Protokoll zur Differenzierung von human induzierten pluripotenten Stammzellen in Mischkulturen von Neuronen und Glia für Neurotoxizitätstests

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neurale Stammzellen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellkolonien gewonnen wurden, in Mischkulturen aus neuronalen und glialen Zellen zu differenzieren. Dieses Modell eignet sich für das Screening von Arzneimittel- und chemischer Toxizität. Dieses in vitro Modell kann zur Bewertung chemisch induzierter Störungen von Signalwegen eingesetzt werden, die während des Prozesses der neuronalen und glialen Differenzierung aktiviert werden.

Der Hauptvorteil dieses Systems besteht darin, dass ein menschliches Modell verwendet wird, das aus induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurde, das eine Alternative zu traditionell verwendeten Krebszellen und tierischen Primärkulturen darstellt und die Untersuchung der Neurotoxizität in gemischten Populationen von neuronalen und glialen Zellen ermöglicht. Das Verfahren wird von Francesca Pistollato, unserer Postdoktorandin, und Carolina Nunes, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit dem Passieren der hiPSC-Kolonien.

Verwenden Sie bei der Arbeit unter einem stereoskopischen Mikroskop mit vierfacher Vergrößerung in einem Laminar-Flow-Schrank eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel. Schneiden Sie die Stammzellkolonien in Quadrate von etwa 200 Mikrometern mal 200 Mikrometern. Das Ausschneiden der Kolonien erfordert gutes handwerkliches Geschick, um Fragmente gleicher Größe zu erhalten.

Der Einsatz von handelsüblichen Schneidwerkzeugen kann Abhilfe schaffen. Verwenden Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipette, um die Koloniefragmente von der Oberfläche der Schale zu lösen, indem Sie das darunter liegende Medium vorsichtig pipettieren, um die Stücke anzuheben. Übertragen Sie etwa 100 Koloniefragmente in eine qualifizierte Matrix-DMEM F12-beschichtete 60-Millimeter-Schale, die mit vier Millilitern vollständigem hiPSC-Medium gefüllt ist.

Dann inkubieren Sie die neue Schale bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Führen Sie jeden Tag einen totalen Mediumwechsel durch und inspizieren Sie die Morphologie der Kolonien mit einem Phasenkontrastmikroskop bei vierfacher und 10-facher Vergrößerung. Am Tag Null des Differenzierungsverfahrens wird das hiPSC-Medium durch Zugabe von drei Millilitern Medium pro 60-Millimeter-Petrischale aufgefrischt.

Schneiden und lösen Sie dann die 200 Mikron großen Fragmente wie zuvor. Pipettieren Sie die abgelösten Fragmente und das Medium in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die Schale mit zwei Millilitern vollständigem hiPSC-Medium aus und holen Sie alle Fragmente zurück.

Dann eine Minute lang bei 112 mal G zentrifugieren. Nach der Zentrifugation wird der Überstand aspiriert und die Fragmente in fünf Millilitern vollständigem hiPSC EB-Medium vorsichtig resuspendiert. Das gesamte Volumen in eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale mit extrem geringer Bindung geben.

Inkubieren Sie das Gericht über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag kontrollieren Sie die Zellen mit dem inversen Mikroskop. Die Körper der Embryoiden an dem Tag, an dem sie entstehen, sollten abgerundet und voneinander unterschieden erscheinen, wie hier zu sehen.

Pipettieren Sie dann die Embryoidkörper und das Medium aus der Schale und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Embryoidkörper eine Minute lang bei 112 mal G. Am zweiten Tag aspirieren Sie die Standard-Matrix-Beschichtungslösung aus einer zuvor vorbereiteten 60-Millimeter-Schale und geben Sie fünf Milliliter vollständiges neuroepitheliales Induktionsmedium (NRI) in die Schale.

Sammeln Sie unter dem stereoskopischen Mikroskop bei vierfacher Vergrößerung und mit einer 200-Mikroliter-Pipette etwa 50 schwebende Embryoidkörper und übertragen Sie sie in eine beschichtete Schale. Dann inkubieren Sie das Gericht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag, dem dritten Tag des Differenzierungsverfahrens, überprüfen Sie die Schale unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass alle Embryoidkörper befestigt sind.

