen Sie es in die Mitte einer neuen PDA-Platte. Kultivieren Sie die Pilzmatte fünf Tage lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln.

Nach fünf Tagen geben Sie die Kiefernnematoden in die vorbereitete Petrischale und kultivieren sie drei Tage lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln. Um die Nematoden vom Pilz zu isolieren, bereiten Sie zunächst ein Sammelwerkzeug vor. Legen Sie einen eingespannten Gummischlauch unter einen Trichter und halten Sie den vorbereiteten Trichter in ein Gestell, um das Baermann-Trichtergerät zusammenzubauen.

Legen Sie dann zwei Schichten Filterpapier anstelle von Gaze in die Öffnung des Trichters. Übertragen Sie nun die Pilzkulturen in die Trichtereinrichtung und fügen Sie Wasser hinzu, bis die Pilzmatte eingetaucht ist. Nach zwei Stunden kommen die Nematoden aus der Pilzkultur, durchqueren das Filterpapier und setzen sich im untersten Teil des Bärmann-Trichters ab.

Sammle die Nematoden, indem du ein 15-Milliliter-Röhrchen unter den Trichter legst und dann langsam die Klemme loslässt, um ein paar Tropfen Wasser zu sammeln, das die Nematoden enthält. Die Nematodensammlungen werden bei 3.000 g zwei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Asparate dann die obere Wasserschicht und suspendiere die Würmer wieder in einem Milliliter Wasser.

Füllen Sie die Suspension der Nematoden in eine sechs Zentimeter große Glasschale und fügen Sie drei Milliliter Wasser hinzu, damit die Nematoden frei schwimmen können. Sammle nun Eier, um jungfräuliche Vorräte herzustellen. Stellen Sie das Gericht in einen dunklen Brutkasten und lassen Sie die trächtigen Weibchen 10 Minuten lang Eier legen.

Aufgrund ihrer Glykoproteinoberfläche kleben die Eier am Glas. Als nächstes das Wasser mit den Würmern vorsichtig entfernen, um die an der Schüssel haften gebliebenen Eier nicht zu stören. Gib dann schnell wieder 3 Milliliter Wasser in die Schüssel, damit die Eier nicht austrocknen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang der Reinigung der Eier mindestens dreimal, um alle Larven und erwachsenen Tiere zu entfernen und die reinen Eier zu erhalten. Zu der Sammlung gewaschener reiner Eier fügen Sie fünf Milliliter Wasser hinzu und fahren Sie mit der Entwicklung der Eier im Dunkeln bei 25 Grad Celsius fort. 24 Stunden nach dem Start der Eikultur die geschlüpften J2-Larven einsammeln.

Füllen Sie die J2-Larven vorsichtig in ein 15-Milliliter-Röhrchen um. Dann zentrifugieren Sie die Sammlung bei 3.000 g für zwei Minuten. Asparate die obere Wasserschicht und füge 200 Mikroliter Wasser hinzu.

Kultivieren Sie dann die J2-Larven auf einer PDA-Platte, die mit einer Pilzmatte vorbereitet ist. Nach 52 Stunden haben sich die meisten J2-Larven zu J4-Larven im Frühstadium entwickelt. Bauen Sie einen Baermann-Trichter zusammen und extrahieren Sie die Nematoden aus den Pilzkulturen für zwei Stunden, wie zuvor beschrieben.

Während du wartest, bereite eine Nadel vor, um die Würmer zu pflücken. Ziehe eine Spitze aus einer Glaskapillare, die über einem Alkoholbrenner erhitzt wird. Die Spitze muss einen Durchmesser von etwa 50 Mikrometern haben, was in etwa der Körperbreite eines erwachsenen Fadenwurms entspricht.

Nach zwei Stunden werden die J4-Larven wie zuvor beschrieben in eine saubere Petrischale umgefüllt. Bestimmen Sie nun das Geschlecht der Nematoden unter einem Stereomikroskop. Etwa zwei Drittel der Larven sind in der Regel weiblich.

