Design, Oberflächenbehandlung, Cellular-Überzug und Kultivierung von Modular Neuronale Netze Bestehend aus Funktionell mit Inter-Schaltungen
15. April 2015
Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll, um in vitro modulare Netzwerke aus räumlich beschränkt, funktionell miteinander verbundenen neuronalen wachsen. Eine Polymermaske zum Strukturieren einer Proteinschicht verwendet, um die zelluläre Adhäsion über die Kultivierungssubstrat zu fördern. Vernickelt Neuronen wachsen auf beschichteten Bereiche Gründung spontane Verbindungen und elektrophysiologische Aktivität zeigen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, in vitro modulare Netzwerke zu züchten, die aus räumlich begrenzten, funktionellen, miteinander verbundenen neuronalen Schaltkreisen bestehen. Dies wird erreicht, indem zunächst die PDMS-Schablonen so vorbereitet werden, dass sie eine Proteinschicht strukturieren, um die zelluläre Adhäsion auf dem Kultivierungssubstrat zu fördern. Der zweite Schritt besteht darin, die Kultursubstrate zu reinigen.
Speziell die Oberflächen von Petrischale, Deckgläsern und Multi-Elektroden-Arrays. Anschließend werden die PDMS-Schablonen auf dem Kultivierungssubstrat abgeschieden und die gewünschten adhäsiven Proteinschichtmuster erstellt. Der letzte Schritt ist die Beschichtung der neuronalen Gliazellen.
Letztendlich werden Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnungen und Kalzium-Bildgebung verwendet, um die Dynamik der erreichten modularen neuronalen Netzwerke zu zeigen. Diese Methode kann helfen, wichtige offene Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. die Untersuchung der Dynamik der Kommunikation zwischen neuronalen Anordnungen, und es wird experimentelle Bedingungen entgegenwirken. Polymethylsoan oder PDMS wird hergestellt, indem zuerst ein Teil Härter mit 10 Teilen Basismittel gemischt wird.
Bringen Sie die Mischung nach fünf Minuten Mischen für 15 Minuten in eine Vakuumkammer. Überprüfen Sie nach 15 Minuten, ob Blasen vorhanden sind, und geben Sie die Lösung für weitere 15 Minuten in die Kammer zurück. Bereiten Sie als Nächstes einen Wafer auf dem Spin-Coder vor.
Öffnen Sie die Gasknöpfe für Stickstoffgas. Legen Sie einen Wafer auf den Spinner und fixieren Sie ihn mit dem Vakuum. Gießen Sie dann eine dünne Schicht PDMS über den Wafer.
Schleudern Sie den Wafer eine Minute lang mit PDMS bei 1000 U/min, um eine 100 Mikrometer dicke PDMS-Beschichtung auf dem Wafer zu erzeugen. Anschließend überführen Sie den Wafer auf eine heiße Platte bei 100 Grad Celsius. Lass es dort 30 Minuten backen.
Nachdem das PDMS ausgehärtet ist, verwenden Sie eine Pipette, um die Schablonenränder mit mehr PDMS zu umranden. Dann backen Sie das hinzugefügte PDMS auf den Wafer. Wenn die PDMS-Ränder ausgehärtet sind, schneiden Sie wie zuvor die Schablone entlang der Ränder ab und ziehen Sie die Silikonschablone vom Wafer ab, um RINs zu starten.
Der 23 Millimeter große quadratische Glasdeckel wird mit destilliertem Wasser befüllt, gefolgt von 70 % Ethanol, dann Aceton, dann Isopropanol und schließlich destilliertem Wasser. Trocknen Sie die Quadrate wieder unter einem Stickstoffgasstrom. Drücken Sie anschließend vorsichtig eine PDMS-Musterschablone auf jeden Deckglas.
Legen Sie die Deckgläser mit den Schablonen für 15 Minuten in eine Vakuumkammer. Nach dem Vakuumieren geben Sie einen Milliliter PDL auf die Schablonen und bringen Sie die Baugruppen für 20 Minuten in die Vakuumkammer zurück. Wiederholen Sie den 20-minütigen Vakuumzyklus einmal und lassen Sie das PDL dann am nächsten Tag über Nacht trocknen.
Bereiten Sie die Petrischalen vor, die die Netzwerkzellen stützen werden. Erste. 3,5 Zentimeter große Schalen zwei Stunden lang mit einem Milliliter PDL abdecken. Entfernen Sie später bei Raumtemperatur die PDL durch Aspiration aus der Schale.
