Eine Methode, um die Wirkung von Umwelteinflüssen auf das Paarungsverhalten zu untersuchen Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Verhaltensassays ist es, die Auswirkungen von Umweltwarteschlangen auf das Fortpflanzungsverhalten, wie z.B. Balz und Paarung, zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Verhaltensbiologie und Eurogenetik zu beantworten. Wie zum Beispiel die Schlussfolgerung genetischer und umweltbedingter Faktoren auf das Fortpflanzungsverhalten und die Mechanismen, die diese Verhaltensweisen moderieren.

Diese Technik bietet Geschwindigkeit und Flexibilität beim Testen einer Vielzahl von Umgebungswarteschlangen, die sich auf die Reproduktion auswirken. Und das bei einer sehr guten Anzahl an Replikaten. Das Verfahren wird von Jenke Gorter, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert.

Beginnen Sie das Experiment, indem Sie einen Liter reichhaltiges Fliegenmedium vorbereiten. Gießen Sie einen Liter Leitungswasser in einen Zwei-Liter-Glasbecher mit magnetischem Rührstab. Und stellen Sie den Becher auf eine magnetische Kochplatte.

Lassen Sie das Rühren aus und drehen Sie die Hitze auf 300 Grad Celsius, bis die Siedetemperatur erreicht ist. Schalten Sie das Rühren auf 500 U/min ein und geben Sie die Zutaten in das kochende Wasser. Warte, bis die Hefe kräftig schäumt.

Drehen Sie dann die Temperatur der Kochplatte auf 120 Grad Celsius herunter. Nach 10 Minuten die Herdplatte auf 30 Grad Celsius herunterdrehen. Und lass die Mischung rühren, bis sie auf 48 Grad Celsius abgekühlt ist.

Überwachen Sie die Temperatur, indem Sie ein Thermometer direkt in das Lebensmittel einführen. Lösen Sie zwei Gramm Tegosept in 10 Milliliter 96%iges Ethanol auf. Mischen Sie die Mischung und fünf Milliliter eines molaren Propionsäures in das Becherglas.

Drei Minuten lang umrühren. Eine Nadel in einem Bunsenbrenner bis zur Rötung erhitzen. Und stechen Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 0,3 Zentimetern in die Oberseite einer 3,5 Zentimeter mal 1,0 Zentimeter großen Petrischale aus Kunststoff.

Bei der Zubereitung von Lebensmittelmedium mit Geruchsstoffen pipettieren Sie zuerst 30 Mikroliter der gewünschten Verbindung in die Schale für 1/2 der Versuchsschalen. Lassen Sie die andere Hälfte der Schalen zum Vergleich leer. Gießen Sie mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette drei Milliliter Lebensmittelmedium auf den Boden der Schale.

Decken Sie es mit einem Käsetuch ab, um eine Kontamination zu vermeiden, und lassen Sie das Medium eine Stunde lang bei Raumtemperatur erstarren. Setze dann einen Deckel auf das Geschirr und klebe die Deckel an zwei Seiten zu. Bereiten Sie kleine Paraffinfilmstopfen vor, um die Löcher des Geschirrs abzudecken, indem Sie Paraffinfilmstücke zu zwei Zentimeter dicken Rollen zum Nullpunkt rollen.

Und dann schneiden Sie sie in Nullkomma-Segmente von fünf Zentimetern. Schneiden Sie zwei kleine Löcher in das Septum, damit die mit Widerhaken versehenen Schottbeschläge passgenau sitzen. Passen Sie offene Flaschenverschlüsse mit vier Komma fünf Zentimetern mit einem Nullkomma drei zwei Zentimeter dicken Silikonseptum an.

Befestigen Sie den kleinen PVC-Schlauch an beiden Auslässen, die aus der Flasche austreten, und nur an einem der Einlässe, die in die Flasche eintreten. Befestigen Sie als Nächstes ein Glasröhrchen mit einem kleinen Schlauch an den Auslass jeder YPD-Kulturflasche. Füllen Sie die Tube mit Glasfaser.

Und autoklavieren Sie es vor dem Gebrauch. Wickeln Sie die angepassten Kappen und Schläuche in Alufolie ein. Und autoklavieren Sie sie 25 Minuten lang bei 120 Grad Celsius und einem bar Druck.