Führen Sie dann vorsichtig einen totalen Mediumwechsel mit vollständigem NRI-Medium durch. Wechseln Sie das NRI-Medium jeden zweiten Tag bis zum siebten Tag, an dem rosettenartige neuroepitheliale Aggregate sichtbar sein sollten. Beschichten Sie am siebten Tag eine 96-Well-Platte, indem Sie 100 Mikroliter der in Kulturmedium verdünnten Standardmatrix in jede Vertiefung pipettieren.

Schneiden Sie am achten Tag die rosettenartigen Aggregate unter einem stereoskopischen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung unter sterilen Bedingungen in Fragmente. Beachten Sie, dass sich die Rosetten bei Berührung mit der Nadel leicht von der Schale lösen. In diesem Fall wird die abgelöste Rosette mit der Nadelspitze teilweise zerkleinert.

Wenn die Rosetten teilweise befestigt bleiben, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um das Ablösen der Rosettenfragmente abzuschließen. Rosettenschnitte erfordern gutes handwerkliches Geschick und Präzision, um zu vermeiden, dass keine neurexidermalen Derivate geschnitten werden. Sammeln Sie dann die Rosettenfragmente und ihr Medium in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie die Schale mit zwei Millilitern NRI-Medium aus, um alle Fragmente zurückzugewinnen. Dann die Rosettenfragmente im 112-fachen G für ein bis zwei Minuten eindrehen. Nach dem Ansaugen des Überstands wird das Pellet vorsichtig in einem Milliliter vorgewärmtem einem X DPBS ohne Calcium und Magnesium resuspendiert.

Pipettieren Sie die Rosettenfragmente vorsichtig auf und ab, um sie teilweise zu dissoziieren. Fügen Sie dann vier Milliliter vollständiges NRI-Medium hinzu und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau und einem automatisierten Zellzähler. Als nächstes wird die Standard-Matrix-Beschichtungslösung von der 96-Well-Platte aspiriert und die Zellen mit einer Dichte von etwa 15.000 Zellen pro Quadratzentimeter in NRI-Medium in die Wells abgelegt.

Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Führen Sie an Tag 10 einen vollständigen Mediumwechsel mit vollständigem neuronalem Differenzierungsmedium durch. Dieses repräsentative Bild zeigt Rosetten nach 12 Tagen in vitro, gefärbt für Nestin in grün und Beta-3-Tubulin in rot.

Hier wurden Zellen, die 28 Tage lang in vitro gezüchtet wurden, auf Beta-3-Tubulin gefärbt, auf rot und NF200 auf grün. Dieses repräsentative Bild zeigt neuronale Zellen, die nach 21 Tagen in vitro von NSCs differenziert wurden, gefärbt auf NF200 in rot und tow in grün. Hier werden Gliazellen aus der gleichen Kultur rot für GFAP gefärbt.

Dieses Histogramm vergleicht die Quantifizierung von Nestin, MAP zwei, GFAP, Gamma-Aminobuttersäure, vesikulärem Glutamattransporter eins und Tyrosinhydroxylase-positiven Zellen in IMR90 hiPSC-Derivaten und Zellen, die von IMR90 hiPSC-abgeleiteten NSCs differenziert wurden. Diese Phasenkontrastbilder, die mit einem 10-fachen Objektiv aufgenommen wurden, zeigen neuronale Stammzellen, die sich 21 Tage lang differenzieren. Durch die Befolgung dieser Verfahren können andere Auslesungen wie quantitative Echtzeit-PCR und multilaterale Reanalyse durchgeführt werden, um die Physiologie und den Phänotyp von Neuronal- und Gliazellen zu beurteilen und die Wirkung von Chemikalien zu beurteilen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit chemischen Verbindungen äußerst gefährlich sein kann. Aus diesem Grund sollten Ihre entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen immer mit einer Schutzbrille, Handschuhen oder Maske unter der Strömungshaube getroffen werden, insbesondere bei der Durchführung chemischer Behandlungen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine gemischte differenzierte Population von Neuronen und Gliazellen erhalten, die aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen besteht, die ein geeignetes Modell für die Entwicklung von Neurotoxizitätstests darstellt.