Name: Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Lernen Sie den Monozyten-Einschicht-Assay zur Bewertung Fc-Rezeptor-vermittelter Phagozytose in der Transfusionsmedizin. Diese Methode nutzt isolierte primäre Monozyten aus menschlichem Blut.

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Die Autoren danken dem Canadian Blood Services für einen Graduate Fellowship Program Award an T.N.T. Diese Forschung wurde vom Canadian Blood Services' Centre for Innovation finanziell unterstützt, finanziert von der Bundesregierung (Health Canada) und den Gesundheitsministerien der Provinzen und Territorien. Die hierin enthaltenen Ansichten spiegeln nicht die Ansichten der Bundes-, Provinz- oder Territorialregierungen in Kanada wider.

Holen Sie die Genehmigung für die Verwendung von menschlichen Proben von der Forschungsethikkommission / Institutional Review Board, und zu erhalten unterzeichnet Zustimmung von allen menschlichen Spendern. Die MMA kann auch als menschliche Test in ähnlicher Weise mit der Maus PBMCs durchgeführt werden, nach Genehmigung durch den Tiernutzung Ethik. Die MMA nutzt aseptischen Gewebekulturtechniken. HINWEIS: Siehe Abbildung 1. Hinweis: Obwohl wir die Verwendung eines Level 2 biocontainment Schrank während des Tests empfehlen aseptischen Bedingungen zu erhalten, da das Verfahren nur eine &quot;kurzfristige&quot; Kulturverfahren ist, gibt es nicht wirklich genug Zeit für die Bakterien den Test zu verunreinigen. Daher wird, wenn ein Level-2 biocontainment Schrank nicht existieren, sondern als ein nur kaufen, für diesen Test, könnte der Test außerhalb eines biocontainment Schrank durchgeführt werden, auf einer offenen Bank. Die Verwendung eines 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2, jedoch ist keine Option und muß verwendet werden ,optimale Ergebnisse. 1. Pbmc Isolation <ol><li> Erhalten menschlichem Vollblut von einem gesunden Spender oder einen Patienten über Venenpunktur mit Vacutainer haltige Säure-Citrat-Dextrose (ACD) Antikoagulans (gelb-Top-Rohre). HINWEIS: Vollblut kann in ACD bei Raumtemperatur (18-22 ° C) für bis zu 36 h gelagert werden , bevor 11 zu dem nächsten Schritt fortgefahren wird . Normalerweise sind Oktober 1-02 ml-Vacutainer-Röhrchen Vollblut für den Test ausreichend. </li><li> Verdünne das Vollblut 1: 1 v / v in warmem komplettem RPMI-Medium (RPMI-1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 20 mM HEPES und 0,01 mg / ml Gentamicin). </li><li> Isolieren einkernigen peripheren Blutzellen (PBMCs) aus dem verdünnten Vollblut Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung, wie vom Hersteller empfohlen (siehe Materialliste). Schicht, die das verdünnte Blut sehr langsam über den Dichtegradienten (erwärmt auf Raumtemperatur 18-22 ° C). HINWEIS: Minimieren Sie die Menge von mixifür die optimale Trennung von Blut an der Schnittstelle ng durch sorgfältig die Blutmischung in tropfenweise Schichtung oder durch eine Pipette. <ol><li> Lassen Sie das Blut Mischung langsam auf die Oberseite des Dichtegradienten Schicht über durch die Pipettenspitze nahe dem Dichtegradienten platzieren und durch die Blut-Gemisch ermöglicht die Seite des Rohres sehr langsam abzulaufen. </li><li> Je nach Umfang des Experiments Schicht 10 ml Blut Mischung oben auf 3 ml Dichtegradienten (in einem 15-ml-Röhrchen) oder Schicht 35 ml Blut Mischung oben auf 15 ml Dichtegradienten (in einem 50-mL Tube). Typischerweise wurden 10 ml Vollblut ergibt 10.000.000 PBMCs mit einiger Spender zu Spender Variation. HINWEIS: Es ist sehr wichtig, dass es keine Vermischung der mit dem Dichtegradienten Blut-Gemisch ist. Die Blutmischung sollte die Dichte Gradientenschicht über und langsam ansteigen, bis das gesamte Blut auf der Oberseite des Dichtegradienten ist. </li><li> Zentrifugieren der geschichteten Mischung bei 700 × g für 30 Minuten ohne Bremsen. Die centrifuged Mischung sollte in fünf Schichten trennen (von oben nach unten): Plasma, Buffy-Coat (mit PBMCs), Dichtegradientenmaterial, Granulozyten und roten Blutkörperchen. </li><li> Zu entfernen und die Mehrheit der Plasma verwerfen und Abrufen sorgfältig die buffy coat (PBMC) Inhalt in eine neue 15-ml-Röhrchen mit einer Pasteurpipette und einen Saugball verwenden. HINWEIS: Die Entfernung der buffy coat-Schicht wird durch Aufbringen Saugwirkung am Pasteur-Pipette effektiv durchgeführt, während eine kreisförmige Bewegung um die Außenseite der Schicht durchgeführt wird, mit der Spitze der Pipette gegen das Rohr. </li></ol></li><li> Waschen Sie die isolierten PBMCs dreimal in pH 7,3 Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), indem bei 350 × g für 10 min (mit voller Bremsen) zwischen Wäschen Zentrifugieren. Die Rekonstitution der PBMC Pellet in komplettem RPMI-Medium. Abhängig von der Größe des Pellets, 3-7 ml Medium ausreichend. </li><li> Zählen Sie die PBMC mit Trypanblau und einer Zählkammer. Nur diejenigen Zellen zählen, die durch die Trypanblau nicht gefärbt sind. Reconstitute die PBMCs bis 1.750.000 Zellen / ml in komplettem RPMI-Medium. </li><li> Seed 400 &amp; mgr; l (700.000 Zellen) in jede Vertiefung einer 8-Kammer-Folie. Inkubieren der Objektträger in einem 37 ° C, vollständig befeuchteten Gewebekultur - Inkubator für 1 h (mit 5% CO 2 ergänzt) werden die Monozyten / Makrophagen anhaften zu ermöglichen. </li></ol> 2. Vorbehandlung von anhaftendem Monozyten HINWEIS: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn der Suche nach Möglichkeiten Phagozytose zu hemmen oder zu verstärken. <ol><li> Vorzubehandeln geklebt Monozyten bei jedem Medikament (en) oder Verbindung (en) von Interesse. Die Rekonstitution der Droge (n) oder andere Testmaterial zu dem RPMI-Medium mit kompletten gewünschte Konzentration. HINWEIS: beispielsweise 200 &amp; mgr; g / ml IVIG wird typischerweise verwendet, um eine 95-100% ige Hemmung der Phagozytose zu erhalten, wenn die menschliche Monozyten verwendet. </li><li> Absaugen und den Überstand verwerfen jegliche nicht-haftenden Zellen aus der 8-Kammer Folie, nach der 1-stündigen Inkubation, die (nach dem Schritt 1.6). Ersetzen Sie es mit 400&amp; mgr; l eines Arzneimittels oder einer anderen Behandlung und Inkubation bei 37 ° C für 1 h. <ol><li> Beim Ansaugen und Lösungen in der 8-Kammer