Studium dynamischer Prozesse von Nano-Größe Objekte in Liquid Scanning Transmission Electron Micros mit
5. Februar 2017
Dieses Protokoll beschreibt den Betrieb eines Flüssigkeitshalteströmungs Probe zum Abtasten Transmissionselektronenmikroskopie von AuNPs in Wasser, wie für die Beobachtung von nanoskaligen dynamischen Prozessen.
Das übergeordnete Ziel der Flüssigphasen-Rastertransmissionselektronenmikroskopie ist es, Strukturen und Phänomene von Nanomaterialien in biologischen Proben zu beobachten, die vollständig in eine bis zu mehreren Mikrometer dicke Flüssigkeitsschicht eingebettet sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Materialwissenschaften zu beantworten, wie z. B. das Verhalten von Nanomaterialien in Flüssigkeiten und die Untersuchung biologischer Proben in der natürlichen flüssigen Umgebung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nanoskalige morphologische Informationen über Proben in Flüssigkeit liefert.
Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Laden des Probenhalters und die Bildaufnahme nicht so einfach sind wie zunächst mit der Elektronenmikroskopie. Reinigen Sie zu Beginn des Eingriffs in einer sauberen Laminar-Flow-Haube einen Lichtmikroskopie-Objektträger mit einem faserfreien Tuch und reinem Ethanol. Legen Sie den Objektträger auf ein Reinraumtuch in einer Petrischale mit Deckel.
Um die SiN-Mikrochips zu manipulieren, greifen Sie den Mikrochip mit einer kohlenstoffbeschichteten Pinzette fest, aber vorsichtig an den Längsseiten und halten Sie die SiN-Membran immer nach oben. Bei dieser Technik platzieren Sie fünf Mikrochips ohne Abstandhalter und fünf Mikrochips mit einem 200-Nanometer-Abstandhalter auf dem Objektträger. Verschließen Sie die Petrischale und bringen Sie die Mikrochips zu einem Abzug.
Legen Sie die Mikrochips mit der Membranseite nach oben in ein Becherglas mit HPLC-Aceton. Schwenken Sie das Becherglas vorsichtig zwei Minuten lang, um die Schutzschicht zu entfernen, und achten Sie darauf, dass die Mikrochips nicht umkippen. Übertragen Sie dann die Mikrochips schnell in ein Becherglas mit reinem Ethanol.
Decken Sie den Becher mit Alufolie ab. Schwenken Sie das Becherglas vorsichtig zwei Minuten lang, um die Beschichtung zu entfernen, und bringen Sie es in einer geschlossenen Petrischale zur Laminar-Flow-Haube. Legen Sie die Mikrochips auf ein frisches Reinraumtuch und achten Sie darauf, dass die Mikrochips nicht umgedreht werden, wenn sie sich aus der Pinzette lösen.
Lassen Sie die Mikrochips einige Minuten trocknen. Und dann platzieren Sie die Mikrochips auf dem Objektträger in der Petrischale. Verschließen Sie die Petrischale und bringen Sie die Mikrochips zu einem Plasmareiniger.
Legen Sie den Objektträger und die Mikrochips in den Plasmareiniger und führen Sie ein fünfminütiges Reinigungsprogramm durch, um Kohlenwasserstoffe von der SiN-Membran zu entfernen. Untersuchen Sie die Mikrochips mit einem Lichtmikroskop auf geplatzte Membranen oder Schmutzpartikel. Entsorgen Sie beschädigte oder verschmutzte Mikrochips.
Immobilisieren Sie die Mikrochips in der Laminar-Flow-Haube in einer sauberen Transportbox mit klebriger Innenfläche. Tragen Sie ein Tröpfchen von einem Mikroliter einer mit drei Molcitrat stabilisierten wässrigen Goldnanopartikellösung ohne Abstandshalter auf die SiN-Membran jedes Mikrochips auf und lassen Sie die Lösung trocknen. Tragen Sie dann einen Mikroliter deionisiertes Wasser auf die Membran auf, um Salz und Tenside abzuwaschen.
