Name: Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Erfahren Sie die schnelle neuronale Differenzierung von hiPSCs zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Zelldichte und elektrophysiologische Aufnahmen.

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Die Autoren danken Jessica Classen für die Durchführung der Ganzzell-Patch-Clamp-Experimente. Die hiPSCs, die in unseren Experimenten verwendet wurden, wurden freundlicherweise von Huiqing Zhou und Willem van den Akker von der Radboud Universität Nijmegen zur Verfügung gestellt. Die in diesem Protokoll verwendeten Transfervektoren wurden freundlicherweise von Oliver Brüstle, Philipp Koch und Julia Ladewig vom Universitätsklinikum Bonn zur Verfügung gestellt.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier haben wir ein effizientes hiPSC-Differenzierung Protokoll veröffentlicht von Zhang et al umgesetzt. (2013) 12 , um die Netzwerkaktivität von hiPSC abgeleiteten neuronalen Netzen auf MEAs für die Messung. Wir passten das ursprüngliche Protokoll durch eine rtTA / Ngn2 -positiver hiPSC Linie zu schaffen , bevor die neuronale Differenzierung zu induzieren. Dieser zusätzliche Schritt ermöglicht es, die neuronale Zelldichte auf der MEA zu steuern. Die Kontrolle über die neuronale Dichte war eine wichtige Voraussetzung für das Protokoll zu MEAs Anpassung und für die Gewährleistung der Kohärenz. Auf der Oberseite der MEA - Elektroden 17,18 Um die Aktivität von neuronalen Netzwerken messen MEAs verwenden, müssen die Neuronen dichte Netzwerke direkt zu bilden. Dies erfordert notwendigerweise eine strenge Kontrolle über die Beschichtungs-Dichte der Neuronen. Die rtTA / Ngn2 -positiver hiPSC Linie ermöglicht die Steuerung von Neuronendichte , weil diese Taktik auf akute lentiviralen Transduktionen von hiPSCs verlässt sich nicht vor der Differenzierung;die rtTA / Ngn2 -positiver hiPSC Linie eliminiert somit fast jede Veränderung in der endgültigen Ertrag durch zum Beispiel lentiviralen Toxizität und variable Infektionseffizienz. Ein weiterer kritischer Schritt des experimentellen Verfahrens ist die Anzahl der Ratten-Astrozyten, die mit den Unterscheidungs ​​hiPSCs cokultiviert werden. Astrozyten tragen aktiv zur Verfeinerung neuronale Schaltkreise zu entwickeln durch die Synapsenbildung zu steuern, Wartung und Beseitigung, von denen alle wichtigen Prozesse für die neuronale Funktion sind. Das Protokoll in diesem Papier ist sehr Astrozyten abhängig: zu voll ausgereift und funktionelle Synapsen bilden, die Neuronen benötigen Unterstützung von den Astrozyten. Wir erfahren, dass die Anzahl von Astrozyten der Anzahl der hiPSC abgeleiteten Neuronen in etwa gleich sein sollte, die Reifung der Neuronen und die Bildung von neuronalen Netzwerken aufweist spontane Aktivität zu unterstützen. Da unser Astrozyten Protokoll Ausbeuten Primärzelle culraturen mit einer begrenzten Lebensdauer, hat die Isolierung von Ratten-Astrocyten regelmäßig durchgeführt werden. Unsere Anpassung des Protokolls von Zhang et al. (2013) 12 zur Verwendung mit MEA - Technologie wird wahrscheinlich deutlich verbessern unsere Fähigkeit , die Netzwerkaktivität von hiPSC abgeleitete Netzwerke zu studieren. Zuvor verwendete Protokolle für hiPSC abgeleitete neuronale Netze mit MEAs Studium verließ sich auf zeitraubende Differenzierung Verfahren 13-16. Das Protokoll von Zhang et al. (2013) bietet eine schnelle Alternative, und unsere Modifikation entfernt eine Quelle der Variabilität, die es nun möglich macht mit MEA-Technologie hiPSC abgeleiteten Neuronen in Kombination zu verwenden, vor allem im Hochdurchsatz oder pharmakologische Untersuchungen. Darüber hinaus, weil das Verfahren von Zhang et al. (2013) 12 ergibt eine homogene Population von der oberen Schicht kortikalen Neuronen, unser angepasst Protokoll möglich fokussierte Studien in das Netzwerk ein machtctivity dieser speziellen neuronalen Teilmenge. Nichtsdestoweniger hat dieser Ansatz auch einige Einschränkungen. Erstens kann die Homogenität der Kulturen auch ein Nachteil betrachtet werden, da die Kulturen weniger wahrscheinlich in vivo Netzwerken ähneln, wo verschiedene Klassen von Neuronen (dh inhibitorischen und exzitatorischen Neuronen) ein heterogenes Netzwerk bilden. Um die Nutzung der Technologie hiPSC abgeleiteten Neuronen mit MEA zu verbessern, wird es wichtig sein, eine schnelle (Transgen-basiert) Differenzierungsprotokolle für andere neuronale Zellpopulationen zu entwickeln. Wenn Protokolle verfügbar sind, würden die in - vitro - Netzwerke imitieren in vivo Netzwerke enger. Zweitens gegenwärtig Ratte Astrozyten müssen den hiPSC abgeleiteten Neuronen Wachstums Unterstützung hinzugefügt werden, und daher die sich ergebende neuronale Netzwerk ist kein menschliches neuronales Netz sensu stricto. Zuverlässige Protokolle für hiPSCs in Astrozyten können in Zukunft sol Differenzierungve dieses Problem 26. Drittens zweidimensionale neuronale Netzwerke, wie hier beschrieben, eine begrenzte Modell für komplexe dreidimensionale in vivo neuronalen Netzwerken zu studieren. Glücklicherweise Protokolle dreidimensionale Kulturen von primären Ratten - Neuronen in Kombination mit MEA - Technologie beschreiben , sind bereits verfügbar 27,28. Prospektiv, die Kombination von schnellen Differenzierungsprotokollen zur Gewinnung hiPSC abgeleiteten Neuronen und Astrocyten mit dreidimensionalen Kulturtechniken und MEA-Technologie sollten neue Einblicke in die biologischen Mechanismen der neurologischen Erkrankungen bereitzustellen.