Schieber ersetzen, stellen Sie sicher, den Fluss der Flüssigkeiten zu kontrollieren, so dass schwach anhaftenden Zellen heben nicht ab. Auch die Arbeit mit nur 2-3 leeren Brunnen zu einer Zeit und vermeiden die Brunnen trocknen. HINWEIS: In der Regel jede Behandlung in technischen dreifacher Ausführung durchgeführt wird. </li></ol></li></ol> 3. Opsonisierung von R 2 R 2 Rote Blutzellen HINWEIS: Die R 2 R 2 hier verwendet werden , von der Blutentnahme Center (Canadian Blood Services) erhalten, aber sie sind auch im Handel erhältlich. Opsonisiertem R 2 R 2 RBCs werden als positive Kontrolle für FcyR-vermittelte Phagozytose verwendet. Naïve R 2 R 2 sollte in Alsever Lösung aufbewahrt werden (zur Verlängerung der Haltbarkeit verlängern) bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. Alsever-Lösung im eigenen Haus hergestellt und besteht aus 0,8% W / v Trinatriumcitrat (Dihydrat), 1,9% w / v Dextrose, 0,42% w / v Natriumchlorid und 0,05% w / v Citronensäure (Monohydrat). Wenn R 2 R 2 Zellen nicht vorhanden sind , andere Rh-phänotypisiert Zellen, wie R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 R oder R 2 r, können verwendet werden. <ol><li> Wasch R 2 R 2 (CDE / cDE) roten Blutzellen in PBS insgesamt dreimal bei 350 xg für 5 min unter Verwendung jeder Zentrifugation. HINWEIS: Die Menge der roten Blutkörperchen benötigt wird, hängt von der experimentellen Größe und kann zurückgerechnet werden. Immer waschen eine überschüssige Menge an RBCs, da RBCs bei jeder Wäsche aufgrund der Lyse oder während der Entfernung des Überstandes verloren gehen. Beispielsweise in einem Experiment mit 5 Behandlungen und 2 Kontrollen, die alle in der technischen Triplikaten durchgeführt, gibt es insgesamt 21 Vertiefungen. 21 Vertiefungen mit 400 ul / Vertiefung von 1,25% RBC Gemisch zeigt an, dass 105 &amp; mgr; l gepackte, opsonisiertes RBC benötigt. 200 &amp; mgr; l RBC sollte zunächst gewaschen und 150 &amp; # werden181; L sollte sicherstellen, opsonisiertes werden, dass es eine ausreichende Menge an RBCs für die Phagozytose Schritt. </li><li> Opsonisieren des gewaschenen R 2 R 2 Pellet mit 1: 1 v / v polyklonalen Anti-D - Antikörper aus menschlichem Serum und Inkubation für 1 h bei 37 ° C, mit intermittierendem Mischen. HINWEIS: Wenn polyclonale anti-D-Antikörper nicht vorhanden sind, ist es möglich, monoklonale Anti-D-Antikörper zu verwenden, die im Handel erhältlich sind, oder Anti-D, die normalerweise für Rh Immunprophylaxe verwendet wird, die von Blutbanken oder Transfusion erhalten werden kann, Dienstleistungen. Optimierungstests sollten am Anfang durchgeführt werden, wenn der Test einrichten, und wenn viele un-Titer bestimmt polyklonalen Antikörpern oder Umschalten auf einen monoklonalen Antikörper, umgeschaltet wird. Dies ist die optimale Konzentration oder das Volumen der anti-D für ein Antiglobulin-Test (IAT) Ergebnis zwischen 3+ und 4+ und Phagozytose Ergebnis zwischen 70-90 phagozytierten RBCs pro 100 Monozyten gezählt erforderlich zu identifizieren. </li><li> Waschen Sie die opsonisierend R 2 R 2 insgesamt dreimal in PBS unter Verwendung von Zentrifugation bei 350 xg für 5 min je. HINWEIS: Erfolgreiche Opsonisierung von R 2 R 2 kann durch die Durchführung einer indirekten IAT bestätigt werden. Kurz gesagt, sind sekundäre polyklonalen anti-human-Antikörper hinzugefügt primäre opsonierende Antikörper auf RBC Oberflächen zu binden, und das verstärkte Signal kann in Form von Hämagglutination beobachtet werden. Eine detaillierte Hersteller-Protokoll kann in der ergänzenden Materialien Datei. </li><li> Rekonstituieren des gewaschenen R 2 R 2 Pellet auf 1,25% v / v mit kompletten RPMI Medium. HINWEIS: Überschüssiges opsonisiertem R 2 R 2 kann für bis zu einer Woche in Alseversche Lösung bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol> 4. Fc-Rezeptor-vermittelte Phagozytose <ol><li> Aspirieren das Medikament oder mittlerer Überstand aus dem 8-Kammerobjektträger und füge 400 &amp; mgr; l der 1,25% v / v R 2 R 2 -Gemisch. Inkubieren bei 37 ° C für 2 h. </li><li> Achterner 2 h Inkubation, entfernen Sie die Kammern des Herstellers Adapter verwenden. Dab Überschuss R 2 R 2 auf einem Papiertuch ab. Stellen Sie sicher, dass der Schieber nicht austrocknet. </li><li> Füllen Sie einen 100-ml-Becher mit PBS. Versenken und waschen Sie die Folie langsam den Schlitten zurück zu bewegen und her (um 30-40 Schläge) 2 die Mehrheit der un-phagocytosed R 2 R zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Folie aus der PBS. Abtupfen überschüssige PBS mit einem Papiertuch oder einem Gewebe und der Luft trocknen Sie die Folie. </li><li> Fixieren Sie die luftgetrockneten Objektträger in 100% Methanol für 45 s. Dann Luft trocknen die feste Folie. HINWEIS: Die Objektträger fixiert werden kann andere Methode verwendet , die mehr kompatibel für Downstream - Färbung, wie beispielsweise die Grünwald-Giemsa - Färbung 21 oder der Wright-Giemsa - Färbung 22 ist. </li><li> Montieren Sie die Folie unter Verwendung eines in-house-made Elvanol Eindeckmediums (oder einem anderen handelsüblichen Montagemedium) und fügen Sie Deckgläser. HINWEIS: Elvanol Befestigungsmedium von 15% w / v po bestehtlyvinyl Alkoholharz und 30% v / v Glycerin in PBS. Die Mischung wird erhitzt, bis das gesamte Harz gelöst hat, und das Glycerin homogen vermischt. Dies kann mit anderen handelsüblichen Montagemedium ersetzt werden. </li><li> Lassen Sie die Halterung über Nacht vor der Quantifizierung zu trocknen. </li></ol> 5. Quantifizierung von Phagocytose <ol><li> Unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskop und einem 40X Objektiv, quantifizieren manuell die Menge an phagozytischen Ereignisse von mindestens 200 Monozyten zu zählen und die Anzahl der phagozytierten R 2 R 2 innerhalb dieser Monozyten. Haben einen Zähler in jeder Hand , um gleichzeitig die Anzahl der Monozyten und die Anzahl der phagozytierten R 2 R 2 quantifizieren. </li><li> Besorgen Sie sich die durchschnittliche phagozytische Index durch die Anzahl der Phagozytose von R 2 R 2 durch die Anzahl der Monozyten Dividieren und Multiplizieren mit 100 Express die Daten als Mittelwert (Durchschnitt phagozytische Index) ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM). </li&gt; </ol>