Nach 30 Sekunden tupfen Sie das Wasser vorsichtig mit Filterpapier ab und lassen Sie die Mikrochips trocknen. Legen Sie die Spitze des TEM-Halters für den Flüssigkeitsfluss unter ein binokulares Lichtmikroskop. Entfernen Sie den Titandeckel von der Halterspitze und legen Sie ihn auf ein Blatt Alufolie.
Richten Sie eine mikrofluidische Spritzenpumpe mit einer Ein-Milliliter-Glasspritze ein, die 0,5 Milliliter Wasser in HPLC-Qualität enthält. Schließen Sie die Spritze an das Durchflusssystem an und starten Sie die Pumpe. Während das Wasser durch das System gespült wird, überprüfen Sie die Leitungen auf Undichtigkeiten oder Durchflussverengungen.
Wenn der Pumpvorgang abgeschlossen ist, nehmen Sie die Spülung aus dem Flüssigkeitszellenfach und trocknen Sie die Halterspitze mit Filterpapier ab. Überprüfen Sie die Halterspitze mit dem Lichtmikroskop. Trocknen Sie die Spitze mit einem Reinraumtuch ab und entfernen Sie Staub oder Fasern mit einer sauberen, PTFE-beschichteten Pinzette.
Überprüfen Sie den Deckel der Halterspitze, den O-Ring und die Schrauben und entfernen Sie Staub oder Fasern mit einer PTFE-beschichteten Pinzette. Setzen Sie den O-Ring in die Haltergruppen ein. Setze die erste Schraube ein und drehe sie ein paar Mal, damit sie einfach bleibt.
Legen Sie den Proben-Mikrochip mit einer sauberen, gebogenen Pinzette mit der SiN-Membran nach oben in die Tasche der Halterspitze. Überprüfen Sie mit dem binokularen Lichtmikroskop, ob der Mikrochip richtig sitzt. Geben Sie einen 0,3-Mikroliter-Tropfen reines gefiltertes Wasser auf den Proben-Mikrochip.
Halten Sie den Mikrochip mit einer Pinzette fest. Nimm dann einen Abstandshalter-Mikrochip mit einer gebogenen Pinzette, die du auf den Kopf hältst. Drehen Sie die Pinzette vorsichtig so, dass die Mikrochip-Membran nach unten zeigt.
Platzieren Sie den Spacer-Mikrochip auf dem Proben-Mikrochip. Legen Sie lichtreflektierendes Material unter die Halterspitze und überprüfen Sie die Ausrichtung des Mikrochips unter dem binokularen Lichtmikroskop. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Mikrochips vorsichtig einzustellen, wenn die SiN-Fenster nicht ausgerichtet sind.
Nehmen Sie dann den Deckel der Probenkammer mit einer Pinzette auf. Drehen Sie den Deckel auf den Kopf und legen Sie die Rückseite des Deckels auf die Halterspitze, ohne die Mikrochips zu berühren. Platzieren Sie die verbleibende Schraube mit einer Pinzette und ziehen Sie beide Schrauben iterativ fest.
Ziehen Sie sie vorsichtig fest, bis sie auf Widerstand stoßen. Fenster können leicht zerbrechen, wenn das Festziehen zu stark ist. Starten Sie einen Flüssigkeitsfluss von vier Mikrolitern pro Minute durch das System und prüfen Sie, ob die Halterspitze undicht ist.
Bringen Sie dann den Halter zu einer Vakuumpumpstation und führen Sie eine Dichtheitsprüfung durch. Stellen Sie sicher, dass der Druck innerhalb von fünf Minuten mindestens 10 bis minus fünf mbar erreicht. Setzen Sie den Halter in sein Gehäuse ein.
Und bringen Sie die Halterung zum Elektronenmikroskop. Richten Sie das Mikroskop im STEM-Modus ein. Messen Sie die Stromdichte des Elektronenstrahls mit einem dünnen, mit Goldnanopartikeln beschichteten Kohlenstofffilm als Referenzprobe ohne Wasser.
Starten Sie den Fluss von reinem Wasser mit einer Geschwindigkeit von nicht mehr als zwei Mikrolitern pro Minute. Setzen Sie den TEM-Halter für den Flüssigkeitsdurchfluss in die Vakuumschleuse ein und beginnen Sie mit der Evakuierung. Stellen Sie sicher, dass der Druck normal abnimmt.
