Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, humane pluripotente Stammzellen oder H-PSCs unter Verwendung eines Multi-Titer-Plattenformats in Neuronen zu differenzieren. Dies wird durch die Ernte und Beschichtung einer einzelligen Suspension von H-PSCs in den V-Boden 96 erreicht. Well-Platten, um über Nacht Embryokörper oder EBS zu bilden.

Als nächstes werden die EBS in U-förmige ultra-niedrige Attachment-Platten überführt, die ein Differenzierungsmedium enthalten, um die Neuroektodermbildung zu induzieren. Anschließend werden die EBS auf mit Matrigel beschichtete Schalen plattiert, um das Wachstum von Neuronen zu fördern. Es können Ergebnisse erzielt werden, die das Vorhandensein typischer neuronaler Marker um den achten Tag herum durch Immunfluoreszenz zeigen.

Färbeprotokolle zur Differenzierung humaner präpotenter Stammzellen in Neuronen sind oft kompliziert und langwierig. Eher zufällig. Wir sind auf ein sehr einfaches Verfahren gestoßen, um Neuronen aus menschlichen präpotenten Stammzellen herzustellen.

Aus technischer Sicht besteht der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden darin, dass sie einfach durchzuführen, schnell und kostengünstig ist. Gleichzeitig wird das Verfahren von Dr. MI Z aus dem Labor vorgestellt. Bereiten Sie das EB-Bildungsmedium und das Differenzierungsmedium vor, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Züchten Sie h PSCs unter feederfreien Bedingungen, wie z. B. einem Meth-konditionierten Medium auf Matrigel-beschichteten Platten oder unter Verwendung chemisch definierter Kultursysteme unter subkonfluenten aktiven Wachstumsbedingungen. Bei Verwendung eines Stereomikroskops mit einer sterilen Pipettenspitze aus Kunststoff werden spontan differenzierte Kolonien mechanisch entfernt. Die verbleibenden undifferenzierten Kolonien werden mit PBS gewaschen und Accutane mit einem x Gesteinsinhibitor zur Verdauung in einzelne Zellen verwendet.

Die einzelnen Zellen werden durch Zentrifugation bei 200 G für zwei Minuten pelletiert und in einem kleinen Volumen EB-Bildungsmedium suspendiert. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um den Zelltiter zu bestimmen. Fügen Sie dem verbleibenden EB-Bildungsmedium weitere Zellen hinzu, um einen Titer zwischen 40.000 und 80.000 Zellen pro Milliliter zu erhalten.

Mit einer Mehrkanalpipette werden 100 Mikroliter pro Vertiefung auf eine 96-V-Bodenplatte übertragen, was zu 4.000 bis 8.000 Zellen pro Gefäß führt. Brunnen. Drehen Sie die Platte in einer hochschwenkbaren Plattenzentrifuge bei 400 g für eine Minute, um alle Zellen am Boden der Vertiefungen zu sammeln. Übertragen Sie die Zellen in einen Inkubator und lassen Sie EBS am nächsten Tag über Nacht unter dem Stereomikroskop entstehen.

Sammeln Sie EBS und geben Sie es in einem kleinen Volumen in eine 3,5 Zentimeter große Bakterienschale, die zwei Milliliter Differenzierung enthält. Mittel. Waschen Sie die Zellen, indem Sie die Schüssel vorsichtig drehen. Fügen Sie 100 Mikroliter Differenzierungsmedium zu jeder Vertiefung eines extrem niedrigen Anhangs hinzu.

Untere 96-Well-Platte unter einem Stereomikroskop. Übertragen Sie EBS in kleinen Mengen aus dem Spülgeschirr in die 96-HE-Vertiefungen. Inkubieren Sie das EBS vier Tage lang, um die Neuroektodermbildung am vierten Tag zu ermöglichen.

Waschen Sie die Zellen in Differenzierungsmedium und säen Sie sie nacheinander in die Vertiefungen einer mit Matrigel beschichteten Multititerplatte, wie z. B. einer 12-Well-Platte. Die Zellen sollten gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt sein, um ein ungestörtes Auswachsen der Neuronen zu ermöglichen. Lassen Sie das EBS etwa 10 Minuten lang bei Raumtemperatur locker am Matrigel anhaften.

Übertragen Sie dann die Platte vorsichtig in den Inkubator. Neuronen werden innerhalb der nächsten vier Tage radial aus dem plattierten EBS herauswachsen. Zuvor haben wir gezeigt, dass EBS aus H-PSCs im Einklang mit vielen anderen einfach durch Replatination von Aggregaten nach routinemäßiger Aufspaltung von H-HPCs in Schalen mit geringer Bindung erzeugt werden kann.

Daraus ergibt sich in der Regel eine weite Verteilung der Zellgrößen. Ein weiteres Problem besteht darin, dass EBS, die in Suspension gehalten werden, dazu neigen, miteinander zu aggregieren, was zu einer noch größeren Heterogenität führt, um dies zu umgehen. Es wurden einzelne H-PSCs in Vertiefungen mit geringer Bindung plädiert, was zu keiner EB-Bildung und zum Zelltod führte. Die Kombination des Zellüberlebensmoleküls Y 2 7 6 3 2 mit Polyvinylalkohol, von dem gezeigt wurde, dass es die EB-Bildung aus HSCs fördert, ermöglichte es jedoch, EBS über Nacht aus einzelligen HESC-Suspensionen zu bilden.

Praktischerweise konnten die EB-Größen in diesem Multi-Titerplatten-Format streng kontrolliert werden, indem eine unterschiedliche Anzahl von Zellen pro Vertiefung platziert wurde. Im Gegensatz zur Verwendung herkömmlicher Techniken wurde die Neuroektodermbildung nach der Übertragung von EBS auf 96-U-Platten mit extrem geringer Bindung mit einem kleinen Molekülcocktail induziert, der aus F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA two und BP SMA one Inhibitoren bestand, die es dann ermöglichten, die Zellen auf Matrigel zu plattieren, um Neuronen entstehen zu lassen. Die Initiierung der EB-Bildung von etwa 8.000 Zellen ergab die beste neuronale Differenzierungskapazität, die durch ausgeprägte neuronale Auswüchse aus den plattierten EBs gekennzeichnet ist.

Reduzierte nekrotische EB-Zentren nach dem Plattieren und hohe Expression von sensorischen und panneuronalen Markern wie B rrn drei A und beta drei Tubulin. Die Gesamteffizienz der neuronalen Differenzierung scheint vergleichbar mit dem ursprünglichen Verfahren zu sein, das bisher sowohl auf HSCs als auch auf HI-PSCs anwendbar ist. Drei unabhängige HPSC-Linien, sowohl HES- als auch HIPS-Zellen, wurden erfolgreich im Multi-Well-Verfahren getestet, wobei zelllinienabhängige Variabilität und Differenzierungseffizienzen generell nicht ausgeschlossen werden können.

Diese Abbildung zeigt an einem Tag dissoziierte vier neuroektodermale Zellen, die als Einzelzellen plattiert und erfolgreich mit einem Wirkungsgrad von etwa 60 % differenziert wurden. Der Umgang mit EBS auf der Multi-Titer-Plattform erfordert am Anfang ein wenig Training, aber nach einiger Zeit werden Sie sehen, dass es recht einfach ist.