<ol><li>Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+erythrocyte+alloantibodies+by+IgG+subclass+and+monocyte+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction.</a> Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).</li>
<li>Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+of+clinically+significant+erythrocyte+alloantibodies+using+a+human+mononuclear+phagocyte+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay.</a> Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).</li>
<li>Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+determination+of+red+cell+alloantibody+significance+using+an+assay+of+monocyte-macrophage+interaction+with+sensitized+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes.</a> Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).</li>
<li>Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-mediated+erythrocyte+destruction.+A+comparative+study+of+current+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods.</a> Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).</li>
<li>Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfusion+of+antigen+positive+blood+to+alloimmunised+patients+using+a+monocyte+monolayer+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Med%22%5BJournal%5D)">Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay.</a> Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).</li>
<li>Moulds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Transf+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">Introduction to antibodies and complement.</a> Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).</li>
<li>Grandstaff Moulds, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Transf+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody identification.</a> Transf Apher Sci. 40 (3), 195-197 (2009).</li>
<li>Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+alloimmunization+mitigation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Med+Rev%22%5BJournal%5D)">Red blood cell alloimmunization mitigation strategies.</a> Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).</li>
<li>Hamilton, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+and+frequently+encountered+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">Common and frequently encountered antibodies.</a> Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).</li>
<li>Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+papain+on+the+interaction+between+human+monocytes%2C+erythrocytes+and+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG.</a> Blood. 46 (2), 245-252 (1975).</li>
<li>Tong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+the+performance+of+a+monocyte+monolayer+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay.</a> Transfusion. , Epub ahead of print (2016).</li>
<li>Gray, S. J., Sterling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tagging+of+red+cells+and+plasma+proteins+with+radioactive+chromium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium.</a> J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).</li>
<li>Mollison, P. L., Veall, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+isotope+51Cr+as+a+label+for+red+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">The use of the isotope 51Cr as a label for red cells.</a> Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).</li>
<li>Sebring, E. S., Polesky, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fetal+hemorrhage+in+Rh+immune+globulin+candidates.+A+rosetting+technique+using+enzyme-treated+Rh2Rh2+indicator+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes.</a> Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).</li>
<li>Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemiluminescence+assay+for+erythrophagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biolumin+Chemilumin%22%5BJournal%5D)">A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis.</a> J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).</li>
<li>Fabron, A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+noninvasive+phagocytic+cellular+assays+using+autologous+monocytes+to+assess+red+cell+alloantibodies+in+sickle+cell+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients.</a> Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).</li>
<li>Michelis, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hemolysis+after+intravenous+immunoglobulin+amid+host+factors+of+ABO-mismatched+bone+marrow+transplantation%2C+inflammation%2C+and+activated+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes.</a> Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).</li>
<li>Rampersad, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+compounds+that+target+thiol-disulfide+groups+on+mononuclear+phagocytes+inhibit+immune+mediated+phagocytosis+of+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells.</a> Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).</li>
<li>Purohit, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationships+of+pyrazole+derivatives+as+potential+therapeutics+for+immune+thrombocytopenias%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias.</a> Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).</li>
