Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Wir modifizieren und Umsetzung eines bereits veröffentlichten Protokoll beschreibt die schnelle, reproduzierbare und effiziente Differenzierung von humanen ¹² pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) in exzitatorischen kortikalen Neuronen induziert. Insbesondere ermöglicht unsere Modifikation zur Steuerung neuronaler Zelldichte und der Verwendung auf Mikroelektrodenarrays elektrophysiologischen Eigenschaften auf Netzwerkebene zu messen.

Das übergeordnete Ziel dieses neuronalen Differenzierungsprotokolls ist es, neuronale Netzwerke aus den humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zu generieren, die auf Mikroelektrodenarrays auf einer schnellen und kontrollierten Weise wachsen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen in den Neurowissenschaften zu beantworten. Es kann verwendet werden, um biologische Mechanismen zu untersuchen, die neurologischen Störungen zugrunde liegen, aber es kann auch verwendet werden, um grundlegendere neurobiologische Fragen zu beantworten.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist die schnelle und kontrollierte Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Neuronen. Am ersten Tag DMEM/F12, CDS und E8 medium mit 1 % Penicillin-Streptomycin auf Raumtemperatur erwärmen. Als nächstes fügen Sie Doxycyclin zum E8-Medium hinzu, um eine Endkonzentration von vier Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen, und fügen Sie dann der Mischung einen Gesteinsinhibitor hinzu.

Aspirieren Sie das verbrauchte Medium der RTTANGN2 positiven hiPS-Zellen und fügen Sie den Zellen einen Milliliter CDS hinzu. Anschließend inkubieren Sie die Zellen drei bis fünf Minuten lang in einem befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator. Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen voneinander lösen.

Geben Sie dann zwei Milliliter DMEM/F12 in die Vertiefung. Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette und geben Sie sie dann in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie anschließend sieben Milliliter DMEM/F12 in die Zellsuspension und drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200 x g.

Nach fünf Minuten wird der Überstand abgesaugt und zwei Milliliter des vorbereiteten E8-Mediums zugegeben. Dissoziieren Sie hiPS-Zellen, indem Sie die Spitze einer 1.000-Mikroliter-Pipette gegen die Seite des 15-Milliliter-Röhrchens legen und die Zellen vorsichtig resuspendieren. Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen dissoziiert sind.

Bestimmen Sie dann die Anzahl der Zellen pro Milliliter mit einem Hämozytometer. Für die sechs Vertiefungen MEAs verdünnen Sie die Zellen, um eine Zellsuspension von 7,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter zu erhalten. Für die Deckgläser verdünnen Sie die Zellen, um eine Zellsuspension von viermal 10 bis zu den vierten Zellen pro Milliliter zu erhalten.

Aspirieren Sie das verdünnte Laminin aus den Deckgläsern und den sechs Vertiefungs-MEAs. Für die MEAs mit sechs Vertiefungen plattieren Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter Zellsuspension in den aktiven Elektrodenbereich in jeder Vertiefung geben. Plattieren Sie dann die Zellen, indem Sie 500 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung der 24-Well-Platte geben.

Legen Sie als Nächstes die MEAs mit sechs Vertiefungen oder die 24-Well-Platte in einen befeuchteten Inkubator mit 37 Grad Celsius. Geben Sie nach zwei Stunden vorsichtig 500 Mikroliter des vorbereiteten E8-Mediums in jede Vertiefung der sechs Vertiefungs-MEAs. Anschließend stellen Sie die sechs MEAs über Nacht in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator.

Erwärmen Sie am dritten Tag 0,05 % Trypsin-EDTA auf Raumtemperatur. DPBS und DMEM/F12 mit 1%Penicillin Streptomycin auf 37 Grad Celsius erwärmen. Aspirieren Sie dann das verbrauchte Medium der Ratten-Astrozytenkultur.

Waschen Sie die Kultur, indem Sie fünf Milliliter DPBS hinzufügen und vorsichtig herumschwenken. Anschließend DPBS aspirieren und fünf Milliliter 0,05 %Trypsin-EDTA hinzufügen. Schwenken Sie das Trypsin-EDTA vorsichtig herum.