Tauchen Sie eine sterile 100-Mikroliter-Pipettenspitze in eine der Hefekolonien aus der YPD-Agarplatte und geben Sie sie in die autoklavierte YPD-Flüssigmediumflasche. Verschließen Sie diese Hefe- und okulierte YPD-Flüssigmediumflasche sowie eine YPD-Mediumkontrollflasche ohne Hefe mit autoklavierten Kappen, die in einem Auslass montiert sind. Um eine Kontamination des YPD-Mediums mit Mikroorganismen zu verhindern, befestigen Sie den kleinen Schlauch an einem sterilen Spritzenvorsatzfilter mit null Komma vier und fünf Mikrometern, indem Sie einen Kunststoffdruck auf den Schlauchanschluss an der Trennwand drücken und in Richtung Filter führen.

Und eine Schraube an der Kunststoff-Trennwand, die den Filter verlässt. Befestigen Sie dann den Schlauch am Einlass der YPD-Kulturflasche. Stellen Sie die Flaschen auf separate Magnetplatten.

Und rühren Sie die Lösung 24 Stunden lang bei 100 U/min bei Raumtemperatur um, bevor Sie das Experiment beginnen. Verbinden Sie die Einlässe beider Flaschen mit einem Schlauch, der mit Druckluft verbunden ist. Stellen Sie sicher, dass der Auslass der experimentellen Hefeflasche an ein Röhrchen angeschlossen ist, das den Hefegeruch aus dem Versuchsraum ableitet, um eine Störung des Experiments zu vermeiden.

Befestigen Sie einen PVC-Schlauch an der Auslassseite des Glasrohrs und führen Sie diesen zu den unteren Löchern der Experimentierbox. Befestigen Sie mit einem T-Splitter mit einem Außendurchmesser von fünf Zentimetern oder weniger Nullpunkt und kurzen Stücken kleiner PVC-Schläuche zwei serologische Pipetten an jedem der beiden Auslässe auf beiden Seiten. Kleben Sie die Pipetten flach auf das weiße Papierblatt unter den Kameras in die Stahlbox.

Verwenden Sie eine Mundpipette, um ein experimentelles Weibchen in eine kleine Petrischale bei ZT sechs zu legen. Und lassen Sie die Fliege eine Stunde lang an den Paarungsplatz gewöhnen. Nach einer Stunde, bei ZT sieben, wird ein Wildtyp-Männchen in die Petrischale umgesiedelt.

Klicken Sie auf Überwachung für 24 Stunden starten. Für das Luftpumpenexperiment stellen Sie die Schale so auf, dass ein Pipettenauslass mit dem Einflugloch der Paarungsarena verbunden ist. Um das Paarungsverhalten des Paares zu analysieren, wählen Sie alle Bilder in einer Bildbetrachtungssoftware aus und öffnen Sie sie.

Und blättern Sie in chronologischer Reihenfolge durch sie. Notieren Sie das Datum, die Versuchsnummer, die Nummer des Gerichts und die Startzeit in einer Tabelle in derselben Zeile. Nehmen Sie die Startzeit jeder Arena ab dem Moment, in dem sie unter der Webcam-Kamera platziert wird.

Notieren Sie den Zeitstempel aus den Bildern. Markieren Sie die Startzeit jeder Kopulation in derselben Zeile in der Tabellentabelle. Zählen Sie eine Paarung als Vorfall, wenn das Männchen auf das Weibchen gestiegen ist und das Paar mindestens fünf aufeinanderfolgende Frames lang mäßig stationär und in der gleichen Haltung verharrt.

Die Analyse der Hefeluft, getrennt nach Nahrungsmedium, zeigt, dass ein Paarungspaar nicht auf Hefegerüche reagiert, wenn keine Hefe im Nahrungsmedium vorhanden ist. Sie erhöhen jedoch ihre Paarungshäufigkeit in der Hefeluft, wenn dem Nahrungsmedium auch Hefe zugesetzt wird. Die Empfänglichkeit der Weibchen nimmt durch die Anwesenheit von Essigsäure zu.

Aber nur, wenn Pepton im Medium vorhanden ist, was zeigt, dass die Fliegen gleichzeitig Aminosäuren und Essigsäure wahrnehmen müssen, um ihre Paarungsfrequenz zu erhöhen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs Stunden eingerichtet werden. Und die Verhaltensanalyse kann in fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.