<li>Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+phagocytosis+inhibitors+for+immune+cytopenias%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias.</a> Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).</li>
<li>Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFitzer-Attas%2C+CJ+%22J.+Exp+Med%22">J. Exp Med</a>. 191 (4), 669-682 (2000).</li>
<li>Allhorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IgG-specific+endoglycosidase+EndoS+inhibits+both+cellular+and+complement-mediated+autoimmune+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis.</a> Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+phagocytic+recognition+of+anti-D+opsonized+Rh+D%2B+RBC+by+polymer-mediate+immunocamouflage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage.</a> Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).</li>
<li>Kwan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+efficient+enzymes+for+the+generation+of+universal+blood+through+structure-guided+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution.</a> J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die MMA ist ein mühsames Verfahren, das Know-how sowohl in Gewebekultur und Mikroskopie erfordert. Es gibt mehrere wichtige Schritte, um Erfolg zu gewährleisten: 1) Erzeugung der Monozyten einschichtigen; 2) Opsonisierung der RBCs und 3) manuelle Quantifizierung. Die Monocyten - Monolayer nicht haftet sehr stark an der Kammer Rutsche, so physiologischen pH - Wert muß während des gesamten Assays 11 und eine ausreichende Anzahl von PBMCs beibehalten werden sollte ausgesät werden. Heftiges Pipettieren, die die anhaftenden Zellen stören könnten, sollten vermieden werden. Ein Ansatz ist es, immer entfernen und fügen Lösungen aus der gleichen Ecke der Kammer und um sicherzustellen, dass die Bewegung langsam und stetig ist. In ähnlicher Weise während des letzten Waschschritt das überschüssige RBCs zu entfernen, sollte die Bewegung langsam und stetig sein. Dies sorgt für minimale Störung der einschichtigen, während immer noch die Mehrheit der un-phagocytosed RBCs zu entfernen. Korrektes Waschen zu einem hohen Hintergrund von verunreinigenden roten Blutkörperchen führen, die eine manuelle qua machtntification schwierig. Zweitens müssen die R 2 R 2 RBCs ausreichend einen durchschnittlichen phagozytischen Index von 80-120 für die Phagozytose Steuerung erhalten werden opsonisiert. Diese gewünschte phagozytischen Bereich ein Gleichgewicht zwischen der Leichtigkeit des Zählens auftrifft (beispielsweise Monozyten , die mit mehr als 5 phagozytiert RBCs nur schwer genau zu quantifizieren) , und eine ausreichende Menge an Phagozytose für die statistische Analyse beibehalten wird . Der Grad der Opsonisierung durch einen IAT und ein Wert zwischen 3+ bis 4+ erforderlich bestätigt werden. Die R 2 R 2 RBCs sollte verworfen werden , wenn es überschüssige Lyse während des Waschens, wenn der Überstand dunkel rot wird, oder wenn eine signifikante Abnahme der Phagozytose wird in Experimenten aufgrund der Alterung der Zellen bei der Lagerung beobachtet. Schließlich manuelle Quantifizierung des Mikroskops kann schwierig sein, vor allem, wenn Zählungen zwischen Laborpersonal und zwischen den Experimenten verglichen werden. Durch das gleiche Feld eine Prüfung jeder Vertiefung oder einfach durch mehr Zellen zu zählenKann eine konsistentere Zahl erhalten werden. Side-by-Side-Training mit einem erfahrenen Techniker und die Verwendung eines bestimmten Satz von Trainings Dias wird empfohlen. Eine wichtige Kritik an der MMA ist die Subjektivität des manuellen Quantifizierung Schritt. Doch mit der entsprechenden Ausbildung, Konsistenz über verschiedene Zähler erhalten werden. Eine weitere Einschränkung ist die intrinsische Donor-zu-Donor Unterschiede in phagozytischen Fähigkeiten Monozyten- und in R 2 R 2 - Oberflächenantigen - Expressionsniveaus, die eine Quelle der Datenvariation ist , wenn sie mit menschlichen Proben handelt. Andere alternative Techniken zur Verfügung, für die Prüfung FcyR-vermittelte Phagozytose. Die Mehrheit der kommerziellen Kits verwenden fluoreszierende Ausgangs Phagozytose (zB Biopartikel, pH-empfindlichen Fluoreszenzprotein oder IgG-markierte fluoreszierende Latexkügelchen) zu überwachen. Die Verwendung von fluoreszierenden Ausgang nicht bieten mehr objektive Quantifizierung, aber man muss auch conSider der Verfügbarkeit, Kosten und unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops zugeordnet Ausbildung oder einem Durchflusszytometer, sowie der anschließenden Abhängigkeit von kommerziell erhältlichen Kits. Schließlich kann dieser Test in Abhängigkeit von der Fragestellung angepasst werden. Wenn beispielsweise Arzneimittel Hemmung der Phagozytose testen, können Monozyten entweder vorbehandelt oder co-inkubiert mit den beiden Arzneimitteln und opsonisiertem RBCs (dh ein Kompetitions - Assay). Die stromabwärtige Signalgebung von Antikörpern verschiedener Subtypen, chimäre Antikörper oder rekombinante Konstrukte können auch getestet werden. Mit den jüngsten Durchbrüchen in der Entwicklung eines universellen antigen-null Blut 24 könnte die MMA in anfänglichen Screens dieser antigen-null RBCs mit verschiedenen Antikörpern verwendet werden , um festzustellen , ob es tatsächlich eine abgesenkte Wirksamkeit in Phagozytose auszulösen.