Dann inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator für fünf bis 10 Minuten. Prüfen Sie anschließend unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen abgelöst haben. Löse die letzten Zellen, indem du ein paar Mal auf den Kolben drückst.

Anschließend werden fünf Milliliter DMEM/F12 in den Kolben gegeben. Versuchen Sie, die Zellen im Kolben mit einer 10-Milliliter-Pipette vorsichtig zu bewerten. Sammeln Sie anschließend die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen.

Drehen Sie die Tube acht Minuten lang bei 200 x g. Danach aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in einem Milliliter DMEM/F12. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter mit einem Hämozytometer.

Fügen Sie als Nächstes 7,5 mal 10 zu den vierten Astrozyten zu jeder Vertiefung der sechs Vertiefungs-MEAs hinzu. Und fügen Sie zweimal 10 zu den vierten Astrozyten zu jeder Vertiefung der 24-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator.

Erfassen Sie die Daten mit einer 1.200-fachen Verstärkung und tasten Sie das Signal mit der MCS-Datenerfassungskarte bei 10 Kilohertz ab. Zeichnen Sie 20 Minuten elektrophysiologische Aktivität von hiPSC-abgeleiteten Neuronen auf, die auf MEAs kultiviert wurden. Halten Sie während der Aufzeichnung die Temperatur bei 37 Grad Celsius und verhindern Sie die Verdunstung des Mediums und pH-Veränderungen, indem Sie einen konstanten langsamen Fluss von befeuchtetem Gas auf die MEAs abgeben.

Analysieren Sie danach die Daten mit einem benutzerdefinierten Softwarepaket. Diese Abbildung zeigt die Expressionsänderungen von neuronalen Markern MAP2 in Synapsin während des Differenzierungsprozesses, was auf eine neuronale Reifung hinweist. Diese Grafik zeigt, dass die Synapsin-Expression für einzelne Zellen gemessen wird, die während des Differenzierungsprozesses erhöht ist.

Das Synapsin, das nach dreiwöchiger Differenzierung in den Zellen exprimiert wird, kolokalisiert mit PSD-95, was auf das Vorhandensein von funktionellen Synapsen hinweist. Hier wurde eine Ganzzell-Patch-Clamp zu verschiedenen Zeitpunkten während des Differenzierungsprozesses durchgeführt, um die elektrophysiologische Aktivität der Zellen zu messen. Die Zellen waren in der Lage, Aktionspotentiale zu den verschiedenen Zeitpunkten zu erzeugen.

Und der im Laufe der Zeit erhöhte Prozentsatz der Spiking-Zellen zeigt, dass die Mehrheit der Zellen in der Lage ist, Aktionspotentiale zu erzeugen, selbst in der Frühphase der Differenzierung. Die Patch-Klemme wurde auch verwendet, um die exzitatorischen postsynaptischen Ströme zu messen, die von den Zellen empfangen wurden. Die Anzahl der Eingaben, die die Zellen erhalten, nimmt während des Differenzierungsprozesses zu.

Sowohl die Frequenz als auch die Amplitude der exzitatorischen postsynaptischen Ströme nahmen während des Differenzierungsprozesses zu. Während des Differenzierungsprozesses wurde die elektrophysiologische Aktivität der auf Mikroelektrodenarrays differenzierten Zellen gemessen. Hier nahm die Aktivität des neuronalen Netzwerks während des Differenzierungsprozesses zu und zeigte nach 23 Tagen synchrone Ereignisse.

Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um induzierte pluripotente Stammzellen innerhalb von drei bis vier Wochen in funktionsfähige neuronale Netzwerke zu differenzieren. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, steril zu arbeiten und die Zellen schonend zu behandeln. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie pharmakologische Tests verwendet werden, um den Phänotyp, der in den Zelllinien der Patienten beobachtet wurde, zu retten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, um Netzwerkaktivitätsdefekte bei neurologischen Erkrankungen offiziell zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man pluripotente Stammzellen schnell und kontrolliert in Neuronen induziert