Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die physikalischen Eigenschaften von phasentrennenden Membranen mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie abzubilden und zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Dilio, Phosphatidylcholin, fgo, Myelin und Cholesterin in einem Verhältnis von zwei zu zwei zu eins gemischt werden, um ein phasentrennendes Lipidgemisch zu bilden. Als nächstes werden die gestützten Lipiddoppelschichten hergestellt, indem die Liposomensuspension mittels Rasterkraftmikroskopie in eine MICA-Oberfläche abgeschieden wird.

Anschließend wird die Oberfläche der Doppelschicht abgetastet, wodurch ein topografisches Bild entsteht, in dem strukturelle Merkmale wie die Höhe gemessen werden können. Als nächstes wird die Kraftspektroskopie an bestimmten Bereichen der Doppelschicht durchgeführt, um die physikalischen Eigenschaften der Doppelschicht zu untersuchen, insbesondere die Durchbruchskraft und die Membrandicke. Letztendlich zeigen die Ergebnisse Unterschiede in den Eigenschaften zwischen verschiedenen Lipidphasen, basierend auf FM-Bildern und Kraftkurven.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Fluoreszenzmikroskopie ist die Erhöhung der Auflösung und zusätzliche Eigenschaften, die ein FM an der Probe untersuchen kann. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Biophysik zu beantworten, wie z.B. die Struktur biologischer Membranen und Proteine, die in solche Membranen eingebettet sind. Darüber hinaus können wir uns auch die physikalischen Eigenschaften der Membran ansehen und beobachten, wie Änderungen in der Zusammensetzung oder zusätzliche Membranwirkstoffe diese Eigenschaften verändern könnten.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Zerbrechlichkeit der Probe Schwierigkeiten haben. Dies hat Auswirkungen auf die Probenvorbereitung, die Handhabung, die Wahl der Cantilever und die FM-Bildgebungs- und Spektroskopiebedingungen. Beginnen Sie mit dem Auflösen von DOPC, Spino, Myelin und Cholesterin in Chloroform in den gewünschten Konzentrationen. Kombinieren Sie dann 18,38 Mikroliter DOPC, 17,1 Mikroliter Singmyelin und 11,3 Mikroliter Cholesterin, um eine Lösung mit einem Milligramm Gesamtlipiden und einem molaren Verhältnis von zwei zu zwei zu eins herzustellen.

Mischen Sie eine Lösung durch Vortexen, trocknen Sie die Mischung mit einem Inertgas wie Stickstoff und trocknen Sie sie dann mindestens eine Stunde lang unter Vakuum weiter. Als nächstes lösen Sie die getrockneten Lipide in 100 Mikrolitern PBS auf eine Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter auf. Etwa eine Minute lang kräftig mischen.

Um eine trübe Suspension zu erhalten, die multilaminare Vesikel enthält. Stellen Sie sicher, dass keine Lipidfilme an den Seiten der Durchstechflasche haften. Nehmen Sie 10 Mikroliter der multilaminaren Lipidsuspension und fügen Sie 150 Mikroliter unterstützten Lipid-Doppelschichtpuffer hinzu.

Mischen Sie dann eine Lösung und geben Sie sie in ein kleines Glasfläschchen mit zwei Millilitern und verschließen Sie es mit Para-Film-Ultraschall. Die Mischung wird bei Raumtemperatur in einem Bad 10 Minuten lang beschallt. Während dieser Zeit sollte die Lösung klar werden und kleine Vesikel oder Vesikel mit einem Durchmesser von etwa 50 Nanometern ergeben.

Waschen Sie die Glasabdeckung in Wasser, gefolgt von Ethanol, und lassen Sie sie dann an der Luft trocknen. Nehmen Sie als Nächstes Micah-Scheiben und ziehen Sie die äußere Schicht mit Klebeband ab. Befestigen Sie die MICA-Disc mit einem Tropfen transparentem, optisch klarem Kleber auf einem Deckglas.

Befestigen Sie dann Kunststoffzylinder mit Vakuumfett an der MICA und stellen Sie sicher, dass keine Leckagen vorhanden sind. Spritzen Sie die gesamte Liposomenlösung direkt auf den Glimmer und fügen Sie weitere 140 Mikroliter unterstützten Lipid-Doppelschichtpuffer hinzu, um ein Volumen von 300 Mikrolitern zu erreichen. Als nächstes fügen Sie 0,9 Mikroliter einer molaren Calciumchloridlösung hinzu, um eine Endkonzentration von drei Millimolaren Kalzium zu erreichen, inkubieren Sie die Proben zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius und dann mindestens 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius während dieses Schritts, wobei Sie den unterstützten Lipiddoppelschichtpuffer ebenfalls auf 65 Grad Celsius vorwärmen.

Bei Bedarf Puffer hinzufügen, um sicherzustellen, dass die Probe nicht austrocknet. Wenn Sie die Probenkammer mit einem Deckglas abdecken, bleibt die Probe auch hydratisiert. Spülen Sie die Probe dann 10 bis 15 Mal vorsichtig mit dem vorwärmgestützten Lipid-für-Schicht-Puffer ab, um das Kalzium und die nicht fusionierten Vesikel zu entfernen.