Der Monozyten-Monolayer-Assay (MMA) ist ein In-vitro-Assay, der ursprünglich entwickelt wurde, um Bluttransfusionsergebnisse bei Patienten mit Auto- oder Alloantikörpern gegen rote Blutkörperchen (RBCs)1-5 besser vorherzusagen. Durch die Bewertung der Wirkung von Anti-Erythrozyten-Antikörpern bei der Vermittlung von Fcγ-Rezeptor (FcγR)-vermittelter Phagozytose unter Verwendung dieses In-vitro-Assays ist es möglich, das klinische Ergebnis in vivo vorherzusagen. In der Tat wurde das MMA erfolgreich eingesetzt, um eine Immunzerstörung von antikörpergebundenen Erythrozyten zu vermeiden, trotz der Transfusion von serologisch inkompatiblem Blut5. Das typische Verfahren vor der Transfusion für Kompatibilitätstests, auch Crossmatching genannt, umfasst serologische Methoden, die die Typisierung des Blutes des Patienten auf ABO- und Rh-Antigene und das Screening auf das Vorhandensein von Anti-Erythrozyten-Antikörpern beim Patientenumfassen 6. Es wird Blut selektiert, das auf ABO/Rh abgestimmt ist, und wenn Antikörper vorhanden sind, wird versucht, diese zu identifizieren, damit das Blut für die Transfusion weiter ausgewählt werden kann, um diese Antigene zu vermeiden. Ein ideales Crossmatch-Ergebnis tritt auf, wenn das gesamte Spenderblut serologisch mit dem Blut des Patienten kompatibel ist, was das Risiko einer Hämolyse nach der Transfusion verringert7. Dieses System ist jedoch für die kleine Gruppe von Patientinnen, die nach wiederholter Transfusion oder Schwangerschaft alloimmunisiert wurden, unzureichend. Diese Patienten produzieren Alloantikörper gegen spezifische Erythrozytenantigene. Einige produzieren Antikörper gegen Antigene, die in der Allgemeinbevölkerung sehr häufig vorkommen, und werden daher zunehmend schwieriger zu kreuzen8,9. Erschwerend kommt hinzu, dass nicht alle Alloantikörper klinisch signifikant sind; Mit anderen Worten, die Bindung eines Alloantikörpers an Erythrozyten, die durch einen serologischen Test nachgewiesen werden, führt nicht unbedingt zu einer Hämolyse, wenn antigenpositives, inkompatibles Blut transfundiert wird. Das MMA wurde ursprünglich entwickelt, um die potenzielle klinische Bedeutung von serologisch inverträglichem Blut in einem Transfusionssetting1-5 zu bewerten.
Da bekannt ist, dass die extravaskuläre Hämolyse von Antikörper-gebundenen Erythrozyten durch das mononukleäre Phagozytensystem vermittelt wird, werden primäre Monozyten/Makrophagen bei der Entwicklung von diagnostischen Assays verwendet. Der erste Assay zur Untersuchung der Interaktion von Monozyten, Erythrozyten und Antikörpern wurde 1975 veröffentlicht, aber die verwendeten suboptimalen Bedingungen führten nur zur Rosettenbildung (der Bindung von Erythrozyten an die Peripherie des Monozyten), und es wurde keine Phagozytose beobachtet10. Signifikante Modifikationen am Assay wurden von mehreren Gruppen vorgenommen, was zu einem Assay führte, bei dem der Grad der Phagozytose von Alloantikörper-gebundenen Erythrozyten mit dem klinischen Ergebnis der Hämolyse1-5 korreliert werden konnte. Kürzlich wurden die optimalen Lagerbedingungen klinischer Proben und die weitere Optimierung der Assay-Bedingungen untersucht, um den Nutzen eines klinischen MMA-Crossmatches mit autologen Patientenproben zu erhöhen11.
Drei weitere diagnostische Techniken wurden neben dem MMA zur Vorhersage von Transfusionsergebnissen eingesetzt: der 51Cr Freisetzungstest, der Rosettentest und der Chemilumineszenztest (CLT). Im 51-Cr-Freisetzungstest werden dem Patienten 51Cr-markierte Spender-Erythrozyten injiziert, und die Halbwertszeit der markierten Erythrozyten wird überwacht und ist prädiktiv für das Überleben oder die Clearance nach der Transfusion12,13. Da bei dieser Methode radioaktive Materialien verwendet werden, wird sie nur noch selten durchgeführt. Der Rosettentest umfasst das Mischen und Inkubieren von Monozyten mit Erythrozyten und die Quantifizierung des Grades der Rosettenbildung (ohne Phagozytose)14. Die klinische Bedeutung von Antikörpern in vivo beinhaltet die aktive Phagozytose durch Makrophagen, die in der Milz und/oder der Leber vorkommen; Daher liefert diese Methode keine relevante Auslesung der Phagozytose. Das CLT verwendet Luminol, um den oxidativen Ausbruch während der Monozyten-Phagozytose von Erythrozyten zu überwachen, da Luminol blau fluoresziert, wenn es im Phagosomoxidiert wird 15. Diese Methode ist gut, aber eine Kontamination durch Neutrophile kann die Auslesung verwirren. Parallele Vergleiche wurden durchgeführt, um die Sensitivität, Praktikabilität und Reproduzierbarkeit der vier verfügbaren Methoden zu bewerten, und sowohl die CLT als auch die MMA wurden als überlegeneingestuft 16. Das CLT wurde jedoch hauptsächlich zur Beurteilung der hämolytischen Erkrankung des Fötus und des Neugeborenen (HDFN) eingesetzt, und der optimale pH-Wert des Assays von 8,0 könnte das Niveau der Phagozytose beeinträchtigen11.
Zusätzlich zu seinem diagnostischen und klinischen Nutzen wurde das MMA für andere Forschungszwecke modifiziert. In der Tat kann das MMA nicht nur als funktioneller Assay dienen, um Diskrepanzen zwischen Serologie und Biologie zu beheben, sondern wurde auch verwendet, um retrospektiv die Ursache der Hämolyse nach intravenöser Immunglobulin-Therapie (IVIG) zu untersuchen17. Es wurde auch verwendet, um die Struktur-Funktion chemischer Inhibitoren der FcγR-vermittelten Phagozytose18-20 zu untersuchen und die nachgeschaltete Signalübertragung der FcγR-vermittelten Phagozytosezu untersuchen 21. In unserem Labor entwickeln wir neben der Verwendung eines humanen MMA auch ein murines MMA unter Verwendung primärer mononukleärer Zellen (PBMCs) des peripheren Blutes (PBMCs) der Maus und autologen Erythrozyten. Der Grundgedanke besteht darin, Antikörper zu screenen, die eine FcγR-vermittelte Phagozytose als Zwischenprodukt für die Entwicklung eines in vivo Mausmodells für autoimmune hämolytische Anämie (AIHA) induzieren können (unveröffentlichte Daten). Die verschiedenen Modifikationen konzentrieren sich auf unterschiedliche Aspekte der IgG-Antikörper- und FcγR-Interaktion, die die Phagozytose induzieren.