Die Entwicklung der menschlichen pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) Differenzierungsprotokolle induzierten menschlichen Neuronen in vitro zu erzeugen , ein leistungsfähiges neues Werkzeug für das Studium neurologischen Erkrankungen zur Verfügung gestellt hat. Bis vor kurzem wurde die Studie dieser Störungen durch den Mangel an Modellsystemen unter Verwendung von humanen Neuronen stark behindert. Obwohl Nagern verwendet werden können , neurologischen Störungen zu untersuchen, können die Ergebnisse solcher Studien nicht leicht auf den Menschen 1 übersetzt werden. Angesichts dieser Einschränkungen sind hiPSC abgeleiteten Neuronen eine vielversprechende Alternative Modell , das verwendet werden kann , zugrundeliegenden molekularen Mechanismen , neurologischen Erkrankungen aufzuklären und für in - vitro - Wirkstoff - Screening. In den letzten zehn Jahren mehrere Protokolle zu konvertieren hiPSCs in Neuronen 2-8 entwickelt. Allerdings sind diese Protokolle immer noch in vielerlei Hinsicht beschränkt. Zunächst werden die Protokolle oft zeitraubend: Erzeugen von Neuronen mit ausreichender Reifung (dh SYNAPse - Bildung) und funktionelle Aktivität erfordert Monate Kultivierungsverfahren, die groß angelegte Studien schwierig 9 macht. Zusätzlich ist hiPSC-to-Neuron-Umwandlungswirkungsgrad niedrig ist. Protokolle ergeben häufig eine heterogene Population von Neuronen und damit erlauben keine Studien von spezifischen Untergruppen von neuronalen Zellen. Darüber hinaus sind die Protokolle nicht reproduzierbar, unterschiedliche Ergebnisse für unterschiedliche iPSC Linien 10,11 ergibt. Schließlich sind die Reifungsstufe und funktionellen Eigenschaften der resultierenden Neuronen auch variable 10. Zur Bewältigung dieser Probleme, Zhang et al. (2013) 12 entwickelt ein Protokoll , das schnell und reproduzierbar menschlichen Neuronen aus hiPSCs erzeugt durch den Transkriptionsfaktor Neurogenin-2 überexprimieren. Wie von den Autoren berichtet, tritt Differenzierung relativ schnell (nur 2 - 3 Wochen nach der Expression von Neurogenin-2 induziert), ist das Protokoll reproduzierbaren (neuronale Eigenschaften sind unabhängig von den starting hiPSC Linie) und die hiPSC-to-neuron Umwandlung ist sehr leistungsfähig (fast 100%). Die Population von Neuronen erzeugt mit ihren Protokoll homogen (ähnlich der oberen Schicht kortikalen Neuronen), so dass die Untersuchung von Zelltyp-spezifischen Beiträge zur neuronalen Störungen. Darüber hinaus ihre hiPSC abgeleiteten Neuronen zeigten reifen Eigenschaften (zB auf die Fähigkeit , Synapsen und robuste funktionelle Aktivität bilden) nach nur 20 d. Charakterisieren der elektrophysiologischen Eigenschaften von hiPSC abgeleiteten Neuronen auf der Netzebene ist eine wichtige Voraussetzung, bevor hiPSC Technologie kann für die Untersuchung von menschlichen Krankheiten genutzt werden. Aus diesem Grund haben sich viele Forschungsgruppen vor kurzem begonnen Stamm-Zellen abgeleiteten Neuronen auf der Netzebene unter Verwendung von Mikroelektroden - Array (MEA) Geräte (Multichannel Systems, Reutlingen, Deutschland) 13-16 zu untersuchen. Die Elektroden einer MEA in einem Substrat eingebettet ist, auf dem neuronalen Zellen kultiviert werden können.MEAs können die elektrophysiologischen Eigenschaften von neuronalen Netzwerken und der in vitro Entwicklung ihrer Aktivität zu erforschen verwendet werden. Derzeit sind MEAs nur in Verbindung mit Differenzierungsprotokollen verwendet, die mehrere Monate dauern, reifen Netzwerke zu erhalten. Daher sollte MEAs mit einer schnelleren Differenzierung Protokoll Kombination der Verwendung dieser Technologie in großen Studien von neurologischen Erkrankungen erleichtern. Hier stellen wir eine Modifikation der Zhang et al. (2013) 12 Protokoll und passen sie für den Einsatz auf MEAs. Insbesondere anstatt auf akuter lentiviralen Transduktion angewiesen, wir geschaffen anstelle hiPSC Linien, stabil rtTA / Ngn2 vor Differenzierung zu induzieren. Wir haben dies vor allem reproduzierbare Kontrolle über die neuronale Zelldichte zu haben, da die neuronale Zelldichte kritisch für die neuronale Netzwerkbildung ist, und für einen guten Kontakt zwischen den Neuronen und den Elektroden der MEA 17,18. Although die Zhang et al. Protokoll ist sehr effizient im Hinblick auf Umwandlung von transduzierten hiPSCs ist es von Natur aus variabel in Bezug auf die endgültige Ausbeute von Neuronen aus der Anzahl der hiPSCs zunächst vernickelt (Abbildung 2E in Zhang et al sehen.) 12. Mit einer stabilen Linie, beseitigen wir viele Fragen Variabilität verursachen, wie lentivirale Toxizität und Infektionseffizienz. Wir optimiert dann die Parameter , die zuverlässig hiPSC abgeleitete neuronale Netze auf MEAs produzieren, Netzwerk - Reifung zu erhalten (zB synchrone Ereignisse eine Mehrheit der Kanäle beteiligt) von der dritten Woche. Diese schnelle und zuverlässige Protokoll sollte direkte Vergleiche zwischen den Neuronen aus verschiedenen (dh patientenspezifische) hiPSC Linien sowie bieten robuste Konsistenz für pharmakologische Studien abgeleitet ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Lebovitz's L-15 medium</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+frei HBSS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (fötales Rinderserum)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>70 & Mikro; m Zell-Sieb</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 lentiviraler Verpackungsvektor</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G lentiviraler Verpackungsvektor</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>Basalmembranmatrix</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Lösung zur Zellablösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>E8 Medium</td><td>Gibco</td><td>A1517001 ROCK-Inhibitor</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>A2644501&nbsp;</td><td>Alternativ können ROCK-Inhibitoren wie Thiazovivin verwendet werden.</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>6-well MEAs</td><td>Multi Channel Systems</td><td>60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckgläser</td><td>VWR</td><td>631-0899</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-5G</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>NT-3, human rekombinant</td><td>Promokine</td><td>C66425</td><td></td></tr><tr><td>BDNF, humanes rekombinantes</td><td>Promokine</td><td>C66212</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanyl-L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Cytosin &beta;-D-Arabinofuranosid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Pinzette mit feiner Spitze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251</td><td></td></tr><tr><td>Federschere mit feiner Spitze&nbsp;</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle neuronale differenzierung von induzierten pluripotenten stammzellen zur messung der netzwerkaktivität auf micro-elektroden-arrays

