Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Das übergeordnete Ziel dieses in vitro funktionellen Assays ist es, verschiedene Aspekte der FC-vermittelten Phagozytose zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen in der Immunhämatologie und Bluttransfusionsmedizin zu beantworten, z. B. welche klinische Bedeutung Auto- und Allo-Antikörper für rote Blutkörperchen haben. Diese Technik bietet einen funktionellen biologischen Assay, der in vitro durchgeführt werden kann, um das Ergebnis von Transfusionen bei Patienten mit vorgeformten Antikörpern gegen rote Blutkörperchen vorherzusagen.

Das Verfahren wird von Cindy Tong, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Vergessen Sie nun nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blut gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzkitteln und Handschuhen getroffen werden sollten. Nach der Entnahme von ein bis zwei 10-Milliliter-Vollblutproben von einem gesunden Spender in Vacutainer-Röhrchen, die saure Citrat-Dextrose enthalten, durch Venenpunktion werden die Röhrchen in eine Biosicherheitswerkbank der Klasse II gegeben und das Blut im Verhältnis eins zu eins in warmem, vollständigem Medium verdünnt.

Pipettieren Sie anschließend die Blutzellen langsam an den Seiten eines Zentrifugenröhrchens entlang auf den Dichtegradienten bei Raumtemperatur und achten Sie darauf, die Schichten nicht zu vermischen. Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie dann die oberste Plasmaschicht und verwenden Sie eine Pasteurpipette aus Glas, um den PBMC-haltigen Buffy Coat in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.

Waschen Sie die isolierten PBMCs dreimal in PBS und resuspendieren Sie die Zellen nach der dritten Zentrifugation in drei bis sieben Millilitern Medium. Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellen auf 1,75 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter Konzentration in vollständigem Medium und säen Sie 400 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung eines Achtkammer-Objektträgers für eine einstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 bei voller Luftfeuchtigkeit. Um die roten Blutkörperchen von R2R2 zu opsonisieren, waschen Sie die roten Blutkörperchen zunächst dreimal in PBS.

Verdünnen Sie das R2R2-Pellet nach der dritten Zentrifugation im Eins-zu-Eins-Verhältnis mit polyklonalen Anti-D-Antikörpern aus Humanserum für eine einstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius mit intermittierendem Mischen. Am Ende der Opsonisierung nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und waschen sie dann noch dreimal in PBS, wie gerade gezeigt. Resuspendieren Sie das Pellet auf eine Lautstärke von 1,25 % in vollständigem RPMI-Medium.

Ersetzen Sie anschließend den Überstand aus jeder Vertiefung des Achtkammer-Objektträgers für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius durch 400 Mikroliter der opsonisierten R2R2-Zellen. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die Kammern mit den Gleitadaptern und tupfen Sie das überschüssige R2R2 mit einem Papiertuch ab. Füllen Sie nun ein 100-Milliliter-Becherglas mit PBS und tauchen Sie jeden Objektträger langsam 30 bis 40 Mal in die Salzlösung, um den Großteil des nicht phagozytierten R2R2 zu entfernen.

Nach dem Trocknen die Objektträger 45 Sekunden lang in 100%igem Methanol fixieren und die Zellen trocknen lassen, bevor die Proben mit Deckgläsern montiert werden. Laden Sie am nächsten Tag jeden Objektträger auf ein Phasenkontrastmikroskop mit einer 40-fachen Objektivlinse und zählen Sie manuell mindestens 200 Monozyten und die Anzahl der phagozytierten R2R2 in jedem Monozyten mit einem Zähler in jeder Hand, um gleichzeitig die Anzahl der Monozyten und die Anzahl der phagozytierten R2R2-Zellen pro Probe zu quantifizieren. Intravenöses Immunglobulin bindet und blockiert dosisabhängig an FC-Rezeptoren, die die Phagozytose hemmen, wobei eine nahezu 100%ige Hemmung ab 200 Mikrogramm des intravenösen Immunglobulins pro Milliliter beobachtet wird und bei Konzentrationen unter 0,5 Mikrogramm des Inhibitors fast keine Hemmung beobachtet wird.

Wenn die phagozytischen Indizes auf die R2R2-Positivkontrolle als 0%-Hemmung normiert werden, kann eine Hemmkurve mit einem IC 50 von drei Mikrogramm pro Milliliter bestimmt werden. Mit viel Erfahrung kann die Phasenkontrastmikroskopie eingesetzt werden, um Monozyten von kontaminierten roten Blutkörperchen und Vakuolen von phagozytierten roten Blutkörperchen zu unterscheiden. Dichte Zellverbände und Trümmer sollten bei der Quantifizierung vermieden werden, ebenso wie eine Überopsonisierung der roten Blutkörperchen R2R2, die zu einer erhöhten Phagozytose führen kann, die das Monozyteninnere überfüllt und eine genaue phagozytische Analyse beeinträchtigt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs bis acht Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Immunzytochemie oder Immunfluoreszenz mittels konfokaler Mikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur phagozytären Proteinexpression, zur Wechselwirkung mit roten Blutkörperchen und zur Kompartimentierung zu beantworten. Mit ihrer anfänglichen Entwicklung und weiteren Optimierung wird diese Technik die Art und Weise beeinflussen, wie Forscher in den Bereichen Transfusionsmedizin und Zellbiologie Opsonisationssysteme erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Monozyten-Monolayer-Assay durchführen, um die Arten von Antikörperinteraktionen zu beurteilen, die eine Phagozytose hervorrufen.