<table><tbody><tr><td>Säurecitrat-Dextrose (ACD)-Vacutainer</td><td>BD</td><td>REF364606</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Multicell</td><td>080150</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-64</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-03</td><td>https://www.gelifesciences.com/</td></tr> <tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>8-Kammer-Objektträger</td><td>Lab-Tek-ll</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>R2R2 (cDE/cDE) rote Blutkörperchen</td><td>Kanadische Blutspendedienste</td><td></td><td>Kommerziell erhältliches (z. B. , http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)</td></tr><tr><td>Polyklonales Anti-D aus Humanserum</td><td>Gamma Biologics</td><td>DIN 02247724</td><td>Kann durch handelsübliches monoklonales Anti-D oder durch Rh-Immunglobulin ersetzt werden</td></tr><tr><td>100 % Methanol</td><td>Caledon</td><td>6700-1-42</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylalkoholharz</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td>Kann durch handelsübliche Halterung ersetzt werden</td></tr><tr><td>Ultrareines Glycerin</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Novaclone Anti-IgG</td><td>Immucorgamma</td><td>5461023</td><td>Optional für IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)</td></tr></tbody></table>

die verwendung eines monozyten einschichtiges assay fcy rezeptorvermittelte phagozytose zur bewertung

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Obwohl ursprünglich für die Vorhersage von Transfusionsergebnissen von serologisch inkompatiblem Blut entwickelt, ist der Monozyten-Monolayer-Assay (MMA) ein äußerst vielseitiger In-vitro-Assay, der modifiziert werden kann, um verschiedene Aspekte der Antikörper- und Fcγ-Rezeptor (FcγR)-vermittelten Phagozytose sowohl in der Forschung als auch im klinischen Umfeld zu untersuchen. Der Assay verwendet adhärente Monozyten aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes, die aus Vollblut von Säugetieren isoliert wurden. MMA wurde sowohl für den Einsatz bei Untersuchungen am Menschen als auch bei Mäusen beschrieben. Diese Monozyten exprimieren FcγRs (z. B. FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB und FcγRIIIA), die an Immunantworten beteiligt sind. Das MMA nutzt den Mechanismus der FcγR-vermittelten Interaktionen, insbesondere der Phagozytose, bei der Antikörper-sensibilisierte rote Blutkörperchen (RBCs) an FcγRs anhaften und/oder diese aktivieren und anschließend von den Monozyten phagozytiert werden. In vivo führen vor allem Gewebemakrophagen, die in Milz und Leber vorkommen, eine FcγR-vermittelte Phagozytose von Antikörper-opsonisierten Erythrozyten durch, was zu einer extravaskulären Hämolyse führt. Durch die Evaluierung des Grades der Phagozytose mit Hilfe des MMA können verschiedene Aspekte des in vivo FcγR-vermittelten Prozesses untersucht werden. Zu den Anwendungen der MMA gehören die Vorhersage der klinischen Relevanz von Allo- oder Autoantikörpern in einer Transfusionsumgebung, die Bewertung von Arzneimittelkandidaten, die die Phagozytose fördern oder hemmen, und die Kombination des Assays mit Fluoreszenzmikroskopie oder traditionellem Western Immunblotting, um die nachgeschalteten Signalwirkungen von FcγR-bindenden Medikamenten oder Antikörpern zu untersuchen. Zu den Einschränkungen gehören die Mühabilität dieser Technik, die von Anfang bis Ende einen ganzen Tag in Anspruch nimmt, und die Anforderung einer forschungsethischen Genehmigung, um mit Säugetierblut arbeiten zu können. Mit Sorgfalt und angemessener Schulung können die MMA-Ergebnisse jedoch innerhalb einer 24-Stunden-Umsatzzeit erzielt werden.

Durch Befolgen der entscheidenden Schritte in Figur 1 und dem oben beschriebenen Verfahren kann das MMA reproduzierbar durchgeführt werden. IVIG wurde als Beispiel für die Hemmung der Phagozytose in Figur 2 verwendet. IVIG ist bekannt, die Fc-Rezeptoren zu binden und blockieren, wodurch das Downstream-Ergebnis der Phagozytose hemmen. Durch Titration der Menge von IVIG verwendet, eine dosisabhängige Hemmung beobachtet wird , in welchen Konzentrationen oberhalb von 200 pg / ml in der Nähe führte zu 100% ige Hemmung und Konzentrationen von weniger als 0,5 g / ml hemmte nicht (2A). Wenn die phagozytischen Indizes werden transformiert und normiert auf die R 2 R 2 positive Kontrolle als 0% Hemmung, eine Hemmkurve mit einem IC 50 von 3 &amp; mgr; g / mL (2B) bestimmt werden kann. Zusätzlich zu den Assays konsequent durchführen, quantification des Assays kann manchmal schwierig sein. Figur 3 ist eine Sammlung von Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von verschiedenen MMA Dias. Mit Mikroskopie Erfahrung kann man ein Monozyt aus einer kontaminierenden RBC (3D) oder ein von einer Vakuole phagozytierten RBC (3B) unterscheiden. Dichtes Cluster von Zellen und / oder Ablagerungen sollten während Quantifizierung (Figuren 3E und F) vermieden werden. Auch sollte man vermeiden , über opsonisierenden die R 2 R 2 RBC, die zu einem erhöhten Phagozytose führen würde, die die Monozyten Interieur und stört die genaue Quantifizierung (3C) overcrowds. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des MMA. Ein Schritt-für-Schritt-Darstellung der entscheidenden Schritte bei der MMA: PBMC aus Vollblut zu isolieren, um das anhaftende monocyt Einspeisenes mit opsonisiertem R 2 R 2, und die Kammer gleitet waschen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die intravenöse IgG (IVIG) hemmt Phagozytose in vitro die MMA mit. IVIG ist bekannt Phagozytose zu hemmen und als Inhibitionskontrolle im menschlichen MMA verwendet. (A) Titration von IVIG führte zu einer dosisabhängigen Hemmung der Phagozytose verglichen , wenn mit dem unbehandelten R 2 R 2 Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) von n = 3 Experimenten. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des Student t - Test durchgeführt: ** p ≤ 0,01 und *** p ≤ 0,001. (B) Hemmung Kurve von IVIG mit einem IC 50 of 3 &amp; mgr; g / ml (gepunktete Linie). Die Ergebnisse zeigen , Daten normalisiert zu unbehandelten R 2 R 2 (0% Hemmung); Mittelwert ± SEM von n = 3 Experimenten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> Abbildung 3. Phasenkontrast - Mikroskopie - Aufnahmen von Musterfolien unter Vergrößerung 40X. (A) Die perfekte Folie in dem die Monozyten phagozytiert 1-2 R 2 R 2 im Durchschnitt (schwarze Pfeile mit einem unverwechselbaren Halo leuchten), mit sehr wenigen verunreinigenden, un phagozytierte R 2 R 2 in den Hintergrund (weiße Pfeile). (B) Wie in dieser Folie gezeigt, manchmal Monozyten haben vergrößert Vakuolen (weiße Pfeile), die für phagozytierten R 2 R 2 verwechselt werden können. (C &lt;/ strong&gt;) Wenn R 2 R 2 haben over-opsonisiertes, mehr als 4-5 phagozytiert R 2 R 2 pro Monozyt (schwarze Pfeile) rendern genaues Zählen schwierig, da 2 der R 2 R innerhalb der Monozyten- und verschiedene Zell gedrängt werden Grenzen können nicht unterschieden werden. (D) Eine unzureichende Waschen des Schiebers führt zu reichlich R 2 R 2 Verunreinigung (weiße Pfeile), die eingehalten RBCs verwechselt werden könnte. (E) Manchmal, Monozyten und kontaminierenden RBCs können Cluster bilden. Cluster zeigen auch bakterielle Kontamination, die vermieden werden sollten. (F) Monocyten können größere Aggregate bilden, die während der Quantifizierung sollte vermieden werden. Mit zufällige Auswahl der Felder anzuzeigen, ist Feld A, was in der Regel, wenn der MMA beobachtet wird ordnungsgemäß durchgeführt wurde. Maßstabsbalken ist 20 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier</a>eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Der Monozyten-Monolayer-Assay (MMA) ist ein In-vitro-Assay, der isolierte primäre Monozyten aus dem peripheren Vollblut von Säugetieren verwendet, um die Fcγ-Rezeptor (FcγR)-vermittelte Phagozytose zu bewerten.

