Ein Multi-Cue-Bioreaktor zur Bewertung der entzündlichen und regenerativen Kapazität von Biomaterialien unter Strömung und Dehnung

Bisher war es sehr schwierig, die Ursache-Wirkungs-Beziehungen zwischen Hämodynamik und vaskulärer Geweberegeneration zu identifizieren. Und das liegt daran, dass es eine Herausforderung ist, die einzelnen mechanischen Lasten zu kontrollieren. Dieser Bioreaktor ermöglicht es uns, die individuellen und kombinierten Auswirkungen von reiner Belastung und zyklischer Dehnung auf das Regenerationspotenzial einer Vielzahl von Tissue-Engineering-Gefäßtransplantaten mechanistisch zu untersuchen.

Suzanne Koch, Doktorandin in unserer Gruppe, wird dieses Verfahren demonstrieren. Und Dr. Tamar Wissing, die als Postdoktorandin in unserem Labor arbeitet. Um das Elektrogerüst auf den Silikonschlauch zu montieren, fädeln Sie eine 4-0 Prolene-Naht in ein Ende eines Stücks Silikonschlauch und aus dem anderen heraus.

Machen Sie auf beiden Seiten des Rohres einen kleinen Knoten, lassen Sie etwa 10 Zentimeter Draht an beiden Knoten und machen Sie einen dritten Knoten auf den beiden. Nachdem Sie eine Nahtnadel entfernt haben, schneiden Sie die Ränder des Silikonschlauchs in eine dreieckige Form ab und machen Sie einen letzten Knoten am Ende der beiden 10 Zentimeter langen Drähte. Tauchen Sie das elektrogesponnene Gerüst in 30 % Ethanol und legen Sie das Gerüst über ein Ende des freien Nahtdrahtes.

Dehnen Sie anschließend vorsichtig beide Seiten des Silikonschlauchs und des 10 Zentimeter langen Nahtknotens, während der zweite Forscher eine Pinzette mit einer glatten Innenspitze verwendet, um das elektrogesponnene Gerüst vorsichtig über den Schlauch zu schieben. Löse langsam die Dehnung auf dem Silikonschlauch und glätte gleichzeitig das elektrogesponnene Gerüst mit der Pinzette. Und tauchen Sie das Gerüst und den Silikonschlauch zweimal in ultrareines Wasser.

Konstruieren Sie das untere Fach und stellen Sie sicher, dass der O-Ring richtig platziert ist. Platzieren Sie eine Adapterbuchse im oberen Teil des unteren Fachs und platzieren Sie das Druckrohr mit Löchern durch das untere Fach. Schnüren Sie den Silikon-O-Ring um das untere Ende des Druckrohrs, um ein Auslaufen zu verhindern.

Schrauben Sie den unteren Teil des unteren Fachs mit dem oberen Teil des unteren Fachs fest, um die Druckleitung zu sichern. Achten Sie darauf, dass sich die untere gravierte Nut des Druckschlauchs etwa drei bis fünf Millimeter über dem Rand der Adapterbuchse des unteren Fachs befindet. Ziehen Sie den Silikonschlauch mit dem elektrogesponnenen Gerüst über das Druckrohr und machen Sie ein Nicken und den Nahtdraht am unteren Ende des elektrogesponnenen Gerüsts, an der Stelle der gravierten Nut auf dem Druckrohr.

Machen Sie ein zweites Nicken auf der gegenüberliegenden Seite, um den Silikonschlauch mit dem elektrogesponnenen Transplantat fest zu befestigen. Und platzieren Sie eine mit einem Lineal ausgestattete Scherenklemme am oberen Ende des Silikonschlauchs, ziehen Sie die Scherenklemme gleichmäßig nach oben und ziehen Sie vorsichtig am elektrischen Laichgerüst, um eventuelle Falten zu entfernen. Mache mit einem Nahtdraht zwei Knoten an beiden Enden des Gerüsts an der oberen gravierten Nut des Druckrohrs.

Wenn beide Knoten gemacht sind, lösen Sie die Scherenklemme und entfernen Sie mit einem Messer überschüssige Silikonschläuche. Schrauben Sie die Nasenkonus auf das Schraubgewinde der Druckrohre für die Proben, die dynamisch belastet werden sollen. Tauchen Sie die Druckleitung, die Schläuche und das Gerüst einmal in 30 % Ethanol und zweimal in Reinstwasser, um die Einrichtung vorzubefeuchten.

Platzieren Sie das Glasrohr über dem Druckrohr und drücken Sie vorsichtig auf das untere Fach, um das Glasrohr an Ort und Stelle zu halten. Platzieren Sie dann den Strömungsgleichrichter, einen Silikon-O-Ring und die Adapterbuchse im oberen Fach. Und befestigen Sie das Fach über dem offenen Ende des Glasrohrs.