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen abgeleitet induziert (hiPSCs) eine viel versprechende neue Werkzeug für neurologische Erkrankungen zu studieren. In den letzten zehn Jahren wurden viele Protokolle für hiPSCs in Neuronen differenzieren entwickelt. Jedoch sind diese Protokolle oft langsam mit hoher Variabilität, geringe Reproduzierbarkeit, und die geringe Effizienz. Darüber hinaus sind die mit diesen Protokollen erhalten Neuronen sind oft unreif und keine angemessene funktionelle Aktivität sowohl an den Einzelzellen-und Netzebenen, wenn die Neuronen für mehrere Monate kultiviert werden. Teilweise aufgrund dieser Einschränkungen sind die funktionellen Eigenschaften von hiPSC abgeleiteten neuronalen Netzwerke noch nicht gut charakterisiert. Hier passen wir einen kürzlich veröffentlichten Protokoll , das die Produktion von menschlichen Neuronen aus hiPSCs durch erzwungene Expression des Transkriptionsfaktors neurogenin-2 12 beschreibt. Dieses Protokoll schnelle wird (wodurch man reifen Neuronen innerhalb von 3 Wochen) und effizient, mit fast 100% Wirkungsgrad von TRANSDUCed Zellen (&gt; 95% der DAPI-positive Zellen sind MAP2 positiv). Weiterhin ergibt das Protokoll eine homogene Population von exzitatorischen Neuronen, die die Untersuchung von Zelltyp-spezifischen Beiträge zu neurologischen Erkrankungen erlauben würden. Wir modifiziert das ursprüngliche Protokoll, das von stabil transduzierten hiPSC Zellen zu erzeugen, uns explizite Kontrolle über die Gesamtzahl der Neuronen geben. Diese Zellen werden dann verwendet, hiPSC abgeleiteten neuronalen Netzwerken auf Mikroelektrodenarrays zu erzeugen. Auf diese Weise kann die spontane elektrophysiologischen Aktivität von hiPSC abgeleiteten neuronalen Netzen gemessen und charakterisiert werden, während interexperimental Konsistenz in Bezug auf die Zelldichte zu halten. Das vorgestellte Protokoll ist breit anwendbar, insbesondere für mechanistische und pharmakologische Studien an humanen neuronalen Netzen.

