Eine Methode, um die Wirkung von Umwelteinflüssen auf das Paarungsverhalten zu untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieses Verhaltensassays besteht darin, den Einfluss von Umweltfaktoren auf Fortpflanzungsverhalten wie Balz und Paarung zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Verhaltensbiologie und der Neurogenetik zu beantworten, beispielsweise welche genetischen und umweltbedingten Faktoren auf das Fortpflanzungsverhalten einwirken und welche Mechanismen dieses Verhalten modulieren.

Diese Technik bietet Geschwindigkeit und Flexibilität beim Testen einer breiten Palette von Umweltfaktoren, die die Fortpflanzung beeinflussen, und das bei einer sehr hohen Anzahl von Wiederholungen. Die Durchführung der Methode wird Jenke Gorter, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstrieren.

Beginnen Sie das Experiment mit der Herstellung von einem Liter reichhaltigem Fliegenmedium. Geben Sie einen Liter Leitungswasser in einen zwei Liter fassenden Glasbecher mit einem magnetischen Rührstab und stellen Sie den Becher auf eine magnetische Heizplatte.

Den Rührer ausgeschaltet lassen und die Temperatur auf 300 Grad Celsius erhöhen, bis die Siedetemperatur erreicht ist. Den Rührer einschalten und auf 500 U/min einstellen, dann die Zutaten dem kochenden Wasser zugeben. Warten, bis die Hefe kräftig schäumt.

Danach die Heizplatte auf 120 Grad Celsius herunterregeln. Nach 10 Minuten die Heizplatte auf 30 Grad Celsius absenken und die Mischung unter Rühren abkühlen lassen, bis sie 48 Grad Celsius erreicht hat.

Überwachen Sie die Temperatur, indem Sie ein Thermometer direkt in die Nahrung einfügen. Lösen Sie zwei Gramm Tegosept in 10 Milliliter 96 %igem Ethanol auf. Geben Sie das Gemisch und fünf Milliliter einmolarer Propionsäure zu dem Becher hinzu.

Rühren Sie drei Minuten lang um. Erhitzen Sie eine Nadel in einem Bunsenbrenner bis zur Rotglut. Stechen Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 0,3 Zentimetern auf der Oberseite einer 3,5 Zentimeter mal 1,0 Zentimeter großen Plastik-Petri-Schale.

Bei der Zubereitung des Nährmediums mit geruchsbildenden Verbindungen zunächst 30 Mikroliter der gewünschten Verbindung in die Schale pipettieren, und zwar für die Hälfte der Versuchsschalen. Die andere Hälfte der Schalen zur Vergleichszwecken leer lassen. Mit einer fünf Milliliter-sterilen Pipette drei Milliliter Nährmedium einfüllen, sodass der Boden der Schale bedeckt ist.

Bedecken Sie es mit einem Mulltuch, um Kontaminationen zu vermeiden, und lassen Sie das Medium eine Stunde lang bei Raumtemperatur erstarren. Anschließend setzen Sie die Deckel auf die Schalen und verschließen diese mit Klebeband an zwei Seiten. Bereiten Sie kleine Parafilm-Stopfen vor, um die Öffnungen der Schalen abzudecken, indem Sie Stücke Parafilm zu etwa 0,2 cm dicken Rollen zusammenrollen.

Und schneiden Sie sie dann in Segmente von 0,5 cm Länge. Schneiden Sie zwei kleine Löcher in das Septum, um darin Hahn- und Durchführungsstutzen fest einzusetzen. Bestücken Sie 4,5 cm große Flaschendeckel mit einem 0,32 cm dicken Silikonseptum.

Schließen Sie den kleinen PVC-Schlauch an beide Auslässe, die aus der Flasche austreten, und an nur einen der Einlässe, die in die Flasche führen. Anschließend verbinden Sie jedes YPD-Kulturfläschchen über einen Glasrohr mit dem Auslass unter Verwendung kleiner Schläuche. Füllen Sie den Schlauch mit Glasfaser.

Und sterilisieren Sie es vor der Verwendung im Autoklaven. Wickeln Sie die passgenauen Verschlüsse und Schläuche in Aluminiumfolie ein. Und sterilisieren Sie sie 25 Minuten lang bei 120 Grad Celsius und einem Bar Druck im Autoklaven.