Entfernen Sie den männlichen Köderstopfen aus dem Durchflussauslass und arbeiten Sie in einem sterilen Laminar-Flow-Schrank. Öffnen Sie die weiße Köderkappe und legen Sie ein Ethanol-Tränketuch vor den Strömungsauslass. Dekonstruieren Sie die Durchflusskulturkammer, indem Sie das Glasrohr mit dem oberen Fach abnehmen.

Legen Sie ein Vakuum-Weiderohr auf das elektrogesponnene Gerüst, um so viel Medium wie möglich zu entfernen. Und fügen Sie Fibrinogenlösung in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis mit der mit Thrombin ergänzten Zellsuspension hinzu. Pipettieren Sie die Lösung einmal auf und ab und tropfen Sie die Lösung sofort über die gesamte Länge des Gerüsts.

Wenn alle Zellen abgegeben wurden, bewegen Sie das Gerüst langsam von links nach rechts und auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erreichen. Wenn beide Seiten des Gerüsts ausgesät sind, rekonstruieren Sie die Durchflusskulturkammer vorsichtig, indem Sie das Glasrohr und das obere Fach wieder einsetzen. Und stellen Sie die Durchflusskulturkammer in den Inkubator, damit sich die Faser verfestigen kann.

Um den Bioreaktor an das Pumpensystem zu koppeln, setzen Sie die Durchflusskulturkammer auf eines der acht Schraubgewinde am Bioreaktorboden. Und platzieren Sie einen Host-Clip auf dem Mediumschlauch. Entfernen Sie die weiße Köderkappe, die den Durchflusseinlass des oberen Fachs der Durchflusskulturkammer abdeckt, und entfernen Sie die weibliche Köderkupplung des Mediumschlauchs.

Verbinden Sie den Mediumschlauch mit einer Seite des Durchflusseinlasses im oberen Fach. Und die andere Seite mit dem Strömungsauslass im unteren Fach. Übertragen Sie das komplette Setup vom Laminar-Flow-Schrank in den Inkubator.

Und verbinden Sie eine Fluidikeinheit und den Bioreaktorsockel mit dem Luftdruckschlauch und dem elektrischen Kabel. Starten Sie die Software und initialisieren Sie die Pumpen. Starten Sie den Medienfluss für die Proben nacheinander.

Ändern Sie dann die Parameter der Dehnungspumpe auf die gewünschten Einstellungen und starten Sie die Dehnung. Überwachen Sie die Dehnung, die auf das Gerüst angewendet wird, jeden zweiten Tag. Die Überwachung der Dehnungs- und Wandschubspannung über langfristige Kulturperioden zeigt, dass diese Werte über einen Zeitraum von bis zu 20 Tagen auf einem relativ konstanten Niveau gehalten werden können.

Nach dreitägiger hämodynamischer Belastung zeigt die Immunfluoreszenzfärbung eine homogene Verteilung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen und Myofibroblasten im gesamten Gerüst. Nach 20 Tagen Co-Kultur führt die zyklische Dehnung zur Ablagerung von zahlreicheren und dickeren Kollagenfasern vom Typ 1. In der kombinierten hämodynamischen Belastungsgruppe wird der zyklische Dehnungseffekt durch reine Belastung überstimmt, was zu einer weniger ausgeprägten Kollagen-Typ-1-Ablagerung führt.

Nach acht Tagen Makrophagen-Monokultur werden Fasererosion und Faserspaltung in allen hämodynamischen Belastungsregimen beobachtet, wobei die ausgeprägteste Resorption in der statischen Gruppe und die am wenigsten ausgeprägte Resorption in der reinen Stressgruppe beobachtet wurde. Sowohl zyklische Dehnung als auch reiner Stress wirken sich auf das Zytokinsekretionsprofil des Co-Kultur-Setups aus. Interessanterweise zeigen die kombinierten Effekte beider Lasten entweder die Dominanz einer der beiden Lasten oder synergistische Effekte beider Lasten.

Co-Kultur-Experimente zeigen auch, dass die mechanische Umgebung und die daraus resultierende belastungsabhängige Entzündungsumgebung den Phänotyp der Myofibroblasten modulieren. Darüber hinaus korrelieren die Genexpressionsmuster des kontraktilen Markers alpha glatte Muskulatur Aktin mit der Proteinsynthese. Das Wichtigste bei der Durchführung dieses Protokolls ist, dass die Anwendung von Stretch ist, es ist wichtig, dass Ihr Setup leckagefrei ist.