Hier haben wir erfolgreich ein modifiziertes Protokoll , bei dem hiPSCs differenziert werden direkt in kortikalen Neuronen durch Überexpression der Transkriptionsfaktor Neurogenin-2 12 und wir haben es für die Verwendung von MEAs angepasst. Dieser Ansatz ist schnell und effizient ermöglicht es uns, funktionelle Neuronen und Netzwerk-Aktivität bereits in der dritten Woche nach der Induktion der Differenzierung zu erhalten. Während des Verlaufs des Differenzierungsprotokoll begannen die Zellen morphologisch Neurone zu ähneln: small Prozesse gebildet wurden und Neuronen gestartet miteinander (1A) zu verbinden. Wir haben eine neurophysiologische Profil der abgeleiteten Neuronen von einer gesunden Kontrolle hiPSC Linie, durch ihre neuronale Morphologie und synaptische Eigenschaften während der Entwicklung zu messen. hiPSC abgeleiteten Neuronen wurden gefärbt für MAP2 und Synapsin-1/2 an verschiedenen Tagen nach dem StartDifferenzierungs (2A). Die abgeleiteten Neuronen zeigen reife neuronale Morphologie bereits 3 Wochen nach der Induktion der Differenzierung. Die Anzahl der Synapsin-1/2 puncta (ein Maß für die Anzahl der Synapsen) basierte auf Synapsin-1 quantifiziert / 2 Immunzytochemie Anfärbungen. Die Anzahl der Synapsin-1/2 puncta Laufe der Zeit erhöht, was darauf hindeutet , dass das Niveau der neuronalen Konnektivitäts auch (2B) zunimmt. Die Anzahl der Synapsin-1/2 puncta 23 Tage nach der Induktion der Differenzierung war ähnlich in zwei unabhängigen IPS Leitungen (2C). Bei 23 DIV meisten synapsin1 / 2 puncta wurden nebeneinander auf PSD-95 puncta, die für funktionelle Synapsen (2D) anzeigt. In Übereinstimmung mit den von Zhang et al beschriebenen Ergebnisse. Erwirtschafteten wir eine Bevölkerung von erregenden oberen Schicht kortikalen Neuronen, bestätigt durch pan-neuronalen und Subtyp-spezifischen kortikalen m arkers wie BRN2 und SATB2 (Schicht II / III). Wir nicht beobachten Neuronen , die für tiefe Schicht Neuronen CTIP2 (Schicht V) oder FOXP2 (Schicht VI) (Abbildung 2E und F) positiv waren Um die elektrophysiologische Aktivität der hiPSC abgeleiteten Neuronen zu charakterisieren, verwendeten wir Ganzzellstrom und voltage clamp Aufnahmen, dh intrinsische Eigenschaften und erregenden Eingang auf diese Neuronen wurden während der Entwicklung gemessen. Die Neuronen konnten Aktionspotentiale bereits eine Woche nach der Differenzierung und der Prozentsatz der Spick - Zellen zu erzeugen , wurde im Laufe der Zeit zu erhöhen (Abbildung 2G und H). Darüber hinaus erhielt die Neuronen exzitatorischen synaptischen Eingangs bereits eine Woche nach der Induktion der Differenzierung: both Frequenz und Amplitude des exzitatorischen synaptischen Eingangs erhöht während der Entwicklung (2I - K). nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "&gt; Um besser zu verstehen , wie Single-Zell - Aktivität Netzwerk-Level - Funktionen zu bilden , kombiniert, ist es wichtig zu untersuchen , wie Neuronen im Konzert arbeiten In vitro neuronale Netze kultiviert auf MEAs. bilden einen wertvollen experimentellen Modell die neuronalen Dynamik für das Studium. aufgezeichnet Wir haben 20 min von elektro Netzwerk - Aktivität von Neuronen aus einer gesunden Kontrolle hiPSC Linie kultiviert abgeleitet auf 6-Well - MEAs (Abbildung 2 M). Nur wenige Wochen nach der Induktion der Differenzierung, die Neuronen die von gesunden Kontrolle hiPSCs funktionell aktive neuronale Netzwerke gebildet, die zeigen , spontane Ereignisse (0,62 ± 0,05 Spike / s; Abbildung 2 n). In diesem Stadium der Entwicklung (dh 16 d nach Beginn der Differenzierung) keine synchrone Ereignisse alle Kanäle beteiligt . der MEAs (Abbildung 2 O) erfasst werden erhöht die Höhe der Netzwerkaktivität während der Entwicklung: in der vierten Woche nach t er Induktion der Differenzierung, die neuronalen Netzwerke zeigten hohe spontane Aktivität (2,5 ± 0,1 Spike / s, Figur 2N) in alle Vertiefungen der Vorrichtung. Die Netzwerke auch synchron zeigten Netzwerk Bursts (4,1 ± 0,1 Burst / min, Abbildung 2 O) mit langer Dauer (2100 ± 500 ms). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg"> Abbildung 1: hiPSC Differenzierung in Neurone. A. Drei Zeitpunkte hiPSCs Differenzierung in Neuronen auf Deckgläsern. B. Beschichtung von hiPSCs auf MEAs. C. Astrozyten bei 100% Konfluenz in T75 - Kolben (beachten Sie, dass die Zellen eine tessellated einschichtigen bilden). Maßstabsbalken: 150 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg"> Abbildung 2. hiPSC abgeleiteten Neurone Charakterisierung. A. hiPSC abgeleiteten Neuronen wurden für MAP2 (grün) und Synapsin-1 gefärbt / 2 (rot) an verschiedenen Tagen nach Beginn der Differenzierung. Maßstabsbalken: 10 &amp; mgr; m. B. Quantifizierung von Synapsin puncta in zwei unabhängigen Experimenten. In jedem Experiment mindestens 10-Zellen wurden analysiert. C. Quantifizierung von Synapsin puncta bei DIV23 in Neuronen aus zwei unabhängigen IPS Linien abgeleitet. D. hiPSC abgeleiteten Neuronen wurden für PSD-95 (grün) gefärbt und Synapsin-1/2 (rot) 23 Tage nach dem Beginn der Differenzierung. Synapsin puncta nebeneinander angeordnet sind, um PSD-95 puncta. E. hiPSC abgeleiteten Neuronen wurden für MAP2 (grün) und BRN2 (rot) oder SATB2 (rot) 23 d nach Beginn der Differenzierung gefärbt. F. Prozentsatz der MAP2 positiven Zellen,für angezeigt Marker positiv waren. G. Repräsentative Stromzangenaufnahmen , die Aktionspotentiale zeigen können so früh wie 7 d nach Beginn der Differenzierung erzeugt werden. H. Prozentsatz an Zellen an verschiedenen Tagen nach der Induktion der Differenzierung , die ein oder mehrere Aktionspotentiale zeigen. I. Repräsentative Spuren von exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) erhielt von hiPSC abgeleiteten Neuronen an verschiedenen Tagen nach der Differenzierung. J. Häufigkeit der exzitatorischen postsynaptischen Ströme während der Entwicklung. K. Amplitude von exzitatorischen postsynaptischen Ströme während der Entwicklung. L. Repräsentative Spuren von EPSC Aufnahmen ohne (Kontrolle) und mit CNQX (CNQX). M. Neurons , abgeleitet von einem hiPSC Linie wurden auf einer 6-Well - MEA und Netzwerkaktivität wird für hiPSC abgeleiteten neuronalen Netze 16 und 23 d nach der Induktion der Differenzierung dargestellt. Die Aktivität aufgezeichnet vonjede Vertiefung (Abtastrate von 10 kHz) mit einer anderen Farbe angezeigt wird (5 min 20 min des Aufnahme sind gezeigt). N. Feuerrate 16 und 23 d nach der Induktion der Differenzierung. O. Bursting Rate 16 und 23 d nach der Induktion der Differenzierung. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Angesichts der Ergebnisse, die Qualität der resultierenden hiPSC abgeleiteten Neuronen kann durch eine neurophysiologischen Profil der Zellen beurteilt werden. Das heißt, drei bis vier Wochen nach dem Beginn der Differenzierung, der Morphologie, Synapsin-1/2-Expression und der Elektrophysiologie der Neuronen beurteilt werden. Zu diesem Zeitpunkt werden die hiPSC abgeleiteten Neuronen erwartet, dass eine neuronale artige Morphologie zu zeigen, MAP2, Synapsin / PSD-95 positiv, wenn die Durchführung Immuncytochemie zu sein, und zu exhibit spontane elektrophysiologische Aktivität (sowohl auf der Single-Cell-und Netzwerk-Ebene).