Spülen Sie dann das Geschirr mit destilliertem Wasser ab und lassen Sie es trocknen. Sobald eine Schale getrocknet ist, geben Sie eine kleine Menge Silikonfett entsprechend den vier Ecken des Abdeckglases in die Schüssel. Legen Sie die Deckgläser mit dem PDMS nach oben auf die Schale und drücken Sie sie vorsichtig nach unten, um sicherzustellen, dass sie befestigt sind.
Zupfen Sienun A-P-D-M-S vorsichtig von den Deckgläsern und lassen Sie das PDL-Muster übrig. Zum Schluss sterilisieren Sie das Geschirr, indem Sie es sieben Minuten lang der UV-Strahlung aussetzen. Reinigen Sie zuerst das Multi-Elektroden-Array, indem Sie es unter Leitungswasser waschen, und beschallen Sie es dann mit einem konzentrierten enzymatischen Reinigungsmittel.
Wiederholen Sie diese Schritte dreimal. Dann beschallen Sie das MEA dreimal in reinem destilliertem Wasser und danach unter einer Haube. Waschen Sie den MEA vorher mit destilliertem Wasser.
Sterilisieren Sie es 30 Minuten lang mit UV-Licht. Bereiten Sie als Nächstes zuerst das unterstützende Netzwerk vor. Gießen Sie PDMS in eine 12- oder 24-Well-Platte.
Sobald das PDMS ausgehärtet ist, entfernen Sie es mit einer Nadel. Schneide nun Löcher in die Mitte der Scheiben, um Ringe zu machen, die als Formstütze dienen. Platzieren Sie nun eine Formstütze in der Mitte der MEA und decken Sie die äußere freiliegende Oberfläche der MEA ab.
Lassen Sie dies zwei Stunden lang im Zimmer ruhen. Saugen Sie dann die PDL-Waschung, die äußere freiliegende Oberfläche der MEA, mit destilliertem Wasser ab und entfernen Sie die Formstütze, damit die MEA trocknen kann. Befestigen Sie nun eine Schablone an einem präparierten Mikromanipulator unter einem inversen Mikroskop.
Prüfen und richten Sie die gemusterte Struktur so aus, dass sie mit den Elektroden des MEA übereinstimmt. Verwenden Sie dann den Mikromanipulator, um die Schablone auf die MEA-Oberfläche abzusenken. Heben Sie nach dem Anbringen den Mikrom-Manipulator an und üben Sie bei Bedarf mit einer Pinzette einen kleinen Druck aus, um zu verhindern, dass sich das PDMS löst.
Übertragen Sie nun das MEA für 15 Minuten in die Vakuumkammer. Tragen Sie dann einen Milliliter PDL auf die Schablone auf und kehren Sie für zwei Zyklen von 20 Minuten in die Vakuumkammer zurück. Lassen Sie das PDL am nächsten Tag über Nacht trocknen.
Entfernen Sie die P DM S Schablonen mit einer Pinzette aus dem Messgerät. Zum Schluss sterilisieren Sie die Messungen sieben Minuten lang mit UV-Strahlung. Anschließend sind sie bereit für die Zellen in Aufbereitungskulturzellen und bereiten Suspensionen vor, wie es im Textprotokoll steht.
Nachdem Sie die erforderliche Anzahl von Zellen mit Resus aufgehängt haben, plattieren Sie sie in der Mitte des gemusterten Bereichs auf dem MEA- oder Deckglas. Ein MEA sollte mit 100 Mikrolitern Volumen und einem Deckglas beladen werden. Platz für 1000 Mikroliter.
Inkubieren Sie die Plattenzellen 40 Minuten lang und fügen Sie dann alle vier Tage Beschichtungsmedium hinzu, um die Zellen zu erhalten. Fügen Sie wieder frisches, ergänztes Wachstumsmedium hinzu. Nach dem sechsten oder siebten Tag sollten sich an diesem Punkt neuronale Verbindungen zwischen den Modulen bilden.
Verdünnen Sie das Kulturmedium mit einem Antimitotikum, um ein Überwachsen der Gliazellen zu verhindern. Nach vier Tagen in vitro ist es möglich zu beobachten, dass Neuronen, die innerhalb des PD DL befestigt sind, nach 14 Tagen Flecken von 600 Mikrometern im Quadrat kodieren. In der Kultur stellten Neuronen spontan eine Verbindung innerhalb der Module und zwischen den Modulen her, die aktive funktionelle Netzwerke bilden.