Seien Sie während der Waschschritte besonders vorsichtig, damit die Doppelschicht nach den Waschschritten nicht austrocknet. Kühlen Sie die unterstützten Doppelschichten auf Raumtemperatur ab. Richten Sie vor Messungen am Rasterkraftmikroskop das Rasterkraftmikroskop oder ein FM ein, um die Lipiddoppelschichten in einer Lösung abzubilden.

Im Kontaktmodus gemäß den Herstellerangaben wird der Probe Puffer hinzugefügt, damit sie während des gesamten Experiments in Puffer eingetaucht bleibt. Montieren Sie die Probe auf dem A-FM-Tisch und stellen Sie sicher, dass alle Schwingungsisolationsmodule eingeschaltet sind. Warten Sie mindestens 15 Minuten, bis sich das System ausgeglichen und die thermische Drift reduziert hat.

Nähern Sie sich dann der Probe im Kontaktmodus mit einer weichen FM-Cantilever-Spitze, bis der Kontakt hergestellt ist. Da Doppelschichten sehr zerbrechlich sind, minimieren Sie den Sollwert der A-FM-Spitze während der Bildgebung im Kontaktmodus, um die Kraft auf ein Minimum zu beschränken und die thermische Drift zu korrigieren, während der Kontakt mit der Probe aufrechterhalten wird. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, verarbeiten Sie die Bilder, indem Sie jede Scanzeile an polynomiale Nivellierungsfunktionen anpassen.

Führen Sie eine Linienentfernung für Scans durch, die den Kontakt mit der Membran verlieren. Kalibrieren Sie den Cantilever, indem Sie der proprietären Software des Herstellers A FM folgen, indem Sie dem Protokoll des Herstellers folgen, um die korrekte Umwandlung des elektrischen Signals in eine Kraftmessung zu bestimmen. Nachdem Sie einen Bereich der Doppelschicht abgebildet haben, wählen Sie einen Bereich von fünf Mikrometern x fünf Mikrometern in der Doppelschicht aus, um eine Kraftspektroskopie durchzuführen.

Richten Sie das AFM so ein, dass es Kraftkurven in einem 16 x 16 Raster dieses Bereichs aufnimmt, was zu 256 Kraftkurven pro Bereich führt. Stellen Sie dann die Z-Piso-Verschiebung auf 400 Nanometer ein. Diese ermittelt den maximalen Bewegungsbereich des z-Piezos und stellt sicher, dass sich der Cantilever zwischen den Messungen vollständig von der Probe weggezogen hat.

Stellen Sie anschließend die Annäherungsgeschwindigkeit auf 800 Nanometer pro Sekunde und die Rückzugsgeschwindigkeit auf 200 Nanometer pro Sekunde ein. Stellen Sie in diesem Fall auch die maximale Zielkraft für jede Kraftkurve ein, 12 Nanonewton. Nachdem Sie alle Parameter eingestellt haben, erfassen Sie Kraftkurven, indem Sie die Run-Taste der A FM-Software drücken.

Erfassen Sie mindestens 500 Kraftkurven für jede Bedingung, um eine gute Statistik zu gewährleisten, erstellen Sie ein Histogramm der Werte und passen Sie die Histogramme dann an eine Gaußsche Verteilung an, um den Peak und die Breite der Verteilung zu erhalten. Aufgrund der Lipidzusammensetzung in dieser Studie werden zwei Hauptmembranregionen gebildet. Es gibt eine flüssige geordnete Region, die aus Fing, Myelin und Cholesterin besteht, und eine flüssige ungeordnete Region, die hauptsächlich aus DOPC besteht.

Das Höhenprofil aus der A FM-Bildgebung kann durch den Blick auf das Höhenprofil wichtige Informationen über die Membranstruktur liefern. Die Dicke der Doppelschicht kann gemessen werden, indem das Vorhandensein von Defekten in der Membran genutzt wird. Die Höhenkarte kann auch verwendet werden, um den Höhenunterschied zwischen der geordneten und der ungeordneten Phase zu messen.

Die aus dem Kraftspektroskopie-Modus abgeleiteten Kraftkurven werden verwendet, um die Durchbruchskraft zu messen, indem der Kraftwert an der Spitze der Kraftkurve wie hier gezeigt wird. Darüber hinaus kann die Membrandicke abgeleitet werden, indem der Abstandswert vom Gipfel des Kraftverlaufs vom Scheitelpunkt auf den Abstandswert subtrahiert wird. Wenn die Kraftkurve wieder ansteigt, ist es wichtig, beim Versuch dieses Verfahrens daran zu denken, die B-Schichtlösung aufzubewahren und die FM-Montage ständig zu überwachen, um die Auswirkungen der thermischen Drift und der D-Akkumulation auf der Spitze zu korrigieren

Andere Methoden, wie z.B. die konfokale Fluoreszenzmikroskopie, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie z.B. die Membrandynamik zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sich auf Schichten vorbereiten und ein FM verwenden, um die physikalischen Eigenschaften dieser Doppelschichten abzubilden und zu untersuchen.