Wir modifizieren und Umsetzung eines bereits veröffentlichten Protokoll beschreibt die schnelle, reproduzierbare und effiziente Differenzierung von humanen 12 pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) in exzitatorischen kortikalen Neuronen induziert. Insbesondere ermöglicht unsere Modifikation zur Steuerung neuronaler Zelldichte und der Verwendung auf Mikroelektrodenarrays elektrophysiologischen Eigenschaften auf Netzwerkebene zu messen.

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Das übergeordnete Ziel dieses neuronalen Differenzierungsprotokolls ist es, neuronale Netzwerke aus den humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zu generieren, die auf Mikroelektrodenarrays auf einer schnellen und kontrollierten Weise wachsen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen in den Neurowissenschaften zu beantworten. Es kann verwendet werden, um biologische Mechanismen zu untersuchen, die neurologischen Störungen zugrunde liegen, aber es kann auch verwendet werden, um grundlegendere neurobiologische Fragen zu beantworten.Der Hauptvorteil dieser Technik ist die schnelle und kontrollierte Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Neuronen. Am ersten Tag DMEM/F12, CDS und E8 medium mit 1 % Penicillin-Streptomycin auf Raumtemperatur erwärmen. Als nächstes fügen Sie Doxycyclin zum E8-Medium hinzu, um eine Endkonzentration von vier Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen, und fügen Sie dann der Mischung einen Gesteinsinhibitor hinzu.Aspirieren Sie das verbrauchte Medium der RTTANGN2 positiven hiPS-Zellen und fügen Sie den Zellen einen Milliliter CDS hinzu. Anschließend inkubieren Sie die Zellen drei bis fünf Minuten lang in einem befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator. Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen voneinander lösen.Geben Sie dann zwei Milliliter DMEM/F12 in die Vertiefung. Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette und geben Sie sie dann in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie anschließend sieben Milliliter DMEM/F12 in die Zellsuspension und drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200 x g.Nach fünf Minuten wird der Überstand abgesaugt und zwei Milliliter des vorbereiteten E8-Mediums zugegeben. Dissoziieren Sie hiPS-Zellen, indem Sie die Spitze einer 1.000-Mikroliter-Pipette gegen die Seite des 15-Milliliter-Röhrchens legen und die Zellen vorsichtig resuspendieren. Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen dissoziiert sind.Bestimmen Sie dann die Anzahl der Zellen pro Milliliter mit einem Hämozytometer. Für die sechs Vertiefungen MEAs verdünnen Sie die Zellen, um eine Zellsuspension von 7,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter zu erhalten. Für die Deckgläser verdünnen Sie die Zellen, um eine Zellsuspension von viermal 10 bis zu den vierten Zellen pro Milliliter zu erhalten.Aspirieren Sie das verdünnte Laminin aus den Deckgläsern und den sechs Vertiefungs-MEAs. Für die MEAs mit sechs Vertiefungen plattieren Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter Zellsuspension in den aktiven Elektrodenbereich in jeder Vertiefung geben. Plattieren Sie dann die Zellen, indem Sie 500 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung der 24-Well-Platte geben.Legen Sie als Nächstes die MEAs mit sechs Vertiefungen oder die 24-Well-Platte in einen befeuchteten Inkubator mit 37 Grad Celsius. Geben Sie nach zwei Stunden vorsichtig 500 Mikroliter des vorbereiteten E8-Mediums in jede Vertiefung der sechs Vertiefungs-MEAs. Anschließend stellen Sie die sechs MEAs über Nacht in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator.Erwärmen Sie am dritten Tag 0,05 % Trypsin-EDTA auf Raumtemperatur. DPBS und DMEM/F12 mit 1%Penicillin Streptomycin auf 37 Grad Celsius erwärmen. Aspirieren Sie dann das verbrauchte Medium der Ratten-Astrozytenkultur.Waschen Sie die Kultur, indem Sie fünf Milliliter DPBS hinzufügen und vorsichtig herumschwenken. Anschließend DPBS aspirieren und fünf Milliliter 0,05 %Trypsin-EDTA hinzufügen. Schwenken Sie das Trypsin-EDTA vorsichtig herum.Dann inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator für fünf bis 10 Minuten. Prüfen Sie anschließend unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen abgelöst haben. Löse die letzten Zellen, indem du ein paar Mal auf den Kolben drückst.Anschließend werden fünf Milliliter DMEM/F12 in den Kolben gegeben. Versuchen Sie, die Zellen im Kolben mit einer 10-Milliliter-Pipette vorsichtig zu bewerten. Sammeln Sie anschließend die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen.Drehen Sie die Tube acht Minuten lang bei 200 x g. Danach aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in einem Milliliter DMEM/F12. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter mit einem Hämozytometer.Fügen Sie als Nächstes 7,5 mal 10 zu den vierten Astrozyten zu jeder Vertiefung der sechs Vertiefungs-MEAs hinzu. Und fügen Sie zweimal 10 zu den vierten Astrozyten zu jeder Vertiefung der 24-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator.Erfassen Sie die Daten mit einer 1.200-fachen Verstärkung und tasten Sie das Signal mit der MCS-Datenerfassungskarte bei 10 Kilohertz ab. Zeichnen Sie 20 Minuten elektrophysiologische Aktivität von hiPSC-abgeleiteten Neuronen auf, die auf MEAs kultiviert wurden. Halten Sie während der Aufzeichnung die Temperatur bei 37 Grad Celsius und verhindern Sie die Verdunstung des Mediums und pH-Veränderungen, indem Sie einen konstanten langsamen Fluss von befeuchtetem Gas auf die MEAs abgeben.Analysieren Sie danach die Daten mit einem benutzerdefinierten Softwarepaket. Diese Abbildung zeigt die Expressionsänderungen von neuronalen Markern MAP2 in Synapsin während des Differenzierungsprozesses, was auf eine neuronale Reifung hinweist. Diese Grafik zeigt, dass die Synapsin-Expression für einzelne Zellen gemessen wird, die während des Differenzierungsprozesses erhöht ist.Das Synapsin, das nach dreiwöchiger Differenzierung in den Zellen exprimiert wird, kolokalisiert mit PSD-95, was auf das Vorhandensein von funktionellen Synapsen hinweist. Hier wurde eine Ganzzell-Patch-Clamp zu verschiedenen Zeitpunkten während des Differenzierungsprozesses durchgeführt, um die elektrophysiologische Aktivität der Zellen zu messen. Die Zellen waren in der Lage, Aktionspotentiale zu den verschiedenen Zeitpunkten zu erzeugen.Und der im Laufe der Zeit erhöhte Prozentsatz der Spiking-Zellen zeigt, dass die Mehrheit der Zellen in der Lage ist, Aktionspotentiale zu erzeugen, selbst in der Frühphase der Differenzierung. Die Patch-Klemme wurde auch verwendet, um die exzitatorischen postsynaptischen Ströme zu messen, die von den Zellen empfangen wurden. Die Anzahl der Eingaben, die die Zellen erhalten, nimmt während des Differenzierungsprozesses zu.Sowohl die Frequenz als auch die Amplitude der exzitatorischen postsynaptischen Ströme nahmen während des Differenzierungsprozesses zu. Während des Differenzierungsprozesses wurde die elektrophysiologische Aktivität der auf Mikroelektrodenarrays differenzierten Zellen gemessen. Hier nahm die Aktivität des neuronalen Netzwerks während des Differenzierungsprozesses zu und zeigte nach 23 Tagen synchrone Ereignisse.Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um induzierte pluripotente Stammzellen innerhalb von drei bis vier Wochen in funktionsfähige neuronale Netzwerke zu differenzieren. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, steril zu arbeiten und die Zellen schonend zu behandeln. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie pharmakologische Tests verwendet werden, um den Phänotyp, der in den Zelllinien der Patienten beobachtet wurde, zu retten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, um Netzwerkaktivitätsdefekte bei neurologischen Erkrankungen offiziell zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man pluripotente Stammzellen schnell und kontrolliert in Neuronen induziert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt die Entwicklung einer 3D-Neuronenkultur, die mit einem planaren Mikroelektrodenarray mit Hippocampus-Neuronen gekoppelt ist. Die isolierten Neuronen bilden ein 2D-Netzwerk auf der aktiven Fläche des Mikroelektrodenarrays und haften an Glasmikrokügelchen in einer Multi-Well-Platte mit einem Membraneinsatz. Nach der Übertragung dieser mit Neuronen beschichteten Mikrokügelchen auf die Elektrode organisieren sie sich zu einem miteinander verbundenen neuronalen 3D-Netzwerk.