Neuronale Schaltkreise von 300 Mikrometern im Quadrat wurden beobachtet, indem die PDMS-Merkmalsgröße bei gleicher Beschichtungskonzentration beibehalten wurde. Die Kalziumbildgebung wurde unter Verwendung eines Forex-Objektivs durchgeführt, um die Aktivität in den kultivierten Netzwerken breit zu erfassen. Zwischen den grünen und rosa Modulen ist eine größere Anzahl von Verbindungen zu sehen, während die blauen und roten Module weniger mit den anderen Modulen verbunden sind.
Ein Roster-Plot der Calcium-Ereignisse wird für einen Film gezeigt, der bei 30 Hertz mit einem Bild von 1 Million Pixeln aufgenommen wurde. Grüne und rosa Module waren hochgradig synchronisiert, während die blauen und roten Module weniger synchron waren. Ein kortikales modulares Netzwerk, das aus drei verschiedenen Schaltkreisen besteht, wurde nach 21 Tagen in vitro aufgezeichnet.
Mit Hilfe eines MEA wurde festgestellt, dass neuronale Schaltkreise im Abstand von etwa 600 Mikrometern miteinander verbunden sind. Ihre elektrophysiologische Aktivität wurde rekonstruiert. Unter Verwendung eines präzisen Timing-Spike-Detection-Algorithmus wurde ein Roster-Plot von fünf Minuten dieser Daten mit farbcodierten Cluster-Daten erstellt.
Dies bietet einen Vergleich der Aktivitäten des gesamten Netzwerks und eines einzelnen Clusters und gibt Einblick in die Synchronität innerhalb des Clusters. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man PDM-Schablonen vorbereitet und sie verwendet, um die Adhäsion von Neurogliazellen zu modellieren, was zur Etablierung eines funktionellen modalen Netzwerks führt.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Kultivierung modularer Netzwerke aus räumlich begrenzten, funktional miteinander verbundenen neuronalen Schaltkreisen im Reagenzglas. Dies wird erreicht, indem PDMS-Schablonen hergestellt werden, um eine Proteinschicht auf dem Kultivierungsuntergrund zu strukturieren, die die Zelladhäsion fördert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Elektrophysiologie
Hintergrund
- In-vitro-Neuronalnetzwerke sind unerlässlich, um die neuronale Konnektivität zu untersuchen.
- Die räumliche Einschränkung neuronaler Schaltkreise kann die funktionelle Vernetzung verbessern.
- Die zelluläre Adhäsion ist entscheidend für ein erfolgreiches neuronales Wachstum.
- PDMS-Schablonen werden häufig zum Musterungszwecke in der Zellkultur verwendet.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Erstellung modularer neuronaler Netzwerke in vitro.
- Untersuchung der elektrophysiologischen Eigenschaften dieser Netzwerke.
- Herstellung spontaner Verbindungen zwischen platzierten Neuronen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von PDMS-Schablonen für die Proteinmusterung.
- Reinigung von Kultivierungsuntergründen wie Petrischalen und Deckgläsern.
- Aufbringen von PDMS-Schablonen auf den Untergrund, um adhesive Muster zu erzeugen.
- Ausplattieren von neuronalen Gliazellen auf dem strukturierten Untergrund.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Einrichtung räumlich begrenzter neuronaler Schaltkreise.
- Nachweis spontaner Verbindungen zwischen Neuronen.
- Elektrophysiologische Aktivität in den kultivierten Netzwerken beobachtet.
- Validierung des Protokolls für zukünftige Studien zur neuronalen Konnektivität.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll erzeugt effektiv modulare neuronale Netzwerke in vitro.
- Räumliche Einschränkung verbessert die funktionelle Vernetzung.