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Das übergeordnete Ziel dieses in vitro funktionellen Assays ist es, verschiedene Aspekte der FC-vermittelten Phagozytose zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen in der Immunhämatologie und Bluttransfusionsmedizin zu beantworten, z. B. welche klinische Bedeutung Auto- und Allo-Antikörper für rote Blutkörperchen haben. Diese Technik bietet einen funktionellen biologischen Assay, der in vitro durchgeführt werden kann, um das Ergebnis von Transfusionen bei Patienten mit vorgeformten Antikörpern gegen rote Blutkörperchen vorherzusagen.Das Verfahren wird von Cindy Tong, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Vergessen Sie nun nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blut gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzkitteln und Handschuhen getroffen werden sollten. Nach der Entnahme von ein bis zwei 10-Milliliter-Vollblutproben von einem gesunden Spender in Vacutainer-Röhrchen, die saure Citrat-Dextrose enthalten, durch Venenpunktion werden die Röhrchen in eine Biosicherheitswerkbank der Klasse II gegeben und das Blut im Verhältnis eins zu eins in warmem, vollständigem Medium verdünnt.Pipettieren Sie anschließend die Blutzellen langsam an den Seiten eines Zentrifugenröhrchens entlang auf den Dichtegradienten bei Raumtemperatur und achten Sie darauf, die Schichten nicht zu vermischen. Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie dann die oberste Plasmaschicht und verwenden Sie eine Pasteurpipette aus Glas, um den PBMC-haltigen Buffy Coat in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.Waschen Sie die isolierten PBMCs dreimal in PBS und resuspendieren Sie die Zellen nach der dritten Zentrifugation in drei bis sieben Millilitern Medium. Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellen auf 1,75 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter Konzentration in vollständigem Medium und säen Sie 400 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung eines Achtkammer-Objektträgers für eine einstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 bei voller Luftfeuchtigkeit. Um die roten Blutkörperchen von R2R2 zu opsonisieren, waschen Sie die roten Blutkörperchen zunächst dreimal in PBS.Verdünnen Sie das R2R2-Pellet nach der dritten Zentrifugation im Eins-zu-Eins-Verhältnis mit polyklonalen Anti-D-Antikörpern aus Humanserum für eine einstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius mit intermittierendem Mischen. Am Ende der Opsonisierung nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und waschen sie dann noch dreimal in PBS, wie gerade gezeigt. Resuspendieren Sie das Pellet auf eine Lautstärke von 1,25 % in vollständigem RPMI-Medium.Ersetzen Sie anschließend den Überstand aus jeder Vertiefung des Achtkammer-Objektträgers für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius durch 400 Mikroliter der opsonisierten R2R2-Zellen. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die Kammern mit den Gleitadaptern und tupfen Sie das überschüssige R2R2 mit einem Papiertuch ab. Füllen Sie nun ein 100-Milliliter-Becherglas mit PBS und tauchen Sie jeden Objektträger langsam 30 bis 40 Mal in die Salzlösung, um den Großteil des nicht phagozytierten R2R2 zu entfernen.Nach dem Trocknen die Objektträger 45 Sekunden lang in 100%igem Methanol fixieren und die Zellen trocknen lassen, bevor die Proben mit Deckgläsern montiert werden. Laden Sie am nächsten Tag jeden Objektträger auf ein Phasenkontrastmikroskop mit einer 40-fachen Objektivlinse und zählen Sie manuell mindestens 200 Monozyten und die Anzahl der phagozytierten R2R2 in jedem Monozyten mit einem Zähler in jeder Hand, um gleichzeitig die Anzahl der Monozyten und die Anzahl der phagozytierten R2R2-Zellen pro Probe zu quantifizieren. Intravenöses Immunglobulin bindet und blockiert dosisabhängig an FC-Rezeptoren, die die Phagozytose hemmen, wobei eine nahezu 100%ige Hemmung ab 200 Mikrogramm des intravenösen Immunglobulins pro Milliliter beobachtet wird und bei Konzentrationen unter 0,5 Mikrogramm des Inhibitors fast keine Hemmung beobachtet wird.Wenn die phagozytischen Indizes auf die R2R2-Positivkontrolle als 0%-Hemmung normiert werden, kann eine Hemmkurve mit einem IC 50 von drei Mikrogramm pro Milliliter bestimmt werden. Mit viel Erfahrung kann die Phasenkontrastmikroskopie eingesetzt werden, um Monozyten von kontaminierten roten Blutkörperchen und Vakuolen von phagozytierten roten Blutkörperchen zu unterscheiden. Dichte Zellverbände und Trümmer sollten bei der Quantifizierung vermieden werden, ebenso wie eine Überopsonisierung der roten Blutkörperchen R2R2, die zu einer erhöhten Phagozytose führen kann, die das Monozyteninnere überfüllt und eine genaue phagozytische Analyse beeinträchtigt.Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs bis acht Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Immunzytochemie oder Immunfluoreszenz mittels konfokaler Mikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur phagozytären Proteinexpression, zur Wechselwirkung mit roten Blutkörperchen und zur Kompartimentierung zu beantworten. Mit ihrer anfänglichen Entwicklung und weiteren Optimierung wird diese Technik die Art und Weise beeinflussen, wie Forscher in den Bereichen Transfusionsmedizin und Zellbiologie Opsonisationssysteme erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Monozyten-Monolayer-Assay durchführen, um die Arten von Antikörperinteraktionen zu beurteilen, die eine Phagozytose hervorrufen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir präsentieren Ihnen eine High-Throughput-durchflusszytometrischen Assays auf die Phagozytoseaktivität von Antigen-spezifischen Antikörpern aus klinischen Proben zu bestimmen, unter Verwendung fluoreszierender Antigen-beschichteten Beads und einer monozytären Zelllinie mehrere Fc-Rezeptoren zur Bereitstellung von Rezeptor-Nutzung und Phagozytoseaktivität Bestimmungen in einer standardisierten und reproduzierbare Weise für jedes Antigen von Interesse.