Tauchen Sie eine sterile 100-Mikroliter-Pipettenspitze in eine der Hefe-Kolonien von der YPD-Agarplatte und geben Sie sie in die Flasche mit autoklaviertem YPD-Flüssigmedium. Verschließen Sie diese Flasche mit Hefe und inoculiertem YPD-Flüssigmedium sowie eine YPD-Medium-Kontrollflasche ohne Hefe mit autoklavierten Verschlüssen, die in einer Öffnung befestigt sind. Um eine Kontamination des YPD-Mediums mit Mikroorganismen zu verhindern, verbinden Sie das kleine Schlauchstück mit einem sterilen Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,45 µm, wobei ein kunststoffbeschichteter Steckverbinder am Durchgangsstutzen zum Filter führt.

Und eine Schraub-Plastikdurchführungsverbindung, die den Filter verlässt. Anschließend das Schlauchstück mit dem Einlass der YPD-Kulturflasche verbinden. Die Flaschen auf separate magnetische Platten stellen.

Und rühren Sie die Lösung vor Versuchsbeginn 24 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 100 U/min. Verbinden Sie die Einlässe beider Flaschen mit einem Schlauch, der mit Druckluft verbunden ist. Achten Sie darauf, den Auslass der Flasche mit der Versuchshefe mit einem Schlauch zu verbinden, der den Hefegeruch aus dem Versuchsraum ableitet, um Störungen des Experiments zu vermeiden.

Schließen Sie einen PVC-Schlauch an die Auslassseite des Glasrohrs an und führen Sie ihn zu den unteren Öffnungen der Versuchsbox. Verwenden Sie einen T-Verteiler mit einem Außendurchmesser von mindestens 0,5 cm und kurze Stücke aus dünnem PVC-Schlauch, um je zwei serologische Pipetten an die beiden seitlichen Auslässe anzuschließen. Befestigen Sie die Pipetten mit Klebeband flach auf dem weißen Papierblatt unter den Kameras in der Stahlbox.

Verwenden Sie eine Mundpipette, um ein experimentelles Weibchen um ZT sechs in eine kleine Petrischale zu geben. Lassen Sie die Fliege eine Stunde lang akklimatisieren, bevor sie in die Kopfungsarena übertragen wird. Nach einer Stunde, um ZT sieben, überführen Sie ein Wildtyp-Männchen in die Petrischale.

Und klicken Sie auf „Start Monitoring“ für 24 Stunden. Für das Luftpumpen-Experiment platzieren Sie die Schale so, dass ein Pipettenspitzenausgang mit dem Eingangsloch der Paarungsarena verbunden ist. Um das Paarungsverhalten des Paares zu analysieren, wählen Sie eine Funktion „Alle Bilder öffnen“ in einer Bildbetrachtungssoftware.

Blättern Sie chronologisch durch die Aufnahmen. Tragen Sie das Datum, die Versuchsnummer, die Schalennummer und die Startzeit in eine Tabellenzeile ein. Notieren Sie die Startzeit für jedes Beobachtungsareal ab dem Zeitpunkt, zu dem es unter der Webcam positioniert wird.

Notieren Sie den Zeitstempel aus den Bildern. Markieren Sie die Startzeit jedes Kopulationsvorgangs in derselben Zeile in der Tabellenkalkulation. Zählen Sie eine Paarung als Ereignis, wenn das Männchen das Weibchen bestiegen hat und das Paar mindestens fünf aufeinanderfolgende Bilder lang weitgehend ruhig bleibt und die Körperhaltung beibehält.

Die Analyse von Hefeluft, getrennt für das Nährmedium, zeigt, dass ein Paarungsverhalten nicht auf Hefegerüche reagiert, wenn keine Hefe im Nährmedium vorhanden ist. Allerdings erhöhen sie ihre Paarungshäufigkeit in Hefeluft, wenn Hefe ebenfalls dem Nährmedium zugesetzt wird. Die Weibchenakzeptanz steigt bei Anwesenheit von Essigsäure an.

Doch nur, wenn Pepton im Medium vorhanden ist, was zeigt, dass die Fliegen Aminosäuren und Essigsäure gleichzeitig wahrnehmen müssen, um ihre Paarungshäufigkeit zu erhöhen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von sechs Stunden eingerichtet werden. Und die Verhaltensanalyse kann, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird, innerhalb von fünf Stunden durchgeführt werden.