Aufbau dreidimensionaler neuronaler Netzwerke, die an Mikroelektrodenarrays gekoppelt sind

Das Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung exzitatorischer kortikaler Neuronen aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs). Bei der Induktion von Doxycyclin exprimieren die hiPSCs Neurogenin-2, einen neuronalen spezifischen Transkriptionsfaktor. Durch die Verwendung spezifischer Medien und die Co-Kultivierung mit Astrozyten erleichtert dieser Prozess die Differenzierung der hiPSCs in Neuronen mit synaptischen Verbindungen.

Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen in Neuronen auf Mikroelektroden-Arrays

Das Video zeigt, wie man ein Mikroelektrodenarray (MEA) verwendet, um die elektrophysiologische Aktivität von Neuronen aufzuzeichnen, die aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) stammen. Die elektrophysiologische Aktivität eines Multiwell-MEA, das eine Neuron-Astrozyten-Co-Kultur enthält, wird aufgezeichnet, um Aktionspotentiale von mehreren Neuronen im Netzwerk zu detektieren und die erfolgreiche Differenzierung von hiPSCs in Neuronen zu bestätigen.

Messung der elektrophysiologischen Aktivität neuronaler Netzwerke mit Hilfe von Mikroelektrodenarrays

Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll, um in vitro modulare Netzwerke aus räumlich beschränkt, funktionell miteinander verbundenen neuronalen wachsen. Eine Polymermaske zum Strukturieren einer Proteinschicht verwendet, um die zelluläre Adhäsion über die Kultivierungssubstrat zu fördern. Vernickelt Neuronen wachsen auf beschichteten Bereiche Gründung spontane Verbindungen und elektrophysiologische Aktivität zeigen.

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Erfahren Sie die schnelle neuronale Differenzierung von hiPSCs zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Zelldichte und elektrophysiologische Aufnahmen.

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays (Video) | JoVE Journal

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

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