Die Bestimmung der Phagozytoseaktivität of Clinical Antikörper Proben

Quelle: Nagre, N., et al. Phagozytose und Bakterienbeseitigung der Alveolaren Makrophagen bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video zeigt die Bewertung der komplementrezeptorvermittelten Phagozytose mit roten Blutkörperchen von Schafen, die mit IgM und Komplement opsonisiert sind, gefolgt von deren Aufnahme durch Mausmakrophagen. Das Ausmaß der Phagozytose wird quantifiziert, indem ein blaues chromogenes Produkt gemessen wird, das durch hämoglobinkatalysierte Oxidation von Diaminofluoren...

Modellierung komplement-vermittelter Phagozytose unter Verwendung von opsonisierten roten Blutkörperchen in vitro

Dieses Video zeigt einen auf Durchflusszytometrie basierenden Phagozytose-Assay mit markierten und opsonisierten Plasmodium falciparum-infizierten Erythrozyten durch Monozyten. Die Durchflusszytometrie identifiziert die Fluoreszenz in Monozyten und bestätigt damit die erfolgreiche Identifizierung opsonisierter Erythrozyten durch Phagozytose.

Ein Assay zur Quantifizierung der Antikörper-vermittelten Phagozytose von parasiteninfizierten Erythrozyten

Dieses Video zeigt einen Monozyten-Monolayer-Assay, der primäre Monozyten aus peripherem Blut verwendet, um die Fcγ-Rezeptor-vermittelte Phagozytose mit Poly-D-Antikörper-opsonisierten R2R2 roten Blutkörperchen zu bewerten.

Ein Assay zur Untersuchung der fcγ-Rezeptor-getriebenen Phagozytose in Monozyten-Monoschichten

Dieses Video zeigt einen in vitro Assay zur Untersuchung des immunmodulatorischen Einflusses von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) auf die Proliferation von Effektor-T-Zellen. Der Assay umfasst die Co-Kultivierung von MSCs mit PBMCs, um die Monozytenpopulation dazu zu bringen, einen immunmodulatorischen Phänotyp zu erwerben, der zur Sekretion von Interleukin-10 (IL-10) führt. Nach der Inkubation mit aktivierten CD4+ T-Zellen unterdrücken die induzierten Monozyten effektiv die T-Zellproliferation.

Ein In-vitro-Assay zur Bewertung des immunmodulatorischen Einflusses von Monozyten auf die Leukozytenproliferation

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung der Antikörper-abhängigen zellulären Phagozytose (ADCP) durch Muttermilchphagozyten. Fluoreszenzmarkierte Mikrosphären, die an einen Antigen-Antikörper-Komplex konjugiert sind, werden mit einer aus der Muttermilch isolierten Zellsuspension kombiniert, um eine Antikörper-abhängige zelluläre Phagozytose durch die phagozytischen Leukozyten zu induzieren. Nach der Markierung der Zellen mit Antikörpern gegen das gemeinsame Leukozytenantigen (CD45) wird die...

Ein In-vitro-Assay zur Messung der Antikörper-abhängigen zellulären Phagozytose durch Phagozyten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Phagozytose von fluoreszierenden Partikeln durch adhärente Makrophagenzelllinien mit einer fluorometrischen Methode. Diese Methode ermöglicht eine Hochdurchsatz-Quantifizierung der Partikelinternalisierung sowie der daraus resultierenden Aktinpolymerisation.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

Der Zweck dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Messung der Phagozytose von Monozyten und Granulozyten und der oxidativen Burst-Aktivität in menschlichen Blutproben vorzustellen.

Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut

Hier beschreiben wir Methoden mit Spinning Disk konfokalen Mikroskopie zu Bild phagocytic Einzelveranstaltungen durch Maus resident peritonealen Makrophagen. Die Protokolle können auf andere phagocytic Zellen ausgedehnt werden.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Dieses Protokoll umfasst eine Reihe von funktionellen Neutrophilen-Assays, die als Screening-Methode verwendet werden, um Funktionen aus verschiedenen Signalwegen abzudecken. Das Protokoll beinhaltet eine erste und einfache Bewertung der Zelllebensfähigkeit, Reinheit, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, Echtzeitmigration, Phagozytose und einen vorläufigen Vorschlag für neutrophile extrazelluläre Fallen.

Eine Reihe von Screening-Techniken für einen schnellen Überblick über die Funktion der Neutrophilen

Wir haben Verbesserungen und aktualisierte Methoden für den bestehenden Monozyten-Monolayer-Assay (MMA) entwickelt, bei dem Makrophagen verwendet werden, um die klinische Relevanz von Erythrozyten-Alloantikörpern in der Transfusionsmedizin und Immunologie besser vorhersagen zu können. Dieser Assay wird als Monozyten-Makrophagen-Assay (M-MA) bezeichnet.

Vorhersage der Bedeutung von Antikörpern roter Blutkörperchen mit dem Monozyten-Makrophagen-Assay

Lernen Sie den Monozyten-Einschicht-Assay zur Bewertung Fc-Rezeptor-vermittelter Phagozytose in der Transfusionsmedizin. Diese Methode nutzt isolierte primäre Monozyten aus menschlichem Blut.

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

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