- Diese Methode kann für weitere elektrophysiologische Untersuchungen genutzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Diese in-vitro-modulare Methode für neuronale Netzwerke ermöglicht eine präzise räumliche Kontrolle neuronaler Verbünde und unterstützt die mechanistische Risikominderung bei der Zielvalidierung für die Arzneimittelforschung in der Neurowissenschaft. Durch die Einrichtung funktionell miteinander verbundener Schaltkreise mit quantifizierbaren elektrophysiologischen und Calcium-Bildgebungs-Auslesemethoden liefert der Ansatz eine vorhersagbare Zuverlässigkeit in Assays zur neuronalen Vernetzung. Er begegnet einer zentralen Herausforderung im Entdeckungsstadium: der Modellierung der Dynamik von Gehirnschaltkreisen, um die Wirkung von Substanzen auf die Netzwerksynchronität und -kommunikation zu bewerten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Modulation des Abstands zwischen Kompartimenten zur Regulierung der Synchronisation zwischen Modulen.
- Praktischer Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System zur Beurteilung der Zielinteraktion mittels spontaner Bildung neuronaler Schaltkreise und funktioneller Netzwerke.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messungen der abhängigen Variablen mittels Mehrfachelektroden-Aufzeichnungen und Kalzium-Bildgebung, um die Dynamik der Netzwerkaktivität zu bewerten.
- Operativer Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays durch reproduzierbare PDMS-Schablonenstrukturierung und Ablagerung von Proteinschichten für eine gleichmäßige Zelladhäsion.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine translationale Biomarker-Abstimmung, indem die Verbindungsdichte mit dem Auftreten von Synchronisation korreliert wird, und ermöglicht so risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Kontinuität präklinischer Modelle, indem die Beobachtung der Bildung neuronaler Verbindungen nach 6–7 Tagen in vitro und deren Stabilisierung bis zum 14. Tag ermöglicht wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie die Hypothesenprüfung neuronaler Kommunikationsdynamiken ermöglicht, wobei die Ergebnisse direkt zur Leitstruktur-Identifizierung durch Profilierung der Netzwerkaktivität beitragen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Wegen, indem eine gezielte Untersuchung ermöglicht wird, wie die Verbindungsdichte die Synchronisation zwischen Modulen in modularen Netzwerken reguliert.
- Screening: Gewährleistet die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Oberflächenbehandlungs- und Zellansäteprotokolle, die eine reproduzierbare neuronale Anheftung an PDL-mustergestaltete Bereiche sicherstellen.
- Analytik: Bietet elektrophysiologische Spikenerkennung und Messung des Beginns von Kalziumereignissen, die einen quantitativen Vergleich der intra- und inter-cluster-Synchronität unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet sich mit der präklinischen Validierung, indem sie die spontane Bildung funktioneller Netzwerke zeigt, die den Kommunikationsprinzipien von Schaltkreisen in vivo entsprechen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert eine wiederverwendbare Methode zur Mustergestaltung neuronaler Netzwerke auf Substraten (Deckgläsern, MEAs), um wiederholte Screening-Kampagnen und Target-Validierungsstudien zu unterstützen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung neuronaler Zielstrukturen, indem ein kontrollierbares System bereitgestellt wird, um zu untersuchen, wie die strukturelle Topologie die funktionelle Konnektivität beeinflusst.
- Operativer Wert: Steigert die Reproduzierbarkeit durch vakuumunterstütztes PDL-Coating und UV-Sterilisationsschritte, die eine konsistente Oberflächenvorbereitung über verschiedene Experimente hinweg sicherstellen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem Dosis-Wirkungs-Tests von Wirkstoffen hinsichtlich der Netzwerksynchronität ermöglicht werden und damit biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien bei der ZNS-Wirkstoffentwicklung verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem verbindungsabhängige Synchronisationsschwellenwerte quantifiziert werden, die zur mechanistischen Risikominderung bei neuronalen Zielstrukturen beitragen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Herstellung mikrofluidischer Schablonen, der neuronalen Zellkultur sowie in elektrophysiologischen/optischen Ableittechniken.
- Setzt den Zugang zu Beschichtungsanlagen für Dünnschichten, Vakuumkammern, UV-Sterilisatoren, Multielektrodenarrays und Kalzium-Bildgebungssystemen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich Schablonendesign, Proteinbeschichtungsprotokollen und Zellausplattierungsdichten, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für unterschiedliche neuronale Subtypen oder Gliazell-Kokultivierungsverhältnisse, um die Netzwerkstabilität zu bewahren und Überwucherung zu verhindern.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Notwendigkeit einer präzisen Ausrichtung der Schablone zu den MEA-Elektroden sowie die Abhängigkeit der Schaltkreisabmessungen von der Strukturgröße des PDMS (z. B. 300 Mikrometer große quadratische Module).