Die Vulva des Weibchens unterscheidet sich offensichtlich von der Anatomie des Männchens, aber da die Würmer sehr aktiv sind, erfordert die Geschlechtsbestimmung Übung. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die genaue Unterscheidung und Trennung von Männchen und Weibchen im frühen ersten Stadium. Andernfalls wird es gemischt und schlecht sein, sobald sie erwachsen sind.

Und das macht es schwierig, die Paarung zu beobachten. Pflücken Sie nach und nach die Würmer und übertragen Sie sie in einen Wassertropfen auf einer Rutsche für Männchen oder Weibchen. Um den Erfolg zu gewährleisten, sollten zwei verschiedene Personen die Geschlechterzuordnung noch einmal überprüfen.

Übertragen Sie nun den Wassertropfen mit den gesexten Würmern auf eine geeignete Pilzkulturplatte. Kultivieren Sie die Jungfrauen dann weitere 24 Stunden, bevor Sie ihr Paarungsverhalten untersuchen. Um das Paarungsverhalten von Kiefernfadenwürmern zu beobachten, bereiten Sie zunächst mehrere konkave Objektträger vor, indem Sie 200 Mikroliter Wasser in jeden ihrer Vertiefungen geben.

Wählen Sie als Nächstes einen einzelnen vorbereiteten jungfräulichen Erwachsenen aus und übertragen Sie ihn auf eine vorbereitete Folie. Lassen Sie die jungfräulichen Erwachsenen eine Stunde lang im Schacht, damit sie sich an die neue wässrige Umgebung gewöhnen können. Geben Sie nach einer Stunde mit einer Pipette einen einzelnen jungfräulichen Erwachsenen des anderen Geschlechts in die Vertiefung.

Beobachten Sie dann das Paarungsverhalten unter einem Stereomikroskop und filmen Sie das Verhalten für die quantitative Analyse. Der gesamte Paarungsprozess ist in der Regel in zwei Stunden abgeschlossen. Füge alle 30 Minuten 50 Mikroliter Wasser hinzu, um die Verdunstung auszugleichen.

Um die Paarungswahl und die intersexuelle Konkurrenz zu untersuchen, gruppieren und beobachten Sie jungfräuliche Nematoden in zwei verschiedenen Kombinationen. Die Paarungserfolgsrate der jungfräulichen Erwachsenen lag bei etwa 87 % und war damit deutlich höher als die der zufällig ausgewählten Erwachsenen. Die Paare brauchten durchschnittlich 83 Minuten, um den gesamten Paarungsprozess abzuschließen, der aus vier verschiedenen Phasen besteht.

Suchen, Kontaktieren, Kopulieren und Verweilen. Innerhalb dieser Phasen lassen sich viele spezifische Verhaltensmuster beobachten. Als ein Weibchen auf mehrere Männchen traf, ergab sich eine naheliegende Paarungswahl.

Das Weibchen benutzt normalerweise seinen Kopf, um ein Männchen zu berühren, normalerweise am Kopf, am Körper, am Schwanz und im Genitalbereich. Das Weibchen kopulierte dann mit dem Männchen oder verließ es schnell und schwamm zu einem anderen Männchen. Die Paarungserfolgsraten wurden nach dem ersten Kontakt für die verschiedenen Nematodenkombinationen gemessen.

Es kam auch zu intersexueller Konkurrenz. Wenn ein jungfräuliches Weibchen mit drei jungfräulichen Männchen vermischt wurde, versuchten die Männchen, sich dem Weibchen so weit wie möglich zu nähern und Kontakt aufzunehmen, um die Chance zu haben, sich mit ihm zu paaren. Wenn die Vulva besetzt war, versuchten die anderen Männchen, den Paarungsprozess durch heftige Körperschwünge oder Schleppen zu stören, um sie zu trennen.

Es wurde festgestellt, dass die intersexuelle Konkurrenz der Frauen mehr oder weniger der intersexuellen Konkurrenz der Männer ähnelt. Aufgrund der intersexuellen Konkurrenz waren die Kopulationsfrequenzen mit den verschiedenen Kombinationen signifikant unterschiedlich. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Erforschung der Verhaltensökologie bei Nematoden.

Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in 12 Tagen abgeschlossen werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Männchen von Weibchen, den frühen Jungtieren im vierten Stadium, genau zu trennen, um jungfräuliche Erwachsene zu erhalten.