Und dann setzen Sie den TEM-Halter vollständig in das Mikroskop ein. Sobald der Druck ausreichend niedrig ist, öffnen Sie das Strahlventil und setzen Sie den ADF-Detektor ein. Stellen Sie das Mikroskop in den kontinuierlichen Erfassungsmodus und verschieben Sie den Probentisch in X- und Y-Richtung, um das SiN-Fenster zu finden.
Passen Sie den Kontrast und die Helligkeit so an, dass die Ränder des Fensters gut sichtbar sind. Verschieben Sie die Bühne in die X- und Y-Richtung, sodass sich eine Ecke des Fensters in der Mitte des Sichtfelds befindet. Setzen Sie dann die Objektivlinse zurück.
Passen Sie die vertikale Position des Probentisches an, um die Ecke grob zu fokussieren. Kippen Sie den Tisch um fünf Grad hin und her, um zu überprüfen, ob sich die Probe auf euzentrischer Höhe befindet. Zentrieren Sie die Fensterecke im Sichtfeld und hinterlegen Sie anschließend die Bühnenposition in der Software.
Verschieben Sie den Tisch in die X- und Y-Richtung, bis die Goldnanopartikel sichtbar sind. Und dann fokussieren Sie die Objektivlinse. Notieren Sie sich die aktuelle Dichte und berechnen Sie die Dicke der Flüssigkeitszelle.
Verschieben Sie den Tisch in die X- und Y-Richtung, um einen Bereich mit mindestens 20 Goldnanopartikeln zu lokalisieren. Legen Sie die Parameter fest und nehmen Sie ein Bild auf. Gold-Nanopartikel: Wir werden auf einer Siliziumnitrid-Membran immobilisiert und mit Flüssigphasen-STEM abgebildet.
In reinem Wasser behielten die Goldnanopartikel während der gesamten Bildgebung ihre Form bei. Radiolyseprodukte aus dem Wasser könnten einzelne Goldatome oxidieren, was schließlich die Form der Nanopartikel verändern könnte. In einem anderen Experiment, Chlorid-Ionen, werden wir in die flüssige Phase gebracht.
Die Goldnanopartikel lösten sich im Laufe des Experiments langsam auf, während die oxidierten Goldatome lösliches Tetrachloraureat bildeten. Um die Bewegungen von Gold-Nanopartikeln in Wasser zu untersuchen, wurden die Nanopartikel im anschließenden Experiment nicht vollständig auf der Probenmembran immobilisiert. Die Goldnanopartikel agglomerierten und bewegten sich bei Erreichen einer kritischen Clustergröße aus dem Sichtfeld.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Es ist eine mehrwöchige Schulung erforderlich. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, ruhig zu arbeiten und die Vakuumdichtheit und die Dicke der Flüssigkeit zu überprüfen.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Materialwissenschaften, der Chemie und der Biologie, um das Wachstum und die Bewegung von Nanopartikeln in Flüssigkeiten, die Struktur von nanoskaligen Materialien in flüssigen Umgebungen und die Funktionalität von Proteinen in Säugetierzellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Rastertransmissionselektronenmikroskopie von Goldnanopartikeln durchführt, die in eine Wasserschicht eingebettet sind, einschließlich der korrekten Beladung des Probenhalters und der Einstellung des Mikroskops. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Flüssigkeit im Elektronenmikroskop zu Schäden führen kann, wenn der Probenhalter nicht richtig geladen ist.
Daher ist es wichtig, vor der Beladung auf Vakuumleckagen zu prüfen.
Überblick
Dieses Protokoll beschreibt den Betrieb eines Flüssigkeitsfluss-Probenhalters für die rasternde Transmissionselektronenmikroskopie von AuNPs in Wasser, die die Beobachtung von dynamischen Prozessen im Nanoskalenbereich ermöglicht.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Rasternde Transmissionselektronenmikroskopie
- Nanomaterialien
- Bildgebung in flüssiger Phase
Hintergrund
- Die rasternde Transmissionselektronenmikroskopie in flüssiger Phase ermöglicht die Beobachtung von Nanomaterialien in einer flüssigen Umgebung.
- Diese Technik liefert morphologische Informationen im Nanoskalenbereich über Proben.
- Sie ist besonders nützlich für die Untersuchung biologischer Proben in ihrem natürlichen flüssigen Zustand.
- Neue Benutzer finden möglicherweise das Probenladen und die Bildaufnahme herausfordernd.
Zweck der Studie
- Um Strukturen und Phänomene von Nanomaterialien in biologischen Proben zu beobachten.
- Um das Verhalten von Nanomaterialien in Flüssigkeiten zu untersuchen.
- Um das Verständnis von dynamischen Prozessen im Nanoskalenbereich zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Reinigen und Vorbereiten von SiN-Mikrochips für das Probenladen.
- Aufbringen einer Gold-Nanopartikel-Lösung auf die Mikrochips.
- Verwendung eines Flüssigkeitsfluss-TEM-Halters für die Bildgebung.
- Durchführen von Lecktests und Sicherstellung der korrekten Ausrichtung der Mikrochips.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll demonstriert erfolgreich die Vorbereitung und Bildgebung von AuNPs in einer flüssigen Umgebung.
- Es skizziert die Schritte zur Sicherstellung der Probenintegrität während des Prozesses.
- Die Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit des Flüssigkeitsfluss-Halters bei der Erfassung dynamischer Prozesse.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in das Verhalten von Nanomaterialien in Flüssigkeiten.
- Sie verbessert die Fähigkeit der Elektronenmikroskopie zur Untersuchung biologischer Proben.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf verschiedene Bereiche der Materialwissenschaft ausweiten.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Liquid phase scanning transmission electron microscopy enables direct observation of nanomaterial behavior in physiologically relevant liquid environments, supporting target validation through mechanistic de-risking of nanoparticle-biological interactions. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by capturing dynamic processes such as agglomeration, dissolution, and cellular uptake under controlled fluid conditions. The method addresses a critical gap in nanomedicine development by providing nanoscale resolution in hydrated states, reducing reliance on inferential assays and improving go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing nanomaterial structural changes in liquid, clarifying mechanisms of action and degradation pathways.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of nanoparticle interactions with biological components in near-native conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying unstable or reactive nanomaterials early, reducing late-stage failure risk due to unforeseen liquid-phase behavior.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming nanomaterial stability and dispersion in liquid media prior to high-content screening.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of particle size, shape, and concentration changes over time, providing reproducible metrics for assay standardization.
- Platform Reuse: Facilitates screening readiness and scalability through standardized microfluidic chip preparation and leak-tight holder assembly, supporting repeated use across compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining nanomaterials in liquid environments that mimic physiological conditions, improving relevance of efficacy and toxicity readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying dynamic processes such as ion-induced dissolution or agglomeration, which directly impact bioavailability and safety profiles.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking when primarily mechanistic, clarifying whether observed effects stem from the nanomaterial itself or liquid-phase transformation products.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work, supporting hypothesis testing, assay readiness, and translational continuity when nanomaterials are evaluated in liquid environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct visualization of nanomaterial behavior in liquid, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible liquid cell formation and nanoparticle immobilization, ensuring consistent starting conditions for compound evaluation.
- Analytics: Highlights liquid thickness measurement and nanoparticle tracking as key readouts that help teams compare stability across formulations or environmental conditions.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity by maintaining nanomaterials in hydrated states that reflect in vivo exposure, supporting biomarker alignment when dissolution products or agglomerates correlate with biological response.
- Enterprise Reuse:Frames the method as a reusable capability through standardized microfluidic chip preparation, holder assembly, and leak testing protocols, enabling consistent application across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nanomaterial-biological interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of liquid cell preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying unstable nanomaterials early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on direct observation of liquid-phase stability and transformation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic handling, vacuum systems, and electron microscopy to ensure proper specimen holder assembly and leak testing.
- Depends on instrumentation including plasma cleaners, liquid flow TEM holders, and STEM-capable microscopes with environmental holders.
- Necessitates cross-team standardization of chip cleaning, spacer use, and flow rate protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from water-based to complex biological media, including viscosity effects and potential membrane fouling.
- Includes practical limitations such as beam-induced radiolysis effects on liquid chemistry and the need for vacuum compatibility, which may restrict certain volatile